一種禾谷類作物單倍體群體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種禾谷類作物單倍體植株快繁的方法及用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 單倍體技術(shù)是現(xiàn)代育種中一種非常重要的技術(shù)手段，它通過(guò)花藥/小孢子培養(yǎng)可 以獲得單倍體植株，但是由于單倍體植株的不育性，這些植株不能長(zhǎng)期存活，通常是通過(guò)染 色體加倍成二倍體植株加以利用。單倍體植株由于本身只具備一套染色體，在誘變、轉(zhuǎn)化、 細(xì)胞雜交等遺傳改良研究上具有特殊優(yōu)勢(shì)：?jiǎn)伪扼w材料對(duì)外界刺激敏感，易于產(chǎn)生突變； 外源基因易于插入；單倍體水平上的突變或轉(zhuǎn)基因經(jīng)染色體加倍后可以獲得目標(biāo)基因以 等位純合狀態(tài)穩(wěn)定遺傳的加倍單倍體植株，隱性基因控制的性狀也可以得到表現(xiàn)；單倍體 (N)細(xì)胞融合雜交，易于獲得的雜交再生植株（2N)。
[0003] 對(duì)已獲得的單倍體植株進(jìn)行離體擴(kuò)繁，快速構(gòu)建單倍體群體是對(duì)單倍體資源進(jìn) 行種質(zhì)保存，開展有效利用的一個(gè)材料來(lái)源基礎(chǔ)。目前利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)單倍體植 株進(jìn)行離體繁殖，已在一些雙子葉植物中取得成功，如利用油菜單倍體植株的節(jié)間莖段 誘導(dǎo)不定芽再生植株（劉成洪，王亦菲，孫月芳，等.甘藍(lán)型油菜單倍體植株群體的 構(gòu)建[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006, 21 (4):23-25.),利用青花菜單倍體莖尖誘導(dǎo)再生植株 (陸瑞菊，王亦菲，孫月芳，等.利用青花菜單倍體莖尖篩選耐熱變異體[J].核農(nóng)學(xué) 報(bào)，2006, 20 (5) : 388-391.)，利用亞麻的單倍體葉片誘導(dǎo)再生植株等（康慶華，徐涵，吳廣 文，等.利用亞麻多胚性狀建立單倍體群體并實(shí)現(xiàn)離體擴(kuò)繁[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007， 15 (增刊）：249-252)，在單子葉植物玉米中通過(guò)胚芽鞘節(jié)誘導(dǎo)愈傷組織分化形成了再生植 株（杜何為，劉志鵬，嚴(yán)建兵，等.玉米單倍體胚芽鞘節(jié)組織培養(yǎng)特性研究[J].中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2010, 43 (15) : 3098-3105)。但對(duì)于禾谷類作物如大麥、小麥、水稻等，還未見(jiàn)在單倍 體植株的基礎(chǔ)上建立系統(tǒng)有效的離體繁殖體系，也未見(jiàn)利用從單倍體植株分蘗節(jié)直接誘導(dǎo) 叢生芽的報(bào)道。
[0004] 因此，本領(lǐng)域仍需要一種禾谷類作物單倍體植株快繁的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種禾谷類作物單倍體植株系統(tǒng)有效的離體繁殖方法，通 過(guò)利用禾谷類作物的分蘗芐基部分生組織，采用適宜的激素和添加物直接獲得叢生芽，壯 苗和誘導(dǎo)生根，建立倍性穩(wěn)定、生長(zhǎng)迅速的單倍體離體繁殖群體。
[0006] 本發(fā)明方法可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：通過(guò)游離小孢子（花藥）培養(yǎng)技術(shù)，獲得來(lái)源于 小孢子的再生植株，經(jīng)倍性鑒定獲得單倍體植株，單倍體植株利用培養(yǎng)基或水培形成多個(gè) 分蘗的植株，剝?nèi)》痔Y芐基部，使用適宜的激素和其他添加物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從分蘗芐基部 分生組織直接誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽進(jìn)一步增殖、壯苗和生根，獲得完整的再生植株，經(jīng)倍性 鑒定獲得單倍性遺傳穩(wěn)定的單倍體群體。
[0007] 本發(fā)明建立的方法，可以用于禾谷類作物單倍體種質(zhì)的保存，單倍體誘變，單倍體 的遺傳轉(zhuǎn)化，細(xì)胞融合雜交，以及單倍體發(fā)育遺傳機(jī)制的研究，本發(fā)明的用途包含但不僅限 于上述應(yīng)用。
[0008] 因此，本發(fā)明提供一種禾谷類作物單倍體植株的離體繁殖方法，所述方法包括： 使用禾谷類作物的分蘗芐基部分生組織產(chǎn)生叢生芽；和繁育叢生芽，獲得單倍性遺傳穩(wěn)定 的單倍體植株。
[0009] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述分蘗芐基部獲自來(lái)源于小孢子的單倍體植株。
[0010] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，用0. 2-0. 5M的甘露醇提取液收集禾谷類作物的小孢子。
[0011] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將提取獲得的游離小孢子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培 養(yǎng)。
[0012] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所不同的是含有0_2500mg/ L 的 KNO3 和 0-400mg/L 的（NH4) SO4，并添加有 400-2500mg/L 的水解干酪素和 400-2500mg/ L的谷氨酰胺。
[0013] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將誘導(dǎo)培養(yǎng)所得愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。
[0014] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，分化培養(yǎng)基以2/3MS為基本培養(yǎng)基，其中加有 6-BA0. 3-1. 2mg/L、KT 0· 5-2. Omg/L、NAA 0· 01-0. lmg/L、麥芽糖 10-50g/L 以及肌醇 95-105mg/L，pH 為 5. 5-6. 2。
[0015] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，在25土1°C，每天10~12小時(shí)光照的條件下分化脅迫培養(yǎng) 25~30天，直至分化出綠色再生植株。
[0016] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將分化出的再生植株轉(zhuǎn)入添加有ΝΑΑ0. 02-0. 08mg/L、多效 唑（MET) 2. 0-10.0 mg/L 和蔗糖 10-40g/L，pH5. 6-6. 0 的 1/2MS 生根壯苗培養(yǎng)基，在 25 土 1°C， 每天10~12小時(shí)光照的條件下進(jìn)行25~30天的生根壯苗培養(yǎng)。
[0017] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將所獲得的單倍體植株放置溫室中漂浮培養(yǎng)1-2天，進(jìn)行 煉苗。
[0018] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，溫室溫度為白天20-25°C，晚上16-20°C，10-16小時(shí)光照。
[0019] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，煉苗結(jié)束后，將所得植株轉(zhuǎn)移到l/2Hoagland溶液中培養(yǎng)， 每3-4天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約1個(gè)月，形成多個(gè)分蘗。
[0020] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，獲取再生植株分蘗節(jié)部位Icm左右，接種到含0. 3-0. 8mg/L TDZ的1/2MS的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-26°C，優(yōu)選23土 1°C，光周 期約8_14h · d \優(yōu)選約IOh · d \
[0021] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將所述再生植株分蘗節(jié)部位接種到含有0. 5mg/LTDZ的 1/2MS叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
[0022] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將由分蘗芐基部長(zhǎng)出的新芽轉(zhuǎn)移到叢生芽增殖培養(yǎng)基上。
[0023] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，叢生芽增殖培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基配制，除含有1/2MS培養(yǎng) 基的成分外，還添加有300-500mg/L水解干酪素（CH)、10-30mg/L亞精胺（Spd)、0· 6-1. 2mg/ L TDZ (噻二唑苯基脲）和0· 8-1. 2mg/L多效唑（MET)。
[0024] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，叢生芽增殖培養(yǎng)基中，CH為400mg/L，Spd為20mg/L，TDZ為 1.0 mg/L，MET 為 1.0 mg/L。
[0025] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，將叢生芽增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的叢生芽轉(zhuǎn)移到1/2MS培 養(yǎng)基培養(yǎng)，以降低植株的內(nèi)源激素，然后轉(zhuǎn)到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成完整再生植 株。
[0026] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，叢生芽在1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)中培養(yǎng)約3 - 6周，優(yōu)選4周左 右。
[0027] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基配制，除含有1/2MS培養(yǎng)基 的成分外，還添加 NAA 0· 03-0. 08mg/L 和 MET 0· 8-1. 2mg/L。
[0028] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，萘乙酸為0. 05mg/L，多效唑（MET) 為 1.0 mg/L。
[0029] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括：
[0030] (1)由禾谷類作物小孢子獲得單倍體植株；
[0031] (2)培養(yǎng)步驟（1)獲得的單倍體植株，使其形成分蘗；
[0032] (3)由步驟（2)所得分蘗芐基部誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽；以及
[0033] (4)繁育所述叢生芽，獲得單倍體再生群體。
[0034] 本發(fā)明還包括用于上述各步驟的培養(yǎng)基及其任意組合，以及含有所述培養(yǎng)基及其 任意組合的試劑盒。
[0035] 本發(fā)明的試劑盒還包括指導(dǎo)如何使用所述培養(yǎng)基的說(shuō)明書。
[0036] 本發(fā)明還包括采用本發(fā)明方法獲得的禾谷類作物的單倍體群體。
[0037] 本發(fā)明利用分蘗芐基部的分生組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，可以避免中間愈傷組織生長(zhǎng) 環(huán)節(jié)形成的無(wú)性變異，最大程度保持其原有遺傳基礎(chǔ)，使單倍體植株的擴(kuò)繁群體保持單倍 體的穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明利用游離小孢子（花藥）培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體植株，對(duì)單倍體植株培養(yǎng)使 其形成多個(gè)分蘗，然后利用分蘗芐基部分生組織直接誘導(dǎo)叢生芽（這不同于其他報(bào)道單倍 體誘導(dǎo)再生方式），進(jìn)行增殖、壯苗、生根獲得單倍體再生群體。還可對(duì)群體的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng) 價(jià)。因此，本發(fā)明的方法具有系統(tǒng)性。
[0039] 具體而言，本發(fā)明提供一種禾谷類作物單倍體植株的離體繁殖方法，所述方法包 括使用誘導(dǎo)培養(yǎng)禾谷類作物的分蘗芐基部分生組織，產(chǎn)生叢生芽；和繁育叢生芽，獲得單倍 性遺傳穩(wěn)定的單倍體植株。
[0040] 1、由禾谷類作物游離小孢子獲得單倍體植株
[0041] 禾谷類作物的單倍體植株可通過(guò)花藥或游離小孢子培養(yǎng)獲得。由禾谷類作物小孢 子獲得再生植株的方法可參見(jiàn)，例如陸瑞菊，《大麥游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化及單倍體耐 鹽、耐低氮脅迫篩選體系的建立》，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)2012博士論文。
[0042] 具體而言，通常，可從大田或溫室選取禾谷類作物中部小花，其小孢子發(fā)育處于單 核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10-30天，通常是15-25天，例如15天左右。冷藏的溫 度可以在〇-8°C范圍之間，例如可以為3-8°C。通?？稍诩s5°C冷藏。
[0043] 穗子先消毒，例如用飽和的漂白粉溶液消毒10_20min，無(wú)菌水沖洗2-4次。每個(gè) 離心管中接入10個(gè)穗子的花藥，倒入15-20ml 0. 2-0. 5M的甘露醇提取液，用高速分散器超 速（例如3000-4000rpm)旋切，150目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液低速（例如800-1000rpm)離心，重復(fù) 2-3次，收集小孢子。
[0044] 提取獲得的游離小孢子可置于本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)前可先 用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌小孢子1到2次，然后用培養(yǎng)基將小孢子密度調(diào)節(jié)至I. 0~I. 2 X IO5 個(gè)/ml，取大約I. 5-3ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿（30