的波動對于及時收獲生物量以最大化香芹酚和麝香草酚產量是必要的。第一年主 要關注在田間建立這些克隆系。在第一年生長期間，香芹酚和麝香草酚的積累并不是最大。
[0061]在2012年的第二年生長期間，從4月至9月的整個生長季節(jié)監(jiān)測這些品系中的香芹 酚和麝香草酚含量。在整個生長季節(jié)，克隆系KI-0vl750持續(xù)積累最高水平的香芹酚。其它 克隆系(KI-〇vl791、KI-〇vl843、KI-〇vl721和KI-〇vl835)也顯示相對于所測試的其余克隆 系的更高水平的香芹酚(>5%)。在所種植的三個Hi-T品系中，ΚΙ-〇ν1855在冬季沒能存活， 而ΚΙ-0ν1850在第2年顯示最高的麝香草酚積累。沒有將第1年的數(shù)據(jù)與第2年相關聯(lián)，由于 第1年主要考慮為建立年?？寺∠郸?0ν1750具有最高香芹酚含量，在6月收獲時基于干物質 多達7%，且在9月收獲時6.7%?？寺∠礙I-0vl850具有最高麝香草酚含量，在6月收獲時基 于干物質多達5.2%。之后在夏季缺少第二個峰可能是由于在2012年經歷了非常熱和干燥 的條件。一般而言，最常見的商業(yè)種植的牛至是希臘牛至（Origanum vulgare，亞種 hirtum)。已報道希臘牛至具有異常高水平的香芹酚和麝香草酚。我們顯示希臘牛至和常見 牛至(cv.Hot&Spicy)中的香芹酚和麝香草酚含量為基于干物質〈3%。據(jù)我們所知，之前沒 有報道過基于干物質>5%的香芹酚和麝香草酚的超積累。這使得克隆系1750、1721、1791、 1843和1850是獨特的并且分別作為香芹酚和麝香草酚的商業(yè)可行的來源具有可專利性。克 隆系（1850、1843、1791、1835和1750)在整個生長周期持續(xù)展現(xiàn)旺盛生長，而不管在2012年 夏季這些小區(qū)由于缺少雨水而經歷了水脅迫。KI-〇vl843在第2年比其它品系開花早得多。
[0062]據(jù)報道精油及其含量在開花前階段最高5。在6月第1周收獲時全部克隆系正在開 花且仍然發(fā)現(xiàn)香芹酚和麝香草酚含量處于最大水平。因此牛至可以在開花前或在開花時收 獲以最大化香芹酚和麝香草酚產量。在合適的生長條件下，具有充足的降雨，這些品系能夠 在生長季節(jié)期間收獲兩次;在5月下旬一次而在8月最后一周再收獲一次。Hi-C克隆系KI-0vl750和KI-〇vl721以及Hi-T克隆系KI-0vl850將會進行大規(guī)模商業(yè)田間種植。
[0063] 一致性和穩(wěn)定性的證據(jù)
[0064]自從鑒別到品種KI-0vl850，沒有觀察到任何類型的變體，表明該基因型的穩(wěn)定性 和一致性。從這些結果顯然KI-0vl850克隆系是穩(wěn)定的并且在無性生殖的連續(xù)傳代中純種 生殖。
[0065] 特異性聲明
[0066] KI-0vl850比我們已經觀察的或已知的任何其它牛至克隆系更有活力且每英畝產 生更多生物量。由于旺盛的營養(yǎng)生長，該基因型可以在一季中收獲多次，且具有在任何溫度 氣候中生長的潛力。
[0067] 通過Data2Bio，LLC(Ames, Iowa)在兩個Ilumina HiSeq 2000配對末端（PE)泳道 (泳道5和6)中對提取自組織的KI_0vl850DNA樣品進行測序。使用"TruSeq DNA Sample Preparation Guide"（Catalog#PE-940_2001)概述的Illumina方案制備各基因組DNA樣品。 首先，將gDNA片段化(Covaris Sheraing持續(xù)時間120秒）以產生300-400bp的插入物。使用 Klenow T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶修復DNA片段末端并磷酸化。然后，將"A"堿基添加 至末端鈍化的片段的3'端，隨后通過T-A介導的連接而連接至Il Iumina接頭。經連接的產物 通過AMPure XP珠進行大小選擇，然后使用Illumina引物PCR擴增。文庫大小和濃度使用 Agilent Bioanalyzer 1000芯片測定。來自兩個泳道的原始讀段合并成單一文檔并總結于 表6 〇
[0068] 表6-原始序列讀段的總結
[0070]針對低質量掃描各原始讀段的核苷酸。PHRED質量值〈15(40個中）（Ewing，B.and P.Green,1998Base-calIing of automated sequencer traces using phred.II.Error probabilities .Genome Res.8(3): 186-194)，即錯誤率< 0.03%的喊基通過修整管道被去 除。在兩個階段中檢查各讀段。在第一階段中，從各末端開始掃描讀段，去除具有低于閾值 的質量值的核苷酸。剩余的核苷酸然后使用IObp的重疊窗口掃描，且具有小于指定閾值的 平局質量值的超出上一窗口的序列被截短。修整參數(shù)參考修整軟件Lucy (Chou，H.H.， G.Sutton,A.Glodek and J.Scott,1998Lucy-A Sequence Cleanup Program,pp. in Proceedings of the Tenth Annual Genome Sequencing and Annotation Conference (GSAC X) ,Miami，F(xiàn)L)。原始讀段的統(tǒng)計學總結示于表7。
[0071]表7-原始讀段修整的總結
[0073]原始序列已經儲存并上載至國家生物技術信息中心(NCBI)，美國國立醫(yī)學圖書館 Bethesda,MD的Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫，并且那些序列在此通過引用以其整 體并入本文。NCBI分配的提交登錄號為SRX220840且其在2013年5月7日向公眾釋放。本領域 技術人員可以分析所儲存的原始序列信息以確定KI-O1850的遺傳序列。
[0074]前述說明書和附圖包含本發(fā)明的說明性實施方式。前述實施方式和本文描述的方 法可以基于本領域技術人員的能力、經驗和偏好而有所不同。僅僅以某些順序列出方法的 步驟并不解釋為對所述方法的步驟順序的任何限制。前述說明書和附圖僅僅解釋和說明本 發(fā)明，本發(fā)明并不限于此，除了權利要求如此限制外。具有本公開的本領域技術人員將能夠 做出其中的修改和變化而不脫離本發(fā)明的范圍。
[0075] 參考文獻
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【主權項】
1. 牛至植物的植物組織，其中所述組織包含基于干重大于3%的麝香草酚并且具有表2 范圍內的特性。2. 權利要求1的組織，其中所述組織選自葉、花粉、根狀莖、根、種子或莖組織。3. 包含權利要求1的組織的牛至植物。4. 包含權利要求3的植物的細胞的組織培養(yǎng)物。5. 提取自權利要求1的組織的麝香草酚。6. 生長自權利要求1的根狀莖組織的牛至植物。7. 用于產生第二牛至植物的方法，包括向第一牛至植物或其部分施用植物育種技術， 其中所述第一牛至植物是權利要求3的牛至植物，且其中施用所述技術導致產生所述第二 牛至植物。
【專利摘要】名為KI-Ov1850的新的及特異性的牛至克隆系，通過升高的麝香草酚水平和旺盛生長進行表征。
【IPC分類】A01H5/00
【公開號】CN105705006
【申請?zhí)枴緾N201480038991
【發(fā)明人】B·納拉辛汗摩爾蒂, J·格里夫斯, L·趙, Z·邱, N·克盧
【申請人】凱敏工業(yè)公司
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年5月7日
【公告號】EP2993972A1, US20140338009, WO2014182786A1