一種篩選甘蔗耐旱變異株的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于甘蔗分子育種技術領域，具體涉及的是一種耐旱甘蔗植株的選育方 法。
【背景技術】
[0002] 干旱是一個全球性面臨的難題，世界上有50多個國家和地區(qū)屬于干旱、半干旱地 區(qū)，占地球總陸地面積的35%，而有灌溉條件的耕地面積僅有15%或更少。中國的旱地面積 有0.78億hm 2，占總耕地面積的60%，其中無灌溉設施的旱作面積占總耕地面積的49.1 %， 隨著全球氣候呈現(xiàn)變暖趨勢，干旱將面臨更嚴峻的挑戰(zhàn)。
[0003] 甘蔗作為我國重要的糖料和能源作物，食糖是關系到國計民生的主要農(nóng)產(chǎn)品，中 國的主產(chǎn)蔗區(qū)主要分布在廣西、云南、海南和廣東等省（區(qū)），約有2/3以上的甘蔗分布在旱 地上，而廣西90 %以上種植在無灌溉條件的丘陵地帶，旱害已嚴重阻礙廣西乃至全國甘蔗 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近20年來甘蔗科研工作者通過雜交育種或引種選育出不少優(yōu)良的甘蔗品種或 品系，但抗旱品種仍沒有得到很好的解決，特別由于廣西氣候自身因素的原因，種植在該區(qū) 域的甘蔗開花十分困難，經(jīng)過人工技術調(diào)節(jié)開花難度大，且開花后花粉活力很弱，雜交育種 非常困難，目前廣西甘蔗雜交育種主要在海南南繁育種基地進行，給本地的育種帶來諸多 不便，育種受到一定程度的障礙。因此，開發(fā)一種新的甘蔗抗旱選育方法，進一步提高甘蔗 產(chǎn)量，對提高種植者的經(jīng)濟效益、促進甘蔗的產(chǎn)業(yè)化具有重要的意義和應用價值。
[0004] 外源DNA直接導入技術，是植物分子育種的內(nèi)容之一，它既不同于載體轉化的基因 工程技術，也有別于通過有性雜交實現(xiàn)植物之間基因交流的傳統(tǒng)育種方式，而是以植物為 受體，直接將帶有目的性狀的供體遺傳物質(zhì)(總DNA)或目的基因?qū)胧荏w植物，創(chuàng)造出大量 的變異材料，通過篩選獲得目的性狀的后代，從而達到改良品種目的。由于其操作簡單、方 便易行，不受受體植物種類的限制，適用范圍廣泛，且價格低廉，易于推廣，已被越來越多的 育種工作者所采用。通過這種方法已培養(yǎng)出一些抗病、抗蟲及其它優(yōu)良性狀的農(nóng)作物新品 種或品系。早在1974年，周光宇在調(diào)查了植物遠緣雜交廣泛實踐的基礎上，提出了植物遠緣 雜交存在著染色體水平以下的DNA片段雜交假說。從整體上說，遠緣親本間的染色體結構是 不親和的，但從進化的角度來看，部分基因的結構有可能保持一定的親合性。當遠緣的基因 組進入母體(受體)后，大部分片段被分解，僥幸保存下來的某些DNA片段有可能整合進入到 受體的染色體中，在后代表達出典型的或更多是非典型的遺傳變異。通過外源DNA直接導入 植物技術已在水稻、玉米、小麥和煙草等作物取得成功，培育出的許多優(yōu)良品種(系)在生產(chǎn) 上已推廣應用，并取得了良好的經(jīng)濟和社會效益。
[0005]斑茅是甘蔗近緣屬植物，具有許多甘蔗育種者所尋求的優(yōu)良性狀，如抗旱、耐瘠和 抗病等特性，倍受甘蔗育種家關注。但長期以來，由于斑茅花粉不育或敗育等問題，目前利 用斑茅作親本通過常規(guī)雜交育種選育出的抗旱新品種很少。因此，如何通過一些實驗手段 將其與甘蔗雜交融合篩選抗旱的優(yōu)良甘蔗種質(zhì)，將為甘蔗開辟一條新途徑。
[0006]目前，大部分研究是對生產(chǎn)上的甘蔗品種進行抗旱生理等性狀對比，如滕崢等報 道了新臺糖22號等6個甘蔗品種（品系)抗旱生理生化性狀比較。而有關甘蔗耐旱選育方法 報道很少，公開號為CN 101503692A的發(fā)明專利公開了一種利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗 品種的方法，該技術方法繁瑣，需要用到基因槍等價格昂貴的儀器設備及抗性標記基因篩 選等較為復雜的過程。從品種推廣應用和食品安全的角度考慮，轉基因植物種植仍存在許 多屏障，如基因漂移對環(huán)境產(chǎn)生的生態(tài)風險，抗生素等選擇標記基因仍有可能保留在植物 體內(nèi)，轉基因食品對人的生理以及是否產(chǎn)生毒性等不確定的因素在科學界存在激烈論證 中。
[0007] 因此，開發(fā)一種甘蔗抗旱選育方法是目前需要迫切解決問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對上述存在的問題，本發(fā)明提供一種耐旱甘蔗植株的選育方法，嘗試利用斑茅 與甘蔗細胞進行懸浮共培養(yǎng)接近大自然選育的方式培養(yǎng)，在含PEG的MS培養(yǎng)基上選擇，通過 大棚水分脅迫篩選出抗旱甘蔗植株，可提高甘蔗抗旱能力，為今后篩選抗旱的甘蔗品種奠 定技術基礎。
[0009] 本發(fā)明提供的技術方案為：
[0010] -種篩選甘蔗耐旱變異株的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)甘蔗的愈傷組織培養(yǎng):將長至l〇-20cm蔗芽取下消毒滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基 上誘導愈傷組織，每瓶接4-5圓片，先暗培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)IOcU后進行光照培養(yǎng)IOh/天，連續(xù)培 養(yǎng)15d，得到愈傷組織；
[0012] (2)甘蔗的胚性愈傷培養(yǎng):將步驟(1)中得到的愈傷組織轉至繼代培養(yǎng)基上進行繼 代增殖，繼代3次，每次培養(yǎng)20d，光照培養(yǎng)IOh/天，培養(yǎng)后挑選結構疏松、顏色淡黃的愈傷組 織，可結合顯微鏡進行選擇，篩選出甘蔗胚性細胞；
[0013] (3)甘蔗愈傷懸浮培養(yǎng)與選擇:將步驟(2)中得到的甘蔗胚性細胞接種到含1.0_ 3. Omg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，在搖床以120rpm的轉速進行震蕩培養(yǎng)，光 照培養(yǎng)IO-HcU將得到的細胞團塊轉移至離心管中以8000rpm的轉速離心10min，將離心沉 淀物剔除褐化、已死亡細胞及大細胞團塊后轉接到含2.〇1^/12,4-〇、0.11^/1祖4的1^培 養(yǎng)基，在搖床上120rpm震蕩培養(yǎng)2-4d，得到比較分散的懸浮物，先用孔徑50目細胞篩濾去較 大孔徑的愈傷組織，再用孔徑為80-150目的細胞篩濾，即得到直徑0.1-0.22mm的較分散的 微小細胞粒；
[0014] (4)斑茅總DNA與甘蔗細胞懸浮共培養(yǎng):將步驟(3)中得到的微小細胞粒轉移至含 1 · 0-2 · Omg/L 2，4-D、0 · 1-0 · 2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，并加入斑茅總DNA，總DNA的濃度為 200-400yg/mL，將甘蔗愈傷小細胞粒與斑茅總DNA在搖床120rpm的轉速進行懸浮共培養(yǎng)，先 暗培養(yǎng)2d，再光照培養(yǎng)3d，得到細胞培養(yǎng)物；
[0015] (5)將步驟(4)得到的細胞培養(yǎng)物轉移至含有20%PEG(W/W)、l·0mg/L2,4-D的MS 培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)7d，將培養(yǎng)物再轉入含10%PEG、2.Omg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上進行 光照培養(yǎng)IOd;
[0016] (6)將步驟(5)得到的細胞培養(yǎng)物在分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，光照培養(yǎng)分化出 不定芽，培養(yǎng)時間20d，將芽在含30%PEG的MS培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，光照培養(yǎng)20d，得到再生植 株；
[0017] (7)將步驟(6)獲得的再生植株在生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，光照培養(yǎng)20d，經(jīng)過 SRAP分子檢測鑒定，初步獲得耐旱的甘蔗變異株試管苗；
[0018] (8)將步驟(7)獲得的耐旱的甘蔗變異株試管苗進行苗期水分脅迫處理，剔除不耐 旱或表現(xiàn)不良的植株，最后獲得耐旱甘蔗植株。
[0019] 作為優(yōu)選，所述的MS培養(yǎng)基均需添加30g/L蔗糖;所述的光照培養(yǎng)是指日光燈光 照、光照強度為2000-3000LUX;所述的暗培養(yǎng)是指全天遮光處理;所述的光照培養(yǎng)、暗培養(yǎng) 的溫度為26 ±2 °C。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟（1)中所述的消毒滅菌的具體操作為:取無病害、生長健壯的甘蔗 莖稍，流水沖洗，剝?nèi)ネ鈬~片，在超凈工作臺上，用解剖刀逐層剝?nèi)~，每剝1次用75%的酒 精表面消毒1次，留下〇-2cm新葉，切成I-2mm厚圓片。
[0021]作為優(yōu)選，步驟（1)中所述的誘導培養(yǎng)基為含2.0-3 . Omg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基。
[0022]作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的繼代培養(yǎng)基為含1.0-2.011^/12,4-0、0.1-0.211^/1 NAA的MS培養(yǎng)基。
[0023]作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的斑茅總DNA是采用SDS方法提取斑茅葉片的總DNA。 [0024] 作為優(yōu)選，步驟(5 )、步驟(6)中所述的PEG為聚乙二醇6000。
[0025]作為優(yōu)選，步驟(6)中所述的分化培養(yǎng)基為含20 % PEG (w/w )、1.0 mg/L BA的MS培養(yǎng) 基。
[0026]作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的生根培養(yǎng)基為含4.0mg/L NAA、0.5mg/L PP333的1/ 2MS改良培養(yǎng)基;所述的1/2MS改良培養(yǎng)基的組成如表1所示。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟(8)中所述的水分脅迫處理的具體操作為:在智能溫室大棚中，先 將沙床苗單株種植于塑料桶中，當甘蔗長到具有6片完全葉時進行干旱處理，干旱處理是采 取逐漸減少澆水量直至停止?jié)菜拿{迫方法。
[0028] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0029] 本發(fā)明的方法可縮短甘蔗選育的時間，且操作簡單、價格廉價，同時提供一種突破 甘蔗屬、種的近緣源雜交新途徑，所獲得的甘蔗植株比對照具有更好的耐旱特性。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明的方法培育獲得甘蔗變異株、未變異株、對照葉片與斑茅葉片SRAP分 子鑒定的聚丙烯凝膠電泳圖；
[0031]有關附圖標記的說明：
[0032] 1為未變異株;2-8為變異株;9為R0C22-CK; 10為斑茅-CK。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述，但應當理解本發(fā)明的保 護范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0034] 除非另有其它明確表示，否則在整個說明書和權利要求書中，術語"包括"或其變 換如"包含"或"包括有"等等將被理解為包括所陳述的元件