一種植物根際促生菌對植物促生效能的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種植物根際促生菌對植物促生效能的測 定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱促生菌或PGPR) 是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉，可促進植物生長及對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用， 產(chǎn)生促進植物生長代謝物，抑制有害微生物繁殖的一類細菌的總稱。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中引入植 物根際促生菌，對創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境、降低化肥與農(nóng)藥的使用、抑制病蟲害的發(fā)生有 重要的作用，在保證現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時又達到增產(chǎn)的目的。因此，篩選出促生效能 好的菌株對提高植物產(chǎn)量有著重要意義。
[0003] 近年來，國內(nèi)外很多學(xué)者對植物根圍促生菌的生理效應(yīng)、作用機制、制劑產(chǎn)品和應(yīng) 用進行了多方面的研究。目前，應(yīng)用方面最普遍的做法是從植物根際分離篩選大量高效優(yōu) 良的植物根際促生菌菌株，并測定其促生效能，再篩選促生效能好的菌株研制微生物肥料， 將植物根際促生菌真正運用到大田中。在篩選菌株測定促生效能時，本發(fā)明提供的方法操 作簡單方便、能較為準確的測定菌株對植物生長特性及品質(zhì)的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的為提供一種操作簡單方便、測定結(jié)果較為準確的植物根際促生菌對 植物促生效能的測定方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)手段： 一種植物根際促生菌對植物促生效能的測定方法，包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)基的制備 在Hoagland營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加一定量的瓊脂，制備Hoagland半固體培養(yǎng)基；制備LB 培養(yǎng)基； (2) 接種劑的制備 接種PGPR菌株于LB液體培養(yǎng)基中，于28 °C，125 r/min培養(yǎng)48h，用無菌水調(diào)節(jié)菌株菌 懸液濃度為1X108 cfu/mL;在三角瓶內(nèi)裝入150 mL LB液體培養(yǎng)基，滅菌后置于室溫下1-2d，經(jīng)檢查無污染后接種20 mL上述菌懸液，于28 °C，125 r/min培養(yǎng)2-3d，用滅菌量筒將菌 液注入滅菌玻璃瓶中常溫密封保存?zhèn)溆茫?(3) 植物種子的催芽 選擇籽粒飽滿的植物種子，經(jīng)0.1% HgCl2表面消毒2-3min，再用無菌水沖洗3-5次后， 置于盛有水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至l-2cm后備 用； (4) 種植 將步驟(3)中萌發(fā)至l-2cm的幼苗移至盛有40ml滅菌的Hoagland半固體培養(yǎng)基的長玻 璃試管中，每個試管種植1株幼苗，放入智能人工氣候培養(yǎng)箱中（28°C，16h光照，20000 lx， 8h黑暗，相對濕度40%-50%)2d后選擇成功生長，長勢一致的幼苗； (5)接菌 取步驟(2)中制備的接種劑lml在無菌條件下分別接種于步驟(4)中選擇的幼苗，設(shè)不 接菌對照處理，每個處理均重復(fù)3次，幼苗試管置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0006] (6)收獲及指標的測定 接種菌株的幼苗培養(yǎng)數(shù)天(可按試驗需要設(shè)定)后收獲，測定植物的生物量、根系生長 的特征、植物的品質(zhì)等內(nèi)容，分析判斷菌株的促生效能。
[0007] 其中，步驟（1)中所述Hoag land半固體培養(yǎng)基可以為Hoagland半固體難溶磷培養(yǎng) 基或者Hoagland半固體無氮培養(yǎng)基。
[0008] 采用本發(fā)明的測定方法，測定的PGPR菌株可為已知菌株，也可為未知菌株。若為已 知菌株，可測定這種菌株的促生效能及促生機理;若為未知菌株，可通過此方法篩選促生效 能優(yōu)良的菌株資源，然后再進一步鑒定。所以無論采用哪種PGPR菌種均可達到本發(fā)明的目 的和效果。
【具體實施方式】
[0009] 以下實施例用以對本發(fā)明進行詳細說明，并不用于限定本發(fā)明。
[0010] 實施例1 供試溶磷菌株為 PYXP1、PYXP13、PWXP8、PYXZ1、PYXZ7、PYXZ19、PYXZ23、PWXZ6、PWXZ10、 NXY18、NXZ4、NXZ8、NXZ17、NXZ18、003PWXZ6、003NXZ4、003NXZ9。
[0011] 供試植物為披堿草(Elymus dahuricus)，發(fā)芽率為95%。
[0012] 一種植物根際促生菌(PGPR)對植物促生效能的測定方法，包括以下步驟： (1)培養(yǎng)基的制備 Hoagland半固體難溶磷培養(yǎng)基，配方（1000mL)如下：1 mol/L MgS〇4.7H2〇 4mL，l mol/L Ca3(P〇4)2 2mL，l mol/L CaCl2.2H2〇 10mL，l mol/L KC1 10mL，F(xiàn)e.EDTA 2mL，微 量元素營養(yǎng)液2mL，Agar 2g。
[0013]其中，微量元素營養(yǎng)液配方（500mL)為：HB03 0.310g，MnS〇4 1.115g，ZnS〇4.7H20 0.430g,NaMo04· 2H20 0.0125g,CuS04· 5H20 0.00125g,CoCl2 0.00125g,KI 0.0375g〇
[0014] LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基組成及配方為：NaCl 10g，Bacto_trypton 10g，Bacto yeast extract 5 g，瓊脂 20.0g，pH 值為7.5。
[0015] (2)接種劑的制備 接種PGPR菌株于LB液體培養(yǎng)基中，于28 °C，125 r/min培養(yǎng)48h，用無菌水調(diào)節(jié)菌株菌 懸液濃度為1X108 cfu/mL;在三角瓶內(nèi)裝入150 mL LB液體培養(yǎng)基，滅菌后置于室溫下1-2d，經(jīng)檢查無污染后接種20 mL上述菌懸液，于28 °C，125 r/min培養(yǎng)2-3d，用滅菌量筒將菌 液注入滅菌玻璃瓶中常溫密封保存?zhèn)溆茫?(3)植物種子的催芽 選擇籽粒飽滿的披堿草種子，經(jīng)0.1% HgCl2表面消毒2-3min，再用無菌水沖洗3-5次 后，置于盛有水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至l-2cm后 備用； (4) 種植 將步驟(3)中萌發(fā)至l-2cm的幼苗移至盛有40ml滅菌的Hoagland半固體培養(yǎng)基的長玻 璃試管中，每個試管種植1株幼苗，放入智能人工氣候培養(yǎng)箱中（28°C，16h光照，20000 lx， 8h黑暗，相對濕度40%-50%)2d后選擇成功生長，長勢一致的幼苗； (5) 接菌 取步驟(2)中制備的接種劑lml在無菌條件下分別接種于步驟(4)中選擇的幼苗，設(shè)不 接菌對照處理，每個處理均重復(fù)3次，幼苗試管置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016] (6)收獲及指標的測定 接種溶磷菌的幼苗培養(yǎng)35 d后收獲，用無菌蒸餾水洗凈根表附著的培養(yǎng)基，測量株高， 將植株的地上和地下部分分開，用掃描儀(Deskscan System-Root Law Program，美國）對 根系進行掃描并計算根長、根直徑、根體積、根表面積等生長指標;之后，將植株地上部分和 地下部分于105 °C殺青1 h，70 °C烘干至恒重，分別稱取干重(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，1988)。
[0017]溶磷菌株接菌處理后對披堿草地上、地下植物干重和株高的影響如表1，披堿草的 株高、地上和地下植物干重顯著高于對照，達到了顯著水平(P〈0.05)，各菌株處理間差異各 異。其中，菌株P(guān)YXZUPWXZ6和003PWXZ6處理后對植株株高的促進作用最為明顯顯著高于其 他處理（Ρ〈0·05)，分別為39.79 cm、40.51 cm和41.99 cm，超過對照74·48%、77·91%和 84.46%;對植株的地上、地下植物干重及總干重增加最顯著的為?￥乂？1和003?1乂26菌株，植 株總干重分別為0.0898 g/株和0.848 g/株，顯著高于對照(0.0194 g/株）(Ρ〈0·05);各處 理中菌株P(guān)WXZ10處理的根冠比最高(0.21)。
[0018]表1不同溶磷菌株處理對披堿草地上、地下植物干重和株高的影響
注：同列不同小寫字母表示差異顯著(ρ〈0.05)，下同。
[0019] 溶磷菌株接菌處理后對披堿草根系性狀的影響如表2,結(jié)果表明，各菌株接菌處理 后對披堿草根系性狀的影響差異顯著(P〈〇.〇5)，其中，菌株?1乂27、似28、？￥乂？1、003似29接 菌處理對根系平均直徑的影響最大，分別為0.4294mm、0.3069mm、0.3006mm、0.4034mm，顯著 高于對照(0.1404)(P〈0.05);菌株P(guān)WXZ10接菌處理后，植株的根總長最大(245.7025cm)，顯 著高于其他處理及對照（57.1185 cm) (P〈0.05)，菌株NXZ4處理后，菌株的根總長次之 (171.2165〇1〇，也顯著高于顯著高于其他處理及對照（57.1185〇1〇(?〈0.05) ;菌株?1乂210、 NXZ4接菌后對根表面積的影響最大，分別為16.8455cm2/株和14.3299cm2/株，顯著高于其他 處理和對照（5.6376〇!11 2/株），菌株？￥乂223、？￥乂？1、？￥乂？13處理根表面積次之，分別為 12 · 3230cm2/株、12 · 6273cm2/株、12 · 3904cm2/株；菌株 PYXZ23、NXZ8、NXZ4、PYXP13 處理對根 體積的影響最大，分別為〇 · 0890cm3/株、0 · 0790cm3/株、0 · 0920cm3/株、0 · 0980cm3/株，顯著 高于其他處理和對照（0 · 0380cm3/株）。
[0020] 表2不同溶磷菌株處理對披堿草根長和根系性狀的影響
各菌株處理對披堿草根系不同直徑段植株根總長及其分布的影響如表3,菌株P(guān)WXZ10 處理的根總長最大，但根系直徑均分布在0.05~0.25 mm之間；菌株NXZ4處理根系直徑在 0.05~0.25 mm之間的根長為170.2584 cm，占根總長的99.58%，根系直徑在0.25~0.45 mm之 間的根長為〇. 7120 cm，占總根長的0.42%;菌株P(guān)YXZ19處理根系直徑在0.05~0.25 mm之間 的根長為98.2359 cm，占根總長的99.65%，根系直徑在0.25~0.45 mm之間的根長為0.2359 cm，占根總長的0.24%，根系直徑大于0.45 mm的根長為0· 1051 cm，占根總長的0· 11%〇 [0021 ]表3不同溶磷菌株處理對披堿草根系不同直徑下根長及其比例的影響
各菌株處理對披堿草根系不同直徑段植株根表面積及其分布的影響如表6-5，菌株 PWXZ10處理的根表面積最大，但根系直徑均分布在0.05~0.25 mm之間；菌株NXZ4處理根系 直徑在0.05~0.25 mm之間的根表面積為11.2544 cm2，占根總表面積的94.27%，根系直徑在 0.25~0.45 mm之間的根表面積為0.6845 cm2,占根總表面積的5.73%;菌株P(guān)YXZ19處理根系 直徑在0.05~0.25 mm之間的根表面積為6.4909 cm2，占根總表面積的94.46%，根系直徑在 0.25~0.45 mm之間的根表面積長為0.2301 cm2，占根總表面積的3.35%，根系直徑大于0.45 mm的根表面積為0.1507 cm2,占根總表面積的2.19%。
[0022]表4不同溶磷菌株處理對披堿草根系不同直徑下根表面積及其比例的影響
各菌株處理對披堿草根系不同直徑段植株根體積及其分布的影響如表6-6,菌株P(guān)YXP1 處理的根體積最大，但根系直徑均分布在0.05~0.25 mm之間；菌株NXZ4處理的根體積次之， 根系直徑在0.05~0.25 mm之間的根體積為0.1466 cm3,占根總體積的73.26%，根系直徑在 0.25~0.45 mm之間的根體積為0.0535 cm3，占根總體積的26.74%;菌株P(guān)YXZ19處理根系直 徑在0.05~0.25 mm之間的根體積為0.0760 cm3，占根總體積的68.35%，根系直徑在0.25~ 0.45 mm之間的根體積長為0.0180 cm3,占根總體積的16.18%，根系直徑大于0.45 mm的根 體積為0.0172 cm3,占根總體積的15.47%〇
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