一種荊半夏種莖快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種荊半夏種莖快速繁殖方法，步驟是：A﹑外植體的選擇和誘導(dǎo)：選用葉柄作外植體，以葉片展開后的葉柄作外植體，經(jīng)自來水沖洗后，加入酒精，浸泡,倒掉酒精，用無菌水清洗，用新潔兒滅浸泡，倒掉新潔爾滅，用無菌水清洗，加入升汞溶液和吐溫，浸泡，用無菌水清洗后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)形成帶芽的球狀體；B﹑球狀體芽的增殖：經(jīng)過誘導(dǎo)將獲得帶有芽點的球狀體，在超凈工作臺內(nèi)將芽切開，切開的球狀體含芽點，增殖培養(yǎng)；C、種莖的形成：帶芽的球狀體經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，取下單個芽點，在超凈工作臺接種到種莖培養(yǎng)基，促使種莖增大。方法易行，操作簡便。能有效的降低了內(nèi)生菌對半夏無菌培養(yǎng)的影響，提高了組培快繁效率。增殖效率高。
【專利說明】
一種荊半夏種莖快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用植物組 織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)荊半夏種莖的方法。該方法主要用于荊半夏種莖的快速生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 半夏(Pinellia ternata)為天南星科半夏屬多年生草本植物，株高15-30厘米;塊 莖近球形，直徑1-2厘米;葉出自塊莖頂端，葉柄長6-23厘米，一年生的葉為單葉，卵狀心形； 2-3年后，葉為三出復(fù)葉。半夏是一種常用的中藥材，在588種中藥處方中，半夏使用頻率居 第22位。具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散節(jié)的功效。近年來，研究發(fā)現(xiàn)半夏還有抗早孕、抗 腫瘤、降血脂、護(hù)肝等功能。由于市場需求量大，野生半夏資源無法滿足，現(xiàn)已有大規(guī)模的人 工種植。但半夏人工種植所需種莖量大，成本高。目前，人工種植半夏每畝地需種莖300-400kg，購買這些種莖的成本約為6000-8000元，因此，人工種植半夏種莖的成本為6000-8000元/畝。這也是影響半夏人工種植效益的主要因素之一。因此，開發(fā)種莖高效繁殖方法 是提高半夏人工種植效益的途徑之一。
[0003] 自然狀態(tài)下，半夏可通過有性和無性兩種方式進(jìn)行繁殖。半夏雌雄花序在同一個 佛焰苞中，屬同株異花傳粉，一般而言，只有較大塊莖才能抽出佛焰苞，形成的種子在常規(guī) 條件下萌發(fā)率相當(dāng)?shù)?。因此，有性繁殖不是其主要繁殖方式。自然群體內(nèi)大部分個體是源自 無性繁殖產(chǎn)生的珠芽。珠芽繁殖是半夏無性繁殖的主要方式，珠芽著生在葉柄下部內(nèi)側(cè)面， 有的會在三葉交匯處著生一珠芽。珠芽落于土中形成新植株，珠芽變成了塊莖。半夏塊莖偶 爾也產(chǎn)生子塊莖，子塊莖能形成新個體。塊莖繁殖是另一種無性繁殖方式。綜上所述可見， 自然狀態(tài)下半夏繁殖效率低。
[0004]組織培養(yǎng)是一種植物快速繁殖的方法，是指從植物體中取出組織、器官，然后模擬 機體的生理條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存，形成組織或長成植株的技術(shù)過程。任家惠 (1983)最早用半夏葉片和葉柄作外植體進(jìn)行研究，通過愈傷組織獲得大量完整植株。通過 組培方法快繁半夏種苗的方法主要集中于外植體、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基、再生途徑方面。半夏 組織培養(yǎng)中常用的半夏材料有葉片、葉柄、塊莖和珠芽。夏海武（1994)在半夏不同生長時期 分別取葉片、葉柄和塊莖進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)早期取材誘導(dǎo)效果較好。萬美亮等（1995)的研究表 明葉柄誘導(dǎo)效果最好，葉片次之，二者皆啟動快，誘導(dǎo)率可達(dá)90% ;而塊莖、珠芽較差。武宗 信等（2005)報道了采用珠芽成功建立半夏無性繁殖系，并獲得了大量再生植株。邱萍等 (2008)采用半夏莖尖作外植體，得到較高的成活率和成苗率。培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基方面研究 比較一致，MS培養(yǎng)基是比較適合培養(yǎng)基，培養(yǎng)光照強度1500~25001x，每日10~12h左右。培 養(yǎng)溫度為（25 ± 1) °C。半夏植株再生途徑有兩種:器官途徑和胚狀體途徑。朱忠榮（1991)等 用葉柄和塊莖切塊進(jìn)行培養(yǎng)，過程中不出現(xiàn)明顯的愈傷組織，而是直接從外植體表面產(chǎn)生 多個球狀體，然后由球狀體上方長綠芽，下方長出根。何奕昆（1994)等將葉柄接在分化培養(yǎng) 基上，可直接產(chǎn)生小塊莖或小鱗莖，進(jìn)而分化出完整植株。在某些情況下也可經(jīng)過愈傷階段 形成再生苗。以上研究為半夏組培快繁奠定了基礎(chǔ)，可利用半夏葉柄、葉片、珠芽和塊莖作 為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，最終均可獲得完整植株。
[0005] 在半夏人工栽培中，還主要是用半夏塊莖作為種莖，播種量為300-400kg/畝，種莖 成本為6000-8000元/畝，一般5年內(nèi)不用再購買種莖。因此，如果通過組培方法來商業(yè)化生 產(chǎn)種莖，需要在種莖質(zhì)量、成本等方面優(yōu)于天然塊莖。為此，一些半夏改良的組培快繁方法 被建立起來，主要目標(biāo)在于降低半夏種植的成本，提高半夏種植的效益。為了減少組培中的 操作環(huán)節(jié)，降低成本，羅成科等(2007)引入一步成苗技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點是將組培技術(shù)中的 誘導(dǎo)、增殖和分化等環(huán)節(jié)合并一個環(huán)節(jié)，將外植體葉片接入到培養(yǎng)基中，經(jīng)過90天培養(yǎng)后， 獲得再生苗，再生苗移栽容易存活。應(yīng)該說，一步成苗技術(shù)有助于半夏組培快繁技術(shù)的商業(yè) 化應(yīng)用。對于培養(yǎng)方式也有些有益探索。賈明良等(2012)將間歇浸沒培養(yǎng)的方法引入半夏 組培快繁，減少培養(yǎng)時的人力投入，且提高增殖率，為低成本生產(chǎn)大量高質(zhì)量的種苗提供保 障。該方法的具體操作是:將無菌外植體接入到生物反應(yīng)器中，間歇性地加入無菌液體培養(yǎng) 基，使外植體能從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分，接受培養(yǎng)基中激素的誘導(dǎo)，另一方面，又可避免像懸 浮培養(yǎng)那樣導(dǎo)致外植體和分化苗等中間體玻璃化。該方法展現(xiàn)出一些工業(yè)化生產(chǎn)的特點， 為半夏利用組培方法進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是在于提供了一種荊半夏種莖快速繁殖方法，方法易行，操作簡便。能 有效的降低了內(nèi)生菌對半夏無菌培養(yǎng)的影響，提高了組培快繁效率。能高效的誘導(dǎo)帶芽球 狀體的形成，并能使帶芽球狀體高效的增殖，增殖效率高。所形成種莖相對組培苗使用更方 便。
[0007] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0008] 本發(fā)明構(gòu)思是：一種荊半夏種莖快速繁殖方法包括三個步驟:A、外植體的選擇和 誘導(dǎo);B、球狀體芽的增殖;C、種莖形成。
[0009] -種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是：
[0010] A、外植體的選擇和誘導(dǎo)：當(dāng)選用葉柄作外植體時，應(yīng)該選用葉片還未展開時葉柄 作為外植體，葉柄展開后的葉柄作外植體時，其內(nèi)生菌的污染率明顯增高。外植體的誘導(dǎo)過 程如下:取下按上述要求選取的葉柄外植體，經(jīng)自來水沖洗10_30min后，在超凈工作臺中將 上述葉柄外植體移到一個經(jīng)滅菌的燒杯中，加入75% (V/V，體積比）酒精，浸泡28 - 32S，倒 掉酒精，用無菌水清洗2 - 4次，然后加入0.1 % (M/V，體積質(zhì)量比)新潔爾滅浸泡2 - 4min，倒 掉新潔爾滅，用無菌水清洗4一6次，然后加入0.2 % (M/V，體積質(zhì)量比）升汞溶液和1-2滴吐 溫，浸泡8 - 12min，期間應(yīng)旋轉(zhuǎn)燒杯，使藥劑和外植體表面充分接觸，然后用無菌水沖洗4 一 6次。接種時盡量將葉柄在濾紙上晾干，以平躺的方式接種到培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+ TDZ 0 ? 5-1 ? Omg/L，鹿糖30g/L，pH5 ? 4 -pH6 ? 2。也可以用葉片作為外植體，操作過程與上述 操作相同。用無菌苗的葉柄和葉片作外植體無需進(jìn)行外植體消毒過程。接種完畢后接好后 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度24 - 26 °C左右，光照1500~25001x，光照時間為：10-12h/d。培養(yǎng)25-30d可形成帶芽的球狀體。
[0011] 另外，為了降低組培過程中勞動量和成本，可用PC方盒代替培養(yǎng)瓶，用濾紙取代瓊 月旨。具體操作如下：以長寬高分別為20X13 X 9cm的帶蓋PC方盒為例。制作一個長寬比此方 盒長寬略小的PC板，保證能卡在方盒中間。將濾紙鋪在PC板上，然后卡在方盒內(nèi)，將方盒蓋 蓋后放入高壓滅菌滅菌，同時將配制好的上述不加瓊脂培養(yǎng)基也放入高壓滅菌鍋滅菌，完 畢后，在超凈工作臺內(nèi)將液體培養(yǎng)基加入PC方盒，蓋上蓋子，等培養(yǎng)基冷卻后，將上述外植 體接種濾紙上，接種密度與接種到培養(yǎng)基上相同。此改進(jìn)能大幅度降低培養(yǎng)基分裝的勞動 量。同時也可更有效利用組培架空間。
[0012]所述的葉柄(petiole)是葉片與塊莖的聯(lián)系部分，其上端與葉片相連，下端著生在 莖上，通常葉柄位于葉片的基部。少數(shù)植物的葉柄著生于葉片中央或略偏下方，稱為盾狀著 生，如蓮、千金藤。葉柄通常呈細(xì)圓柱形。
[0013] B、球狀體芽的增殖:經(jīng)過步驟A的誘導(dǎo)將獲得帶有芽點的球狀體，在超凈工作臺內(nèi) 將芽切開，盡可能保證切開的球狀體含2-3個芽點，增值培養(yǎng)密度控制在0.2個/cm2左右。芽 增值培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0 ? 5-1 ? Omg/L，蔗糖30g/L pH5 ? 8。培養(yǎng)條件為:溫度24 - 26°C左右， 光照1500~25001x，光照時間：10h/d。一般24 - 26d左右可達(dá)到充分增殖。
[0014] 本步驟同樣可利用PC方盒改進(jìn)方法，節(jié)省勞動量。
[0015] C、種莖的形成:帶芽的球狀體經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，盡量取下單個芽點，在超凈工作臺 接種到種莖培養(yǎng)基，種莖培養(yǎng)基配方為：1/2MS，蔗糖45-60g/L，pH5.8。培養(yǎng)條件為：溫度 24 - 26°C左右，光照1500~25001x，光照時間：10h/d。一般18 - 22d左右可形成完整植株，可 見葉片、葉片和根系從切下的芽點上長出，此時，該芽點已具備半夏塊莖的特性。此時，可將 培養(yǎng)瓶放在室溫(室溫在15-30 °C之間）下有自然光照的地方，有利于營養(yǎng)物質(zhì)在種莖中進(jìn) 一步積累，促使種莖增大。
[0016] 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+TDZ 0.5-1.〇11^/1，蔗糖3(^/14115.4-口冊.2;
[0017]所述的增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA 0.5-1 .Omg/L，蔗糖30g/L，pH5.8;
[0018]所述的種莖形成培養(yǎng)基：1/2MS，蔗糖45-60g/L，pH5.8。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點與效果：
[0020] (1)與半夏自然繁殖和一次成苗技術(shù)相比，本發(fā)明主要特征是半夏種莖繁殖效率 高。自然狀態(tài)下，一棵生長2年半夏苗可產(chǎn)生1-2個珠芽(種莖），通過本發(fā)明一個培養(yǎng)過程 (75-90d)，無污染情況下一棵苗可產(chǎn)生約468個種莖[21(誘導(dǎo)芽點數(shù)）X3(葉柄通?？汕谐?三段）X6(增殖率)+5(誘導(dǎo)芽點數(shù)）X3(三片葉）X6(增殖率)計算方法]。繁殖效率相較自 然繁殖效率提高約20萬倍。
[0021] (2)與傳統(tǒng)采用自然生長半夏塊莖做種莖的方法相比，本發(fā)明主要特征是工廠化 大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)勢明顯，種莖成本可降低。按100平米培養(yǎng)室的組培規(guī)模，每斤半夏種莖成本 為5-6元，與傳統(tǒng)采用自然生長半夏塊莖做種莖的方法(每斤10-20元)相比成本相對較低。 [0022] (3)本發(fā)明操作簡單，成本低，具備推廣前景。
【具體實施方式】
[0023]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非是對本發(fā)明的限制，凡依 照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 實施例1:
[0025] -種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是：
[0026] A、外植體的選擇和誘導(dǎo)：當(dāng)選用葉柄作外植體時，應(yīng)該選用葉片還未展開時葉柄 作為外植體，葉柄展開后的葉柄作外植體時，其內(nèi)生菌的污染率明顯增高。外植體的誘導(dǎo)過 程如下：取下按上述要求選取的葉柄外植體，經(jīng)自來水沖洗10-30min后，在超凈工作臺中 將上述葉柄外植體移到一個經(jīng)滅菌的燒杯中，加入75 % (V/V，體積比）酒精，浸泡28或29或 30或31或32S，倒掉酒精，用無菌水清洗2或3或4次，然后加入0.1% (M/V，體積質(zhì)量比）新潔 爾滅浸泡2或3或4min，倒掉新潔爾滅，用無菌水清洗4或5或6次，然后加入0.2 % (M/V，體積 質(zhì)量比）升汞溶液和1-2滴吐溫，浸泡8或9或10或11或12min，期間應(yīng)旋轉(zhuǎn)燒杯，使藥劑和外 植體表面充分接觸，然后用無菌水沖洗4或5或6次。接種時盡量將葉柄在濾紙上晾干，以平 躺的方式接種到培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+TDZ0.5-1. Omg/L，蔗糖30g/L，pH5.4或5.6或 5.8或6或6.2。也可以用葉片作為外植體，操作過程與上述操作相同。用無菌苗的葉柄和葉 片作外植體無需進(jìn)行外植體消毒過程。接種完畢后接好后將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng) 室溫度24或25或26°C，光照1500或2000或25001x，光照時間為：10或11或12h/d。培養(yǎng)25或27 或28或29或30d可形成帶芽的球狀體。
[0027] 另外，為了降低組培過程中勞動量和成本，可用PC方盒代替培養(yǎng)瓶，用濾紙取代瓊 月旨。具體操作如下：以長寬高分別為20 X 13 X9的帶蓋PC方盒為例。制作一個長寬比此方盒 長寬略小的PC板，保證能卡在方盒中間。將濾紙鋪在PC板上，然后卡在方盒內(nèi)，將方盒蓋蓋 后放入高壓滅菌滅菌，同時將配制好的上述不加瓊脂培養(yǎng)基也放入高壓滅菌鍋滅菌，完畢 后，在超凈工作臺內(nèi)將液體培養(yǎng)基加入PC方盒，蓋上蓋子，等培養(yǎng)基冷卻后，將上述外植體 接種濾紙上，接種密度與接種到培養(yǎng)基上相同。此改進(jìn)能大幅度降低培養(yǎng)基分裝的勞動量。 同時也可更有效利用組培架空間。
[0028] B、球狀體芽的增殖:經(jīng)過步驟A的誘導(dǎo)將獲得帶有芽點的球狀體，在超凈工作臺內(nèi) 將芽切開，盡可能保證切開的球狀體含2或3個芽點，增值培養(yǎng)密度控制在0.2個/cm 2左右。 芽增值培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0 ? 5-1 ? Omg/L，蔗糖30g/L，pH5 ? 8。培養(yǎng)條件為:溫度24或25或26 °C，光照1500或1800或2200或~25001x，光照時間：10h/d。一般24或25或26d左右可達(dá)到充 分增殖。
[0029] C、種莖的形成:帶芽的球狀體經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，盡量取下單個芽點，在超凈工作臺 接種到種莖培養(yǎng)基，種莖培養(yǎng)基配方為：1/2MS，蔗糖45-60g/L，pH5.8。培養(yǎng)條件為:溫度24 或25或26°C，光照1500或1900或2300或25001x，光照時間：10h/d。一般18或19或20或21或 22d可形成完整植株，可見葉片、葉片和根系從切下的芽點上長出，此時，該芽點已具備半夏 塊莖的特性。此時，可將培養(yǎng)瓶放在室溫(室溫在15或18或20或23或23或28或30°C之間）下 有自然光照的地方，有利于營養(yǎng)物質(zhì)在種莖中進(jìn)一步積累，促使種莖增大。
[0030] 實施例2:
[0031 ] -種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是：
[0032] A、外植體的選擇和誘導(dǎo)：
[0033] a、外植體的選擇，為了確定合適的外植體，選用半夏塊莖、珠芽、不同發(fā)育時期的 葉柄和葉片作為外植體，測試其污染率和誘導(dǎo)效率。外植體消毒方法如下:先用自來水沖洗 15min。在超凈工作臺內(nèi)，將沖洗干凈的葉柄和葉片轉(zhuǎn)到經(jīng)過滅菌的瓶中，加75 %酒精浸泡 30s，用無菌水沖洗3次，然后加0.01 %新潔爾滅溶液浸泡5min，用無菌水沖洗5次，然后用 0.1 %升汞浸泡lOmin，用無菌水沖洗5次。測試培養(yǎng)基為：MS+TDZ0.5mg/L+NAA0.01mg/L pH5.8。葉柄切取長度為lcm左右，塊莖切成約0.5 X 0.5 X 0.5cm大小，珠芽對半切開，葉片切 成IX lcm大小。每種外植體取15個，分別接種5個經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基中。7或9或12或15或18或 20d后統(tǒng)計結(jié)果。見表1
[0034]表1不同外植體培養(yǎng)效果
[0036] 注:葉柄1和葉片1表示半夏葉片長出，但葉片未展開這一時期;葉柄2和葉片2表示 葉片展開，但珠芽并未形成時期;葉柄3和葉片3表示珠芽已形成時期。誘導(dǎo)效果"差"表示外 植體褐化或未有芽點形成。"較好"表示有芽點形成，但芽點數(shù)量不多。"好"表示形成芽在10 個以上。
[0037] 從以上結(jié)果可看出，葉片形成初期的葉柄和葉片不僅污染率低，誘導(dǎo)效果較好，適 合做外植體。
[0038] b、適合外植體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基篩選:設(shè)計不同濃度細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基，培養(yǎng)基基本 成分為MS，蔗糖濃度為30g/L，pH為5.8。然后將發(fā)育初期的葉柄和葉片接種到培養(yǎng)基上。接 種時將葉柄切成lcm左右，葉片大小在IX lcm左右。每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種3個外植 體。外植體消毒方法與"a、外植體的選擇"部分相同。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)室溫度25°C左右，光 照1500或2100或25001x，光照時間為：12h/d。25d后統(tǒng)計結(jié)果。
[0039] 結(jié)果見表2。
[0040]由此可見，隨著細(xì)胞分裂素濃度增高，誘導(dǎo)形成芽的數(shù)量也在增加，但同時，芽點 之間接觸緊密，不易分離。但作為一種高效的快繁體系，誘導(dǎo)形成芽點越多意味著最終的效 率越高。因此，細(xì)胞分離素選擇TDZ，濃度在0.5-1. Omg/L比較合理。
[0041 ]表2細(xì)胞分裂素種類和濃度對外植體誘導(dǎo)效果
[0043]注:芽點誘導(dǎo)率=芽點數(shù)/外植體數(shù)*100% ;芽點大小和密度分三個等級，"a"代表 芽點較大，芽點之間易于分離，"b"代表芽點中等，芽點比較容易分離，"c"代表芽點較小，芽 點之間距離較小，相對不易分離。
[0044] 其它實施步驟與實施例1相同。
[0045] 實施例3:
[0046] -種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是：
[0047] A、球狀體芽的增殖:為使球狀體芽增殖，同時，使芽分散且易于分離，設(shè)計一系列 分裂素種類和濃度不同培養(yǎng)基，培養(yǎng)基基本成分為MS，蔗糖添加量為30g/L，pH值為5.8。將 上述誘導(dǎo)形成球狀體上芽點切下，約2-3個芽點為一個單位，接種到增殖培養(yǎng)基上。每瓶培 養(yǎng)基接種3個帶2-3個芽的球狀體，每種培養(yǎng)基接種5瓶。
[0048] B、培養(yǎng)條件與實施例1和實施例2相同。培養(yǎng)25d后觀察芽點增殖和分散效果，見表 3。從中可以看出，隨著6-BA和TDZ濃度增加，芽增殖效率越高，但同時也導(dǎo)致芽點之間緊密 相連，這對于下一步種莖形成不利。綜合增值率和芽點分散效果兩方面考慮，6-BA濃度控制 在0.5-1. Omg/L合適。TDZ細(xì)胞分裂素效果太強，伴隨著增殖還會引起芽點相連。
[0049] 表3不同分裂素種類和濃度對球狀體芽增殖的影響
[0052]注：增殖率=增值后芽點數(shù)/增殖前芽點數(shù)；芽點分散效果："a"代表分散效果良 好，"b"代表芽點分散效果比原球狀體芽點分散度稍好，"c"代表分散度與原球狀體相同。 [0053]其它實施步驟與實施例1相同。
[0054] 實例4:
[0055] -種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是：
[0056] A、種莖的形成:此步培養(yǎng)是使芽點轉(zhuǎn)變成塊莖，如果自然狀態(tài)下珠芽落到土壤轉(zhuǎn) 變塊莖一樣。
[0057] B、鑒于步驟A的結(jié)果和自然狀態(tài)下珠芽向塊莖的轉(zhuǎn)變過程，在培養(yǎng)基不適合添加 細(xì)胞分裂素。為使形成種莖具有更大體積（更大體積塊莖做種莖可以降低收獲塊莖的年 限），在培養(yǎng)基基本成分和蔗糖濃度方面進(jìn)行對比實驗。結(jié)果見表4。由此可見，降低基本培 養(yǎng)基至1/2水平對半夏種莖形成無影響，降低至1/4水平則有影響。蔗糖濃度增加有利于半 夏種莖的增大。故種莖培養(yǎng)基以1/2MS為基本成分添加60g/L蔗糖為宜。
[0058] 表4MS培養(yǎng)基濃度及蔗糖添加量對種莖影響
[0060]其它實施步驟與實施例1相同。
【主權(quán)項】
1. 一種荊半夏種莖快速繁殖方法，其步驟是： A、 外植體的選擇和誘導(dǎo):選用葉柄作外植體，葉柄展開后的葉柄作外植體，外植體的誘 導(dǎo)過程如下:取下選取的葉柄外植體，經(jīng)自來水沖洗10-30min后，在超凈工作臺中將上述葉 柄外植體移到一個經(jīng)滅菌的燒杯中，加入75%V/V酒精，浸泡28 - 32S，倒掉酒精，用無菌水清 洗2 - 4次，然后加入0.1%M/V新潔爾滅浸泡2 - 4min，倒掉新潔爾滅，用無菌水清洗4 一 6次， 然后加入0.2%M/V升汞溶液和1-2滴吐溫，浸泡8 - 12min，期間應(yīng)旋轉(zhuǎn)燒杯，使藥劑和外植體 表面接觸，然后用無菌水沖洗4 一 6次，接種時將葉柄在濾紙上晾干，以平躺的方式接種到培 養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+TDZ 0 · 5-1 · Omg/L，鹿糖30g/L，pH5 · 4 -pH6 · 2，接種完畢后將培 養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度24 - 26°C，光照1500~2500 lx，光照時間為：10-12h/d，培 養(yǎng)25-30d形成帶芽的球狀體； B、 球狀體芽的增殖:經(jīng)過步驟(A)的誘導(dǎo)將獲得帶有芽點的球狀體，在超凈工作臺內(nèi)將 芽切開，切開的球狀體含2-3個芽點，增值培養(yǎng)密度控制在0.2個/cm 2，芽增值培養(yǎng)基為:MS+ 6-BA 0.5-1.0 mg/L，蔗糖30g/L ρΗ5·8,培養(yǎng)條件為:溫度24 - 26°C，光照 1500~2500 lx，光 照時間：l〇h/d，24 - 26d達(dá)到增殖； C、 種莖的形成:帶芽的球狀體經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，取下單個芽點，在超凈工作臺接種到種 莖培養(yǎng)基，種莖培養(yǎng)基配方為：1/2MS，蔗糖45-60g/L，pH5.8，培養(yǎng)條件為:溫度24 - 26 °C， 光照1500~2500 lx，光照時間：10h/d，18 - 22d形成完整植株，見葉片、葉片和根系從切下的 芽點上長出，該芽點已具備半夏塊莖，將培養(yǎng)瓶放在室溫下有自然光照的地方，有利于營養(yǎng) 物質(zhì)在種莖中進(jìn)一步積累，促使種莖增大。
【文檔編號】A01H4/00GK105850728SQ201610203382
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】李先良, 李居寧
【申請人】荊楚理工學(xué)院