一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物育種領(lǐng)域，專用于高山杜鵑“紅粉佳人”染色體倍性育種，特別是涉及一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，利用高山杜鵑“紅粉佳人”外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，用化學(xué)試劑秋水仙素處理愈傷組織使染色體加倍，再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，再將壯苗接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)、煉苗移栽，在顯微鏡下觀察染色體，篩選出加倍后的植株種苗。本發(fā)明首次提出觀賞植物高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍的方法。本發(fā)明培育出的多倍體高山杜鵑“紅粉佳人”，有效提高高山杜鵑“紅粉佳人”的觀賞價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物育種領(lǐng)域，專用于高山杜鵑“紅粉佳人”染色體倍性育種，特別是涉及一種一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高山杜鵲“紅粉佳人”(Rhododendron Delavayi “Cosmopolitan”)杜鵲科杜鵲屬，原產(chǎn)于我國(guó)中西部地區(qū)，常綠灌木和小喬木，外粉紅內(nèi)白的復(fù)色品種，植株茂密，株型舒展，葉綠色光亮。多倍體育種是一種有效的育種手段，也是植物進(jìn)化的重要途徑之一?！熬薮笮汀笔嵌啾扼w最顯著的外部形態(tài)特征，表現(xiàn)出莖干粗壯、葉片寬厚、葉面粗糙、葉色加深、花冠大而厚實(shí)、花瓣增多、顏色濃艷，此外，還具有延遲某些花卉種類的花期、抗逆性增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，提高花卉的觀賞價(jià)值和商品價(jià)值。隨著市場(chǎng)對(duì)該品種需求越來(lái)越多，需要進(jìn)一步對(duì)高山杜鵑植物種質(zhì)資源進(jìn)行創(chuàng)新及新品種培育。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的提供一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍的技術(shù)方法，為實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0004]—種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，包括以下步驟:
[0005](I)將高山杜鵑“紅粉佳人”外植體消毒后轉(zhuǎn)接到愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；
[0006](2)使用化學(xué)試劑秋水仙素處理愈傷組織，實(shí)現(xiàn)染色體加倍；
[0007](3)將經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑秋水仙素處理愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0008](4)將分化出的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0009](5)經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的健壯良好組培苗接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[00?0] (6)選擇根系長(zhǎng)到2_3cm的生根苗進(jìn)行煉苗，用草炭土和珍珠巖配成的混合基質(zhì)；
[0011](7)煉苗移栽后在顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選出染色體加倍后的植株苗。
[0012]步驟(I)中所述的外植體消毒的方法:用質(zhì)量濃度75%的酒精處理外植體30S，用無(wú)菌水沖洗4-5遍，再用質(zhì)量濃度0.1 %的氯化汞處理I分鐘；
[0013]所述的愈傷組織培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、2-1p 6mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22± 2°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30天。
[0014]步驟(2)具體過(guò)程為:愈傷組織經(jīng)過(guò)質(zhì)量濃度0.05%的秋水仙素處理24h，用無(wú)菌水沖洗4次；
[0015]步驟(3)中所述的不定芽培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g、瓊脂6.5g、TDZ 0.Img、2-1p Img，定容水至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22 ± 20C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。
[0016]步驟(4)中所述的增殖培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、2-1p 3mg、NAA 0.5mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22 土 2 °C，光照強(qiáng)度3500IUX，培養(yǎng)時(shí)間60天。
[0017]步驟(5)生根培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM培養(yǎng)基中大量元素減一半，即其中 WPM培養(yǎng)基中 NH4NO3、(NH4) 2SO4、MgSO4.7H20、KH2PO4、KNO3、K2SO4量減少一半，添加蔗糖2(^、瓊脂粉6.58、活性炭仏、1840.81^，用純凈水定容至1升，調(diào)整?!1值5.4，培養(yǎng)溫度22± 2 °C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間90天。
[0018]步驟(6)中所述的混合基質(zhì)，包括重量比為5:1的草炭土和珍珠巖。
[0019]步驟(7)具體的過(guò)程為:選擇植株的莖尖和根尖，做好切片，在顯微鏡下觀察染色體加倍情況。
[0020]本發(fā)明提供的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，用化學(xué)物質(zhì)秋水仙素處理高山杜鵑“紅粉佳人”愈傷組織從而誘導(dǎo)多倍體，對(duì)高山杜鵑植物種質(zhì)資源進(jìn)行創(chuàng)新，用于進(jìn)一步培養(yǎng)新品種，提高觀賞價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0021]結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)秋水仙素處理高山杜鵑“紅粉佳人”愈傷組織從而誘導(dǎo)多倍體。
[0022]其中，I升WPM基本培養(yǎng)基成分為:
[0023]大量元素:NH4NO3400mg； (NH4)2SO4 132mg；MgS04.7H20 370mg;KH2POU70mg;KNO3400mg；K2S04 900mg；
[0024]鈣鹽:CaCl296mg;Ca(N03)2.4H20 556mg；
[0025]微量元素:H3BO36.2mg；MnSO4.H2O 22.3mg；Na2MoO4.2H20 0.25mg；CuSO4.5H20
0.025mg；ZnS04.7H2O 8.6mg；
[0026]鐵鹽:Na2-EDTA37.3mg；FeSO4.7H20 27.8mg；
[0027]維生素:肌醇I OOmg;煙酸(維生素ΡΡ)0.5mg;鹽酸卩比多醇0.5mg;鹽酸硫胺素0.5mg ；甘氨酸2mg。
[0028]具體方法如下:
[0029](I)采集外植體
[0030]在春天嫩梢生長(zhǎng)積極，天氣晴朗上午，選擇生長(zhǎng)勢(shì)良好的高山杜鵑“紅粉佳人”植株，剪取頂端的幼嫩組織和頂芽，取外植體30個(gè)，剝?nèi)ロ斞坎糠职坏镊[片，準(zhǔn)備消毒處理。
[0031](2)消毒處理
[0032]首先每個(gè)外植體用牙刷蘸洗滌靈稀釋液刷洗一遍，然后用自來(lái)水沖洗30分鐘，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精處理30S，用無(wú)菌水沖洗4-5次，0.1%的氯化汞處理I分鐘，再用無(wú)菌水沖洗4-5遍。
[0033](3)外植體誘導(dǎo)愈傷組織
[0034]將消毒后的外植體接種到愈傷組織培養(yǎng)基中，以230ml的WPM為基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂粉6.5g，2-1p 2mg，NAA 0.5mg，純凈水定容到I升，調(diào)整pH值至5.4，培養(yǎng)溫度22± 2 °C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30天。
[0035](4)秋水仙素處理愈傷組織
[0036]在無(wú)菌環(huán)境下，將愈傷組織浸泡在0.05%的秋水仙素處理24h，用無(wú)菌水沖洗4次。
[0037](5)愈傷組織經(jīng)過(guò)再分化
[0038]選擇質(zhì)地呈顆粒狀，顏色發(fā)紅色的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基中。230ml的培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，TDZ 0.lmg,2-1p lmg，定容水至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22 ± 2 °C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。
[0039](6)增殖培養(yǎng)
[0040]由愈傷組織經(jīng)過(guò)再分化生長(zhǎng)的芽，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，230ml的培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g,NAA 0.5mg，2-1p 3mg，定容水至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22 ± 2 °C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。
[0041](7)生根培養(yǎng)
[0042]經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)后，選擇2-3cm長(zhǎng)的芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，230ml的培養(yǎng)基，其中WPM培養(yǎng)基中順4勵(lì)3、(順4)2504、]\%304.7!120、10^04、1(勵(lì)3、1(2304量減少一半，添加蔗糖2(^，瓊月旨6.5g，活性炭Ig，IBA 0.8mg，IAA 0.3mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22± 2 °C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間90天。
[0043](8)煉苗移栽
[0044]在生根培養(yǎng)基中根長(zhǎng)到2_3cm時(shí)，即可煉苗移栽。移栽前先將瓶苗置于溫室中馴化7天左右，打開(kāi)瓶蓋放置3天，用鑷子將苗輕輕取出，用溫水洗凈培養(yǎng)基后用I %的多菌靈浸泡4分鐘，栽入育苗穴盤(pán)中，移栽組培苗基質(zhì)比例為草炭土:珍珠巖為5:1，澆透水，用塑料薄膜遮陽(yáng)3-5天。
[0045](9)染色體檢測(cè)
[0046]選取經(jīng)過(guò)秋水仙素處理過(guò)高山杜鵑“紅粉佳人”植株的莖尖和根尖，通過(guò)顯微鏡觀察染色體數(shù)目，篩選加倍的植株。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將高山杜鵑“紅粉佳人”外植體消毒后轉(zhuǎn)接到愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； (2)使用化學(xué)試劑秋水仙素處理愈傷組織，實(shí)現(xiàn)染色體加倍； (3)將經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑秋水仙素處理愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)； (4)將分化出的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)； (5)經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的健壯良好組培苗接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； (6)選擇根系長(zhǎng)到2-3cm的生根苗進(jìn)行煉苗，用草炭土和珍珠巖配成的混合基質(zhì)； (7)煉苗移栽后在顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，篩選出染色體加倍后的植株苗。2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(I)中所述的外植體消毒的方法:用質(zhì)量濃度75%的酒精處理外植體30S，用無(wú)菌水沖洗4-5遍，再用質(zhì)量濃度0.1 %的氯化汞處理I分鐘； 所述的愈傷組織培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、2-1p 6mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22±2°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30天。3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(2)具體過(guò)程為:愈傷組織經(jīng)過(guò)質(zhì)量濃度0.05 %的秋水仙素處理24h，用無(wú)菌水沖洗4次； 步驟(3)中所述的不定芽培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g、瓊脂6.5g、TDZ 0.1mg、2-1p Img，定容水至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22±2°C，光照強(qiáng)度3500 Iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(4)中所述的增殖培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、2-1p 3mg、NAA 0.5mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4，培養(yǎng)溫度22 土 2°C，光照強(qiáng)度3500Iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(5)生根培養(yǎng)基，由以下方法制備所得:230ml的WPM培養(yǎng)基中，添加蔗糖20g、瓊脂粉6.58、活性炭18、18六0.8mg，用純凈水定容至I升，調(diào)整pH值5.4;其中￥?1培養(yǎng)基中順4勵(lì)3、(NH4)2S04、MgS04.7H20、KH2P04、KN03、K2S04 量減少一半；培養(yǎng)溫度 22±2°C，光照強(qiáng)度3500 Iux，培養(yǎng)時(shí)間90天。6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(6)中所述的混合基質(zhì)，包括重量比為5:1的草炭土和珍珠巖。7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I中所述的一種高山杜鵑“紅粉佳人”染色體加倍方法，其特征在于，步驟(7)具體的過(guò)程為:選擇植株的莖尖和根尖，做好切片，在顯微鏡下觀察染色體加倍情況。
【文檔編號(hào)】A01H1/08GK105850737SQ201610218315
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月8日
【發(fā)明人】蔣淑磊, 李志斌, 白霄霞, 李國(guó)松, 趙玉芬, 李振勤, 徐立軍, 邊光亞, 李燕, 趙儒丹
【申請(qǐng)人】石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院