一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型的建立，具體為伴有肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等特征的由高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型的建立。本發(fā)明選用C57BL/6小鼠，隨機(jī)分模型組和對(duì)照組，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，模型組給予高脂飼料，對(duì)照組給予對(duì)照飼料，期間每周測(cè)量體重一次，10周后取血處死，檢測(cè)常規(guī)血脂及肝功能；取鮮活肝測(cè)定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做進(jìn)行H.E.和油紅O染色，判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。本發(fā)明采用高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，建立小鼠NAFLD模型，能展現(xiàn)出典型的NAFLD損害，并伴有肥胖，血脂異常和胰島素抵抗等典型特征，不僅為研究其發(fā)病機(jī)制提供了方便，還能控制條件排除各種干擾，免除對(duì)人體的傷害，以提高復(fù)制成功率和縮短病程。
【專利說(shuō)明】
一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動(dòng)物模型的建立，具體為伴有肥胖、血脂異 常和胰島素抵抗等特征的由高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 21世紀(jì)以來(lái)，肥胖和與之相關(guān)的并發(fā)癥已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界最流行和最具挑戰(zhàn)性的疾 病之一。肥胖所引起的代謝綜合征，包括高脂血癥，高胰島素血癥，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和脂 肪肝等，其中脂肪肝又是代謝障礙疾病的綜合表現(xiàn)。
[0003] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的主要特征是肝臟中的脂質(zhì)沉積，通常還會(huì)伴有肥胖、 胰島素抵抗、高血壓和血脂異常。流行病學(xué)觀察NAFLD在世界各地呈現(xiàn)出日益增多的趨勢(shì)， 在西方國(guó)家中被認(rèn)為是最普遍的肝臟疾病，大約影響了四分之一人口的身體健康。而近年 來(lái)，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的不合理，脂肪肝的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。
[0004] NAFLD作為一類代謝功能障礙型疾病，其病情演變和發(fā)展時(shí)間漫長(zhǎng)，這很大程度上 掣肘了人們得到具有合理解釋性的臨床數(shù)據(jù)。為了更全面了解NAFLD的發(fā)生過(guò)程，人們逐漸 將注意力轉(zhuǎn)至發(fā)展合適的動(dòng)物模型方向來(lái)探明NAFLD形成過(guò)程。建立一個(gè)穩(wěn)定可靠、病理演 變過(guò)程符合的NAFLD動(dòng)物模型，對(duì)研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制及治療方法具有極其重要的意義。
[0005] 非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型大體上可分為兩大類：即影響肝內(nèi)脂肪酸代謝的基因敲 除、突變模型以及環(huán)境因素(飲食與藥物)造成肝內(nèi)脂肪酸合成和氧化不平衡引發(fā)的脂肪肝 模型。前者更側(cè)重于研究具有家族史性的肝脂代謝異常，而后者更突出后天獲得性的肝脂 病變。總之，一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)是:①形成率高，死亡率低，重復(fù)性好;②造模方法簡(jiǎn)便 易行;③與所研究人類疾病特征相似;④病變有一定發(fā)展過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種利用C57BL/6小鼠建立經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)的同時(shí)伴有肥胖、血脂異 常和胰島素抵抗等特征的非酒精性脂肪肝病模型的方法。
[0007] 本發(fā)明選用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，所有小鼠用普通維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后， 在分組上，模型組與對(duì)照組均采取正態(tài)分布分組方法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為 高、中、低三個(gè)體重區(qū)間，將每個(gè)區(qū)間隨機(jī)分配到模型組和對(duì)照組中，模型組和對(duì)照組，每組 8只，模型組喂食高脂飼料，對(duì)照組喂食對(duì)照飼料，在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼 料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較小的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒。墊 料為刨花木肩，里面含有小木塊(利于小鼠磨牙），要求高壓滅菌，期間每周測(cè)量體重一次。 10周后取血處死，檢測(cè)常規(guī)血脂(TC、TG、FFA)及肝功能(ALT和AST);取鮮活肝組織勻漿，測(cè) 定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做石蠟、冰凍切片，分別進(jìn)行H.E.和油紅0染 色，判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。
[0008] 本發(fā)明中使用單純性高脂高熱量飼料誘導(dǎo)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠，建立非酒精性脂肪 肝模型，完全模擬由于飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致的人類非酒精性脂肪病，對(duì)于探究人類 NAFLD發(fā)病機(jī)理及其應(yīng)對(duì)方法有著重要的意義。同時(shí)C57BL/6小鼠為近交系小鼠，遺傳背景 高度相似，在一定程度上保證了模型的穩(wěn)定性。
[0009] 本發(fā)明中非酒精性脂肪肝小鼠模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括體重變化指標(biāo)，葡萄糖耐受檢 測(cè)，血清肝功的檢測(cè)，肝臟脂質(zhì)水平的檢測(cè)，以及肝臟組織病理學(xué)的觀測(cè)等。
[0010] 本發(fā)明采用高脂高熱量飼料(HFD)喂養(yǎng)，建立小鼠NAFLD模型，這種模型能展現(xiàn)出 典型的NAFLD損害，并伴有肥胖，血脂異常和胰島素抵抗等典型特征，不僅為研究其發(fā)病機(jī) 制提供了方便，還能控制條件排除各種干擾，免除對(duì)人體的傷害，以提高復(fù)制成功率和縮短 病程。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1模型組和對(duì)照組小鼠體重變化曲線圖，（Con:對(duì)照組;Mod:模型組）；
[0012] 圖2模型組和對(duì)照組小鼠造模10周后葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)曲線圖，（Con:對(duì)照組;Mod: 模型組）；
[0013]圖3模型組小鼠肝臟病理切片圖(A: H. E.染色;B:油紅0染色）；
[0014]圖4對(duì)照組小鼠肝臟病理切片圖（a:H.E.染色;b:油紅0染色）。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1本發(fā)明動(dòng)物模型的制備。
[0016] 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重（22 ± 2) g，購(gòu)自北京維通利 華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
[0017] 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境內(nèi)，溫度22~25°C，濕度50%，12小時(shí)晝夜交 替。
[0018] 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在分組上模型組與對(duì)照組均采取正態(tài)分布分組 方法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為高、中、低三個(gè)體重區(qū)間，將每個(gè)區(qū)間隨機(jī)分配到 模型組和對(duì)照組中，模型組和對(duì)照組，每組8只，模型組喂食高脂飼料，對(duì)照組喂食對(duì)照飼 料，在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較 小的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒。墊料為刨花木肩，里面含有小木塊(利于小鼠磨 牙），要求高壓滅菌，動(dòng)物飼料為對(duì)照飼料(MD12031)和高脂飼料(MD12032)均購(gòu)自江蘇美迪 森生物醫(yī)藥有限公司。造模10周，期間自由引水，水源為SPF級(jí)的滅菌水，每周稱量體重一 次。
[0019] 4、小鼠體重變化如圖1所示，可見(jiàn)模型組小鼠出現(xiàn)類似人類的肥胖癥狀。
[0020] 5、小鼠處死前一天，先禁食6小時(shí)，各組每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡萄糖后，在 0min、30min、60min、90min、120min，定時(shí)從尾靜脈取血用歐姆龍血糖儀和試紙條測(cè)定血糖， 繪制藥物對(duì)血糖影響曲線。如圖2所示，模型組小鼠血糖在第30min是達(dá)到最高峰，且顯著大 于對(duì)照組小鼠，可以判斷模型組出現(xiàn)較大程度的胰島素耐受境況。
[0021] 6、各組同一時(shí)間全部處死，處死前禁食12小時(shí)。4%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼 球法取血，過(guò)程應(yīng)避免溶血的發(fā)生，全血37°C靜置1小時(shí)，2000g，離心5min取血清，-80 °C保 存，用于血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果如表1所示。
[0022]表1血清生化指標(biāo)的測(cè)定
[0024]注：*p〈0.05vs control，**p〈0.01vs control
[0025] 7、肝臟脂質(zhì)的檢測(cè)，具體方法以一只小鼠為例，分別各取lOOmg新鮮肝組織根據(jù)試 劑盒自帶裂解液各加lml進(jìn)行勻漿，各自勻漿液一部分用來(lái)檢測(cè)甘油三酯(TG)和總膽固醇 (TC)的含量，另一部分分別測(cè)定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來(lái)校正甘油三酯 (TG)和總膽固醇。甘油三酯（組織)酶法測(cè)定試劑盒(E1013)和總膽固醇（組織)含量測(cè)定試 劑盒(E1015)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。結(jié)果如表2所示 [0026]表2肝臟脂質(zhì)變化表
[0028]注：*p〈0.05vs control，**p〈0.01vs control
[0029] 8、肝臟組織病理學(xué)的檢測(cè)，具體方法以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份。
[0030] 8a、肝組織石蠟切片制作方法:肝組織-Bouin's固定液固定24h-70%酒精溶液 脫色3次(可長(zhǎng)久保存)-依次經(jīng)濃度為80 %、90 %、95 %、100 %酒精梯度脫水-兩次二甲苯 脫酒精-二次石錯(cuò)透明-包埋-組織塊凝固-切片機(jī)切片(4ym)。
[0031] 8b、石蠟切片進(jìn)行常規(guī)H.E.染色。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水(依次經(jīng)過(guò)如下溶液：二甲 苯X2,無(wú)水乙醇X2,95%乙醇X2,90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，50%乙醇，30%乙醇，蒸 餾水X 2，每組溶液浸泡2min);蘇木素染色15min，鹽酸-乙醇分色數(shù)秒，弱堿水返藍(lán)數(shù)秒，水 洗;再經(jīng)伊紅染色5min，流水沖洗5min X 2，常規(guī)脫水透明（與上述脫蠟步驟反序操作）。中性 樹(shù)膠封片，干燥過(guò)夜后，顯微鏡下觀察并記錄。
[0032] 8c、肝組織冰凍切片制作方法：肝組織-4%多聚甲醛固定液固定24h-依次經(jīng) 10 %、20 %、30 %蔗糖溶液(4 %多聚甲醛溶液配)沉底脫水-0. C. T.包埋-液氮速凍-脫模 -調(diào)節(jié)低溫恒冷切片機(jī)倉(cāng)內(nèi)溫度至_22°C-切片（10M1)。
[0033] 8 d、冰凍切片油紅0染色方法：冰凍切片于4 °C P B S溶液中固定3 0 m i n，復(fù)性平衡。 60 %異丙醇媒浸2min，油紅染液60 °C染色20min，70 %乙醇分色數(shù)秒，PBS漂洗3次，蘇木精復(fù) 染細(xì)胞核，甘油明膠封片，干燥過(guò)夜后，顯微鏡下觀察并記錄。
[0034] H.E染色顯示，對(duì)照組肝組織形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，質(zhì)核飽滿（圖4a);模型組肝組織 形態(tài)全無(wú)，脂肪嚴(yán)重變性，脂滴大泡和小泡交錯(cuò)，細(xì)胞核被擠到邊緣（圖3a)。油紅0顯示，對(duì) 照組脈管周圍有少量脂質(zhì)浸潤(rùn)（圖4b)，這或許與對(duì)照飼料含有10%脂肪含量有關(guān);模型組 視野被大片的紅色占據(jù)，有大量脂質(zhì)囤積，脂滴大而密（圖3b)驗(yàn)證了 H.E的結(jié)果。
[0035]綜上所述，利用C57BL/6小鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)成功建立了伴有肥胖、血脂異常、胰島素 抵抗特征的非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型。為研究NAFLD發(fā)病機(jī)理和治療提供了一個(gè)穩(wěn)定可 靠的動(dòng)物模型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法，其特征在于，建立模型的步驟為： 1) 、選取鼠種：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重22±2g，飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境 內(nèi)，溫度22~25°C，濕度50%，12小時(shí)晝夜交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周； 2) 、分組與造模:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在分組上模型組與對(duì)照組均采取正態(tài)分布分組方 法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為高、中、低三個(gè)體重區(qū)間，將每個(gè)區(qū)間隨機(jī)分配到模 型組和對(duì)照組中，模型組和對(duì)照組，每組8只，模型組喂食高脂飼料，對(duì)照組喂食對(duì)照飼料， 在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較小 的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒，墊料為刨花木肩，里面含有小木塊，要求高壓滅菌， 造模10周，期間自由引水，水源為SPF級(jí)的滅菌水，每周稱量體重一次； 3) 、確定小鼠狀況:小鼠處死前一天，先禁食6小時(shí)，各組每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡 萄糖后，在〇111；[11、3〇1]1；[11、6〇1]1；[11、9〇1]1；[11、12〇1]1；[11，定時(shí)從尾靜脈取血測(cè)定血糖，繪制藥物對(duì)血 糖影響曲線，模型組小鼠血糖在第30min是達(dá)到最高峰，且顯著大于對(duì)照組小鼠，可以判斷 模型組出現(xiàn)較大程度的胰島素耐受境況； 4) 、采血與檢測(cè)：各組同一時(shí)間全部處死，處死前禁食12小時(shí)，4%水合氯醛腹腔注射麻 醉，摘眼球法取血，過(guò)程應(yīng)避免溶血的發(fā)生，全血37 °C靜置1小時(shí)，2000g，離心5min取血清，-80°C保存，用于血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)； 5) 、肝臟脂質(zhì)的檢測(cè)：各組以一只小鼠為例，分別各取100mg新鮮肝組織根據(jù)試劑盒自 帶裂解液各加lml進(jìn)行勻漿，各自勻漿液一部分用來(lái)檢測(cè)甘油三酯TG和總膽固醇TC的含量， 另一部分分別測(cè)定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來(lái)校正甘油三酯TG和總膽固醇 TC； 6) 、肝臟組織病理學(xué)的檢測(cè)：各組以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份，一份進(jìn)行 石蠟切片，并對(duì)其進(jìn)行H. E.染色，另一份進(jìn)行冰凍切片，并對(duì)其進(jìn)行油紅0染色； 7) 、對(duì)步驟3)-步驟6)進(jìn)行分析，確定利用C57BL/6小鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)成功建立了伴有肥 胖、血脂異常、胰島素抵抗特征的非酒精性脂肪肝病動(dòng)物模型。
【文檔編號(hào)】A23K20/163GK105850867SQ201610188042
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】劉慶平, 路遙, 王仁軍
【申請(qǐng)人】大連大學(xué)