一種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，步驟包括：A、選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種；B、對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料；C、在制種前一周停澆水、肥、藥，保持花梗干凈；D、花梗腋芽的誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)腋芽形成的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)；E、類原球體的誘導(dǎo)；F、類原球體的增殖；G、芽體的分化、壯苗及生根；本發(fā)明通過在蝴蝶蘭類原球莖體的誘導(dǎo)和增殖中關(guān)鍵階段運(yùn)用適當(dāng)?shù)牟僮鞴に?，從而達(dá)到快速誘導(dǎo)、增殖和分化成芽的目的，該發(fā)明的運(yùn)用有效地建立了的蝴蝶蘭品種的類原球莖體，通過類原球莖體的快速增殖從而達(dá)到蝴蝶蘭試管苗工廠化生產(chǎn)的開展。
【專利說明】
-種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速増殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物栽培及育苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速 增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝴蝶蘭(Phalaenopsis)屬蘭科多年生植物，是世界上栽培最廣泛、最普及的洋蘭 品種之一，由于其花大、色艷，開花期長達(dá)2~3個月，而素有"洋蘭皇后"的美稱。隨著近年來 蝴蝶蘭價格的降低，蝴蝶蘭更是成為普通市民年宵花優(yōu)選的盆花之一，銷量逐年增加。隨著 蝴蝶蘭品種的普及，市場對花色、品質(zhì)的要求越來越高，后代分離嚴(yán)重的播種苗已開始退出 市場，代之的是高品質(zhì)的、花色統(tǒng)一的無性苗。近幾年來流行和楊銷的品種有"大辣椒"、"紅 太陽"、"內(nèi)山姑娘"、"火鳥"、"紅龍"、"超群9號"等，而運(yùn)些品種無一不是通過花梗誘導(dǎo)而成 的組培苗栽培形成的。
[0003] 通過花梗誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，再通過側(cè)芽繁殖組培苗的方法有兩種途徑。一是通過側(cè) 芽誘導(dǎo)叢生芽生產(chǎn)，再通過芽生芽的方式進(jìn)行增殖，從而達(dá)到快繁的目的；二是通過花梗側(cè) 芽或葉片誘導(dǎo)類原球莖體(Protocorm-like bodies,簡稱化B)發(fā)生，再經(jīng)類原球莖體的增 殖、分化成苗，從而達(dá)到快繁的目的。通過芽生芽的方式繁殖速度較慢，且基部產(chǎn)生的褐化 物質(zhì)較多，制約著蝴蝶蘭無性繁殖速度；W無菌苗葉片作為外植體材料誘導(dǎo)類原球莖體的 途徑，在生產(chǎn)實(shí)際中也存在著一些技術(shù)難題，一是不同品種誘導(dǎo)類原球莖體的難易程度不 同，某些品種的葉片較易誘導(dǎo)類原球莖體，而某些品種很難誘導(dǎo);二是類原球莖體在生長過 程中極易形成單個芽體從而影響增殖速度;Ξ是產(chǎn)生褐化組織較多，抑制培養(yǎng)體的生產(chǎn)速 度甚至使之死亡。由于運(yùn)些問題的存在，極大地制約了蝴蝶蘭組培苗無性繁殖速度，從而影 響種苗工廠化生產(chǎn)的進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種操作簡單，產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)價值高的紫香蘭組培快繁方法。
[0005] 本發(fā)明目的通過W下技術(shù)方案來予W實(shí)現(xiàn)： 一種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，步驟包括： A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種，包括："大辣椒"、"紅太陽"、"內(nèi) 山姑娘"、"富樂夕陽"、"沙拉黃金"、"小白兔"等品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停誘水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗蔽芽的誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)； E、 類原球體的誘導(dǎo)； F、 類原球體的增殖； G、 芽體的分化、壯苗及生根； 所述步驟D具體包括； (1) 采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花薩按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘;在潔凈工作臺上，用刀片小屯、去除所述花梗節(jié) 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每 一段包含一個節(jié)位;將所述花梗節(jié)段放入0.10%升隸溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷 搖動;然后將所述花梗節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘；后浸入無菌水中備 用； (2) 將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升隸侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上;每瓶1個莖段； (3) 培養(yǎng)條件:前7~14 d黑暗培養(yǎng)，溫度24~26°C; 10 d后，光強(qiáng)提到12.5~18.75皿〇1· nf2.s-i，繼續(xù)培養(yǎng)20~30 d; 所述步驟G具體為:當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將 類原球莖體轉(zhuǎn)移到芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10% +馬鈴馨泥3~ 5%+白糖2.5~3%;抑值為5.4~5.6;每30~40 d繼代培養(yǎng)一次;所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并 長出芽體，將所述芽體切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；當(dāng)芽體生長出兩片葉， 并且每片葉大小在IcmW上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中；不達(dá)標(biāo)的植株在 分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度31.25~37.5皿〇1 ·πΓ2 · S-1，光照時間12 h · d -1，溫度為24~28°C;生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出^2條根系，并且生長較為健 壯時，可W出瓶種植。
[0006] 所述步驟E具體為：當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至 1.0-1.5 cm芽體時，將所述芽體的頂端去掉，切割部位位于所述芽體中屯、生長點(diǎn)W下0~ 0.2cm的位置，目的是破壞所述芽體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所 述幼嫩組織周邊產(chǎn)生；去除所述花?；亢只牟糠?，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的 所述芽體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為:前7~14天黑暗培養(yǎng);待新鮮切面開始膨大時，將 光照強(qiáng)度調(diào)到5~12.5皿〇1 ·πΓ2 · S-1，光照時間12 h· cfi，溫度為24~26°C ;培養(yǎng)周期20~25天； 所述芽體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10~15天左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染 黑，此時將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng)瓶中的不同培養(yǎng)基表面上，每5~10 d變換一個區(qū)域，W 減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害；如此重復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì) 時，將所述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約30~40左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球 莖體。
[0007] 所述步驟F具體為：當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述 類原球莖體的組織塊切下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中屯、生 長點(diǎn)部位約±0.2cm的位置切去頂部，目的是破壞所述類原球莖體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴 露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。將帶有新鮮切面的所述類原球莖體 放入一級增殖培養(yǎng)基中，所述一級增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，并在每分鐘60~120次轉(zhuǎn)速的 搖床上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5~10 d，使所述類原球體的表面充分吸收到營養(yǎng)并且減少后期培養(yǎng)中褐化 組織的產(chǎn)生。之后將所述類原球莖體轉(zhuǎn)入二級增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20~25 d，此時可見所 述類原球莖體在幼嫩切面上及周圍長出數(shù)個大小不等的新的類原球莖體。當(dāng)所述新的類原 球莖體直徑長到0.4~0.5cm大小時，將所述新的類原球莖體頂端去掉，切割深度達(dá)到生長點(diǎn) 部位約±0.2cm位置，并且連同所述的類原球莖體一起轉(zhuǎn)入所述一級增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行液 體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入所述二級增殖培養(yǎng)基中，液體和固體培養(yǎng)基反復(fù)培養(yǎng)，繼代周期30~ 35 d。如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖體;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度18.75~25 μπιο? ·πΓ2· s-i，光照時間12 h · d-i，溫度為24~28°C。
[000引所述一級增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+BA^5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L +挪子水50~150ml/L+白糖25g/L。
[0009] 所述二級增殖培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，成分為：1/2MS+BA1~5mg/L +KT 0.5~3 mg/L +NAA0.^0.5 mg/L + 挪子水50~150ml/L+白糖25g/L+瓊脂5.5g/L。
[0010] 本發(fā)明的有益效果:在花梗芽誘導(dǎo)形成后或在類原球體形成后，切割位置位于生 長點(diǎn)部位，目的是破壞具有頂端優(yōu)勢的生長點(diǎn)組織，促使生長點(diǎn)周圍幼嫩組織細(xì)胞增殖，從 而誘導(dǎo)新的或更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。蝴蝶蘭叢生芽或類原球莖體在 誘導(dǎo)階段和增殖階段均易于產(chǎn)生褐化組織，通過前期暗培養(yǎng)和快速變換芽體或類原球莖體 位置的方法，有利于減少褐化物質(zhì)的產(chǎn)生，避免芽體或類原球莖體受到褐化物質(zhì)的浸害。
[0011] 本發(fā)明通過在蝴蝶蘭類原球莖體的誘導(dǎo)和增殖中關(guān)鍵階段運(yùn)用適當(dāng)?shù)牟僮鞴に嚕?從而達(dá)到快速誘導(dǎo)、增殖和分化成芽的目的，該發(fā)明的運(yùn)用有效地建立了的蝴蝶蘭品種的 類原球莖體，通過類原球莖體的快速增殖從而達(dá)到蝴蝶蘭試管苗工廠化生產(chǎn)的開展。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[oou]實(shí)施例一 A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種，包括："大辣椒"、"紅太陽"、"內(nèi) 山姑娘"、"富樂夕陽"、"沙拉黃金"、"小白兔"等品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停誘水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗蔽芽的誘導(dǎo)： (1) 采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花薩按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘。在潔凈工作臺上，用刀片小屯、去除所述花梗節(jié) 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每 一段包含一個節(jié)位。將所述花梗節(jié)段放入0.10%升隸溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷 搖動。然后將所述花梗節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘。后浸入無菌水中備 用； (2) 將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升隸侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上。每瓶1個莖段。（3) 培養(yǎng)條件:前7 d黑暗培養(yǎng)，溫度24~26°C;10 d后，光強(qiáng)提到12.5~18.75μπιο1·πΓ2·3-ι^0? 續(xù)培養(yǎng)20~30 d; E、 類原球體的誘導(dǎo)： 當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至1.0-1.5 cm芽體時，將所述 芽體的頂端去掉，切割部位位于所述芽體中屯、生長點(diǎn)或W下0cm的位置，目的是破壞所述芽 體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。去除所述 花梗基部褐化的部分，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的所述芽體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)條件為：前7 d黑暗培養(yǎng)。待新鮮切面開始膨大時，將光照強(qiáng)度調(diào)到扣πιο1·πΓ2·3-ι，光照 時間12 h · cfi，溫度為24~26°C。培養(yǎng)周期20~25 d。所述芽體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10~ 15 d左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染黑，此時將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng)瓶中 的不同培養(yǎng)基表面上，每5 d變換一個區(qū)域，W減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害。如此 重復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì)時，將所述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約30~ 40 d左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球莖體。
[0014] F:原球體的增殖： 當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述類原球莖體的組織塊切 下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中屯、生長點(diǎn)部位約±0.2cm的位 置切去頂部，目的是破壞所述類原球莖體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖 體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。將帶有新鮮切面的所述類原球莖體放入一級增殖培養(yǎng)基中， 一級增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一級增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，并在每分鐘60~120次轉(zhuǎn)速的搖床 上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5~10 d，使所述類原球體的表面充分吸收到營養(yǎng)并且減少后期培養(yǎng)中褐化組織 的產(chǎn)生。之后將所述類原球莖體轉(zhuǎn)入二級增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20~25 d，二級增殖培養(yǎng)基 為固體培養(yǎng)基，成分為：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+瓊脂5.5g/L。此時可見所述類原球莖體在幼嫩切面上及周圍長出數(shù)個 大小不等的新的類原球莖體。當(dāng)所述新的類原球莖體直徑長到0.4~0.5cm大小時，將所述新 的類原球莖體頂端去掉，切割深度達(dá)到生長點(diǎn)部位約± 0.2cm位置，并且連同所述的類原球 莖體一起轉(zhuǎn)入所述一級增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入所述二級增殖培養(yǎng)基 中，液體和固體培養(yǎng)基反復(fù)培養(yǎng)，繼代周期30~35 d。如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖 體;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。
[0015] G、芽體的分化、壯苗及生根： 當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將類原球莖體轉(zhuǎn)移到 芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10%+馬鈴馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 為5.4~5.6。每30~40 d繼代培養(yǎng)一次。所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并長出芽體，將所述芽體 切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。當(dāng)芽體生長出兩片葉，并且每片葉大小在1cm W上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。不達(dá)標(biāo)的植株在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。 生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出1~2條根系，并且生長較為健壯時，可W出瓶種 植。
[0016] 實(shí)施例二 A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種，包括："大辣椒"、"紅太陽"、"內(nèi) 山姑娘"、"富樂夕陽"、"沙拉黃金"、"小白兔"等品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停誘水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗蔽芽的誘導(dǎo)： (1)采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花薩按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘。在潔凈工作臺上，用刀片小屯、去除所述花梗節(jié) 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每 一段包含一個節(jié)位。將所述花梗節(jié)段放入0.10%升隸溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷 搖動。然后將所述花梗節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘。后浸入無菌水中備 用； (2)將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升隸侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上。每瓶1個莖段。（3) 培養(yǎng)條件：前10 d黑暗培養(yǎng)，溫度24~26°C;10 d后，光強(qiáng)提到12.5~18.75皿〇1-111^，3^， 繼續(xù)培養(yǎng)20~30 d; E.類原球體的誘導(dǎo)： 當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至1.0-1.5 cm芽體時，將所述 芽體的頂端去掉，切割部位位于所述芽體中屯、生長點(diǎn)W下0.1cm的位置，目的是破壞所述芽 體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。去除所述 花梗基部褐化的部分，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的所述芽體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)條件為:前10 d黑暗培養(yǎng)。待新鮮切面開始膨大時，將光照強(qiáng)度調(diào)到10 μπιο1·πΓ2·3-ι，光 照時間12 h · cfi，溫度為24~26°C。培養(yǎng)周期20~25 d。所述芽體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10 ~15 d左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染黑，此時將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng)瓶 中的不同培養(yǎng)基表面上，每7 d變換一個區(qū)域，W減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害。如 此重復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì)時，將所述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約30 ~40 d左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球莖體。
[0017] F、類原球體的增殖： 當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述類原球莖體的組織塊切 下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中屯、生長點(diǎn)部位約±0.2cm的位 置切去頂部，目的是破壞所述類原球莖體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖 體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。將帶有新鮮切面的所述類原球莖體放入一級增殖培養(yǎng)基中， 一級增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一級增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，并在每分鐘60~120次轉(zhuǎn)速的搖床 上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5~10 d，使所述類原球體的表面充分吸收到營養(yǎng)并且減少后期培養(yǎng)中褐化組織 的產(chǎn)生。之后將所述類原球莖體轉(zhuǎn)入二級增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20~25 d，二級增殖培養(yǎng)基 為固體培養(yǎng)基，成分為：1/2MS+BA1~5mg/L+KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+瓊脂5.5g/L。此時可見所述類原球莖體在幼嫩切面上及周圍長出數(shù)個 大小不等的新的類原球莖體。當(dāng)所述新的類原球莖體直徑長到0.4~0.5cm大小時，將所述新 的類原球莖體頂端去掉，切割深度達(dá)到生長點(diǎn)部位約± 0.2cm位置，并且連同所述的類原球 莖體一起轉(zhuǎn)入所述一級增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入所述二級增殖培養(yǎng)基 中，液體和固體培養(yǎng)基反復(fù)培養(yǎng)，繼代周期30~35 d。如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖 體;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。
[0018] G、芽體的分化、壯苗及生根： 當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將類原球莖體轉(zhuǎn)移到 芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10%+馬鈴馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 為5.4~5.6。每30~40 d繼代培養(yǎng)一次。所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并長出芽體，將所述芽體 切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。當(dāng)芽體生長出兩片葉，并且每片葉大小在1cm W上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。不達(dá)標(biāo)的植株在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。 生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出1~2條根系，并且生長較為健壯時，可W出瓶種 植。
[0019] 實(shí)施案例立 A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種，包括："大辣椒"、"紅太陽"、"內(nèi) 山姑娘"、"富樂夕陽"、"沙拉黃金"、"小白兔"等品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停誘水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗蔽芽的誘導(dǎo)： (1) 采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花薩按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘。在潔凈工作臺上，用刀片小屯、去除所述花梗節(jié) 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每 一段包含一個節(jié)位。將所述花梗節(jié)段放入0.10%升隸溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷 搖動。然后將所述花梗節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘。后浸入無菌水中備 用； (2) 將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升隸侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上。每瓶1個莖段。
[0020] (3)培養(yǎng)條件：前14 d黑暗培養(yǎng)，溫度24~26°C; 10 d后，光強(qiáng)提到12.5~18.75μ mol · πΓ2 · S-1，繼續(xù)培養(yǎng)20~30 d; E、 類原球體的誘導(dǎo)： 當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至1.0-1.5 cm芽體時，將所述 芽體的頂端去掉，切割部位位于所述芽體中屯、生長點(diǎn)W下0.2cm的位置，目的是破壞所述芽 體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。去除所述 花梗基部褐化的部分，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的所述芽體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)條件為:前14 d黑暗培養(yǎng)。待新鮮切面開始膨大時，將光照強(qiáng)度調(diào)到12.5皿ο1·πΓ2·3^ι， 光照時間12 h-cfi，溫度為24~26Γ。培養(yǎng)周期20~25 d。所述芽體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約 10~15 d左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染黑，此時將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng) 瓶中的不同培養(yǎng)基表面上，每10 d變換一個區(qū)域，W減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害。 如此重復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì)時，將所述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約 30~40 d左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球莖體。
[0021] F、類原球體的增殖： 當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述類原球莖體的組織塊切 下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中屯、生長點(diǎn)部位約±0.2cm的位 置切去頂部，目的是破壞所述類原球莖體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖 體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。將帶有新鮮切面的所述類原球莖體放入一級增殖培養(yǎng)基中， 一級增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+BA1 ~5 mg/L+KT 0.5~3 mg/L +NAA0.1 ~0.5 mg/L + 挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L。所述一級增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，并在每分鐘60~120次轉(zhuǎn)速的搖床 上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5~10 d，使所述類原球體的表面充分吸收到營養(yǎng)并且減少后期培養(yǎng)中褐化組織 的產(chǎn)生。之后將所述類原球莖體轉(zhuǎn)入二級增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20~25 d，二級增殖培養(yǎng)基 為固體培養(yǎng)基，成分為：1/2MS+BA1~5mg/L +KT0.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +挪子水50~ 150ml/L+白糖25g/L+瓊脂5.5g/L。此時可見所述類原球莖體在幼嫩切面上及周圍長出數(shù)個 大小不等的新的類原球莖體。當(dāng)所述新的類原球莖體直徑長到0.4~0.5cm大小時，將所述新 的類原球莖體頂端去掉，切割深度達(dá)到生長點(diǎn)部位約± 0.2cm位置，并且連同所述的類原球 莖體一起轉(zhuǎn)入所述一級增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入所述二級增殖培養(yǎng)基 中，液體和固體培養(yǎng)基反復(fù)培養(yǎng)，繼代周期30~35 d。如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖 體;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度18.75~25皿〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。
[0022] G、芽體的分化、壯苗及生根： 當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將類原球莖體轉(zhuǎn)移到 芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10%+馬鈴馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 為5.4~5.6。每30~40 d繼代培養(yǎng)一次。所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并長出芽體，將所述芽體 切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。當(dāng)芽體生長出兩片葉，并且每片葉大小在1cm W上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。不達(dá)標(biāo)的植株在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。 生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出1~2條根系，并且生長較為健壯時，可W出瓶種 植。
[0023] 對比例1 A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種，包括："大辣椒"、"紅太陽"、"內(nèi) 山姑娘"、"富樂夕陽"、"沙拉黃金"、"小白兔"等品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停誘水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗蔽芽的誘導(dǎo)： (1) 采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花薩按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘。在潔凈工作臺上，用刀片小屯、去除所述花梗節(jié) 位上蔽芽的外巷片，并用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每 一段包含一個節(jié)位。將所述花梗節(jié)段放入0.10%升隸溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷 搖動。然后將所述花梗節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘。后浸入無菌水中備 用； (2) 將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升隸侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)蔽芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上。每瓶1個莖段。（3) 培養(yǎng)條件，自然光照，溫度24~26°(：;10(1后，光強(qiáng)改為12.5~18.75皿〇1-111-2*3-1，繼續(xù)培 養(yǎng)20~30 d; E、 類原球體的誘導(dǎo)： 當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至1.0-1.5 cm芽體時，將所述 芽體的頂端去掉，切割部位位于所述芽體中屯、生長點(diǎn)W下3cm的位置，目的是破壞所述芽體 的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。去除所述花 ?；亢只牟糠?，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的所述芽體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 條件為：自然光照培養(yǎng)。待新鮮切面開始膨大時，將光照強(qiáng)度調(diào)到25μπιο1 ·πΓ2 · s^i，光照時 間12 h · cfi，溫度為24~26°C。培養(yǎng)周期20~25 d。所述芽體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10~15 d左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染黑，此時將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng)瓶中的 不同培養(yǎng)基表面上，每5 d變換一個區(qū)域，W減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害。如此重 復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì)時，將所述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約30~40 d左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球莖體。
[0024] F:原球體的增殖： 當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述類原球莖體的組織塊切 下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中屯、生長點(diǎn)部位W下0cm的位置 切去頂部，目的是破壞所述類原球莖體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體 從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生。當(dāng)所述增殖培養(yǎng)基表面變色時，將所述類原球莖體轉(zhuǎn)移到同個 培養(yǎng)瓶中的不同培養(yǎng)基表面上，每5~7 d變換一個區(qū)域，W減少所述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的 浸害。培養(yǎng)周期30~35 d，如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖體。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度 18.75~25皿〇1.111-2.3-1，光照時間12}1.(1-1，溫度為24~28°(：。
[00巧]G、芽體的分化、壯苗及生根： 當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將類原球莖體轉(zhuǎn)移到 芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10%+馬鈴馨泥3~5%+白糖2.5~3%。抑值 為5.4~5.6。每30~40 d繼代培養(yǎng)一次。所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并長出芽體，將所述芽體 切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。當(dāng)芽體生長出兩片葉，并且每片葉大小在1cm W上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。不達(dá)標(biāo)的植株在分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度31.25~37.5 4111〇1-111-2*3-1，光照時間12}1'(1-1，溫度為24~28°(：。 生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出1~2條根系，并且生長較為健壯時，可W出瓶種 植。
[0026]將W上實(shí)施例培養(yǎng)的瓶苗1周后移至花盆栽培，通過W下表格對實(shí)施例中的結(jié)果 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和對比如下：
由實(shí)施例數(shù)據(jù)看w看出，經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)的蝴蝶蘭新苗較為健壯，煉苗后成活率高，與 對比例相比，實(shí)施例1-3與對比例相比有更多的類原球莖體從所述幼嫩組織周邊產(chǎn)生，并且 苗成活率較高，所W本發(fā)明具有極高的推廣價值。
[0027] W上所述并非對本新型的技術(shù)范圍作任何限制，凡依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對W上的 實(shí)施例所作的任何修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，其特征在于，步驟包括： A、 選用適合的蝴蝶蘭品種花梗作為作種的蝴蝶蘭品種； B、 對所述作種的蝴蝶蘭品種母株的花梗作為外植體材料； C、 在制種前一周停澆水、肥、藥，保持花梗干凈； D、 花梗腋芽的誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)腋芽形成的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)； E、 類原球體的誘導(dǎo)； F、 類原球體的增殖； G、 芽體的分化、壯苗及生根； 所述步驟D具體包括； (1) 采回的所述花梗，在自來水下沖洗干凈，并用濕脫脂棉花蘸按重量計(jì)的0.5%的洗衣 粉水輕擦表面，再在自來水下沖洗5~10分鐘；用刀片去除所述花梗節(jié)位上腋芽的外苞片，并 用75%的酒精輕擦表面，然后將所述花梗切割成l-2cm長度的莖段，每一段包含一個節(jié)位;將 所述花梗節(jié)段放入0.10%升汞溶液中進(jìn)行浸泡消毒8~10分鐘，并不斷搖動;然后將所述花梗 節(jié)段取出，在無菌水中漂洗4~5次，每次2~3分鐘;后浸入無菌水中備用； (2) 將消毒好的所述花梗節(jié)段切除兩頭受升汞侵害的部分，并將所述莖段的極性基部 插入誘導(dǎo)腋芽形成的培養(yǎng)基中，使節(jié)位上的芽點(diǎn)保留在培養(yǎng)基的表面上;每瓶1個莖段； (3) 培養(yǎng)條件:前7~14 d黑暗培養(yǎng)，溫度24~26°C;10 d后，光強(qiáng)提到12.5~18.75μπιο1·πι 一2.s-S繼續(xù)培養(yǎng)20~30 d; 所述步驟G具體為：當(dāng)所述類原球莖體在增殖培養(yǎng)基上增殖達(dá)到一定的庫存數(shù)量時，將 類原球莖體轉(zhuǎn)移到芽體分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為1/2MS +香蕉泥5~10% +馬鈴薯泥3~ 5%+白糖2.5~3%; pH值為5.4~5.6;每30~40 d繼代培養(yǎng)一次;所述類原球莖體的莖尖發(fā)芽并 長出芽體，將所述芽體切下繼續(xù)在所述分化培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；當(dāng)芽體生長出兩片葉， 并且每片葉大小在Icm以上時，從基部將植株切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件為:光照 強(qiáng)度31 · 25~37 · 5μπιο1 .m-2. s-1，光照時間12 h. d-1，溫度為24~28°C ;生根苗培養(yǎng)周期50~60 d，當(dāng)所述植株長出1~2條根系，并且生長較為健壯時，可以出瓶種植。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，其特征 在于:所述步驟E具體為：當(dāng)作為外植體的所述花梗莖段節(jié)位上的芽點(diǎn)萌發(fā)形成高至1.0-?. 5 cm 芽體時 ，將所述芽體的頂端去掉 ，切割部位位于所述芽體中 心生長點(diǎn)以下0~0. 2cm 的 位置，目的是破壞所述芽體的生長點(diǎn)使幼嫩組織暴露，誘導(dǎo)更多的類原球莖體從所述幼嫩 組織周邊產(chǎn)生;去除所述花梗基部褐化的部分，將連著所述花梗的帶有新鮮切面的所述芽 體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為:前7~14天黑暗培養(yǎng);待新鮮切面開始膨大時，將光照強(qiáng) 度調(diào)到1~12.5μπιο1.m- 2. s-1，光照時間12 h. d-1，溫度為24~26°C ;培養(yǎng)周期20~25天;所述芽 體塊在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10~15天左右，褐化物質(zhì)開始形成，并將培養(yǎng)基表面染黑，此時 將所述芽體轉(zhuǎn)移到同個培養(yǎng)瓶中的不同培養(yǎng)基表面上，每5~10 d變換一個區(qū)域，以減少所 述褐化物質(zhì)對培養(yǎng)材料的浸害;如此重復(fù)，直到整個培養(yǎng)基表面都有較多褐化物質(zhì)時，將所 述芽體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中，約30~40左右所述芽體切面上長出數(shù)個幼嫩的類原球莖體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，其特征 在于:所述步驟F具體為：當(dāng)所述類原球莖體長到高度達(dá)0.3~0.8 cm時，將帶有數(shù)個所述類 原球莖體的組織塊切下，去除周邊褐化組織及老的組織塊，并在所述類原球莖體中心生長 點(diǎn)部位約±0.2cm的位置切去頂部，將帶有新鮮切面的所述類原球莖體放入一級增殖培養(yǎng) 基中，所述一級增殖培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，并在每分鐘60~120次轉(zhuǎn)速的搖床上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5~ 10 d，之后將所述類原球莖體轉(zhuǎn)入二級增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20~25 d，此時可見所述類原 球莖體在幼嫩切面上及周圍長出數(shù)個大小不等的新的類原球莖體； 當(dāng)所述新的類原球莖體直徑長到〇. 4~0.5cm大小時，將所述新的類原球莖體頂端去掉， 切割深度達(dá)到生長點(diǎn)部位約±0.2cm位置，并且連同所述的類原球莖體一起轉(zhuǎn)入所述一級 增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入所述二級增殖培養(yǎng)基中，液體和固體培養(yǎng)基反 復(fù)培養(yǎng)，繼代周期30~35 d; 如此反復(fù)，直到獲得足夠的類原球莖體;培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度18.75~25 μπιο? · Hf2 · s-1，光照時間12 h · d-1，溫度為24~28°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，其特征 在于:所述一級增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+BA1~5 mg/L+KTO.5~3mg/L +NAA0.1~0.5 mg/L +椰子 水 50~150ml/L+白糖 25g/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的促使蝴蝶蘭類原球莖體快速增殖培養(yǎng)蝴蝶蘭的方法，其特征 在于：所述二級增殖培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，成分為：1/2MS+BA1~5mg/L+KT 0.5~3 mg/L + NAA0.1~0.5 mg/L + 椰子水50~150ml/L+白糖25g/L+瓊脂5.5g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK105875414SQ201610412905
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】陳春滿, 張善信
【申請人】陳春滿, 張善信