一種黃樟離體植株再生的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種黃樟離體植株再生的方法。所述的黃樟離體植株再生的方法包含如下步驟：(1)外植體采集，(2)腋芽誘導，(3)增殖培養(yǎng)，(4)生根培養(yǎng)，(5)煉苗與移栽，(6)移栽幼苗管理。本發(fā)明以生長速度快、干型通直、材性優(yōu)良、樟腦樟油含量高及抗逆性強的成年優(yōu)良單株為母本，以基部萌枝為外植體，通過基本培養(yǎng)基選擇、激素種類、濃度及其配比的篩選，建立其高效的離體植株再生快繁技術，達到增殖芽健壯伸長生長快、增值率高、生根率高、生根苗健壯、移栽成活率高的目的。
【專利說明】
一種黃樟離體植株再生的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種黃樟離體植株再生的方法。
【背景技術】
[0002]黃棒(Cinnamomumporrectum(Roxb.)Kosterm.)隸屬棒科(Lauraceae)棒屬(Cinnamomum)，成年樹高可達20m，胸徑40cm以上。黃樟產自我國廣州、廣西、福建、江西、湖南、貴州、四川、云南等地。巴基斯坦、印度經(jīng)馬來西亞至印度尼西亞也有黃樟分布。
[0003]黃樟為常綠喬木，其樹姿秀麗，主干明顯而通直光滑，生長快速，其胸徑年平均生長量比香樟大50%，材積大100%，是優(yōu)良的速生樹種。黃樟木材紋理通直，結構均勻細致，稍重而韌，易于加工，縱切面平滑，干燥后少開裂，且不變性，含油或粘液很豐富，各切面均極油潤，耐腐防蛀，且富有香氣，是一種貴重木材，也是造船、家具和工藝美術品的絕佳用材。黃樟枝繁葉茂，四季常青，耐修剪，可造型；葉片較大，葉色濃綠，有光澤，秋末時分有部分老葉呈桔紅色，較為美觀，是優(yōu)良的園林造景樹種，亦可作行道樹。黃樟樹冠高大，能遮陽蔽日，可滯塵吸音，凈化空氣，具有優(yōu)良的生態(tài)價值。黃樟的枝葉富含樟腦、樟油，是提制樟腦和蒸取樟油原材料。樟腦有興奮、強心、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、止咳、促滲等藥理作用，多用于醫(yī)藥上，樟油被廣泛應用于香料工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領域，隨著現(xiàn)代化工、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展進步，人們對天然樟腦、樟油的需求越來越大。
[0004]黃樟具有良好的材用、觀賞、生態(tài)和經(jīng)濟價值，近年栽培和造林面積不斷擴大。但目前黃樟人工栽培所用苗木都是采用種子苗造林，來自不同種源、家系種子的遺傳變異，導致黃樟苗木及其造林后的林分的生長速度、木材質量、精油含量等相差很大，從而影響到林地經(jīng)營的產量及經(jīng)濟效益。選擇優(yōu)良母本進行組培規(guī)模化育苗，實現(xiàn)良種無性化推廣是黃樟這一優(yōu)良樹種產業(yè)化開發(fā)的重要途徑。
[0005]目前，黃樟的組織培養(yǎng)技術未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術的不足和缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種黃樟離體植株再生的方法，該方法具有不定芽誘導快、增殖倍率高、芽粗壯伸長快、生根率高、生根苗根系發(fā)達健壯、移栽成活率高等特點。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法的應用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0009]—種黃樟離體植株再生的方法，包含如下步驟:
[0010](I)外植體采集:取黃樟樹干基部萌枝，作為外植體，然后消毒；
[0011](2)腋芽誘導:將步驟(I)消毒后的外植體接種到誘導培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，得到腋芽；
[0012](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的腋芽轉接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，得到增殖苗；
[0013](4)生根培養(yǎng):從步驟(3)培養(yǎng)得到的增殖苗中切取頂芽轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，得到組培生根苗；
[0014](5)煉苗與移栽:將步驟(4)培養(yǎng)得到的組培生根苗移到溫室煉苗移栽，得到容器苗；
[0015](6)移栽幼苗管理；
[0016]步驟(I)中所述的黃樟優(yōu)選為:干型通直圓滿、樹姿秀麗、生長速度快、富含樟腦和樟油、無病蟲害的優(yōu)良黃樟單株為母本；
[0017]步驟(I)中所述的黃樟優(yōu)選為種植時間不小于15年的黃樟；
[0018]步驟(I)中優(yōu)選對黃樟進行基部環(huán)割以促進基部萌枝；
[0019]步驟(I)中外植體采集前，優(yōu)選每隔7?1d用多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝4?5次；
[0020]步驟(I)中所述的外植體采集的時間優(yōu)選為秋季(9?11月)；
[0021]步驟(I)中所述的外植體優(yōu)選為:半木質化萌枝去葉后切成帶I?2個葉腋的莖段；
[0022]所述的莖段的長度優(yōu)選為2?4cm;
[0023]步驟(I)中所述的消毒的方式優(yōu)選為:將外植體清洗后，依次用新潔爾滅溶液、乙醇溶液和升汞溶液浸泡消毒并再次清洗；
[0024]步驟(I)中所述的消毒的方式進一步優(yōu)選為:
[0025]①將外植體用水清洗后，用體積分數(shù)為0.1 %的新潔爾滅溶液刷洗3?7min，再用無菌水沖洗I?2次；
[0026]②將步驟①中沖洗后的外植體用體積分數(shù)為70?75%的乙醇溶液浸泡20?30s，再用無菌水沖洗I?2次；
[0027]③將步驟②中沖洗后的外植體加入質量分數(shù)為0.05%?0.1 %的升汞溶液中浸泡3?1min，其間不斷搖動，再用無菌水沖洗5?6次;具體浸泡時間，依據(jù)外植體幼嫩程度確定；
[0028]步驟(2)中所述的消毒后的外植體優(yōu)選切除葉柄、莖段兩端受傷部位后，再接種到誘導培養(yǎng)基中；
[0029]步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)基包含MH基本培養(yǎng)基以及6-BA 0.1?1.0mg/L、NAA
0.01?0.lmg/L、鹿糖25?40g/L和卡拉膠7?8g/L，誘導培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0 ；
[0030]步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)的條件優(yōu)選為溫度為25±2°C，光照(60μπιΟ1.πΓ^s+1)時間為8?12h/d;
[0031]步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)的條件進一步優(yōu)選為溫度為25±2°C，光照(60μπιΟ1.πι—2.s—O 時間為12h/d;
[0032]步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)的時間優(yōu)選為20?30d；
[0033]步驟(3)中所述的腋芽的高度為不小于2cm;
[0034]步驟(3)中所述的腋芽優(yōu)選截成1.0?1.5cm的莖段再轉接到增殖培養(yǎng)基上；
[0035]步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)基包含MH基本培養(yǎng)基以及6-BA 0.5?2mg/L、KT 0.3?lmg/L,NAA 0.05?0.2mg/L、蔗糖25?40g/L和瓊脂5?6g/L，增殖培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0 ；
[0036]步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)的條件優(yōu)選為25±2°C，光照(60μπιο1.m—2.s—1)時間為8?12h/d;
[0037]步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)的條件進一步優(yōu)選為25±2°C，光照(60ymol.m—2.s一 O時間為12h/d;
[0038]步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)的的時間優(yōu)選為20?30d；
[0039]步驟(4)中所述的頂芽的長度優(yōu)選為2.0?3.0cm；
[0040]步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)基包含1/2MH基本培養(yǎng)基以及NAA0.1?0.5mg/L、蔗糖15?20g/L、瓊脂5?6g/L，生根培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0 ；
[0041 ]步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)的條件優(yōu)選為25 ± 2 °C，光照(60μπιοI.m—2.s—1)時間為8?12h/d;
[0042]步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)的條件進一步優(yōu)選為25±2°C，光照(60μηιο1.m—2.s一O時間為12h/d;
[0043 ]步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)的時間優(yōu)選為15?20d;
[0044]所述1/2MH基本培養(yǎng)基為將MH基本培養(yǎng)基中所含大量元素，包括NH4NO3、ΚΝ03、CaCl2.2H20、MgS04.7H20、KH2P04的用量減半，其余成分不變；
[0045]所述的MH基本培養(yǎng)基包含如下組分:
[0046]720mg/L NH4NO3、1800mg/L KN03、340mg/L CaCl2.2H20、200mg/L Ca(N03)2、370mg/L MgSO4.7H20、170mg/L KH2PO4、22.3mg/L MnSO4.4H20、8.6mg/L ZnSO4.7H20、6.2mg/L H3B03、0.83mg/L K1、0.25mg/L Na2Mo04.2H2CK0.025mg/L CuSCU.5出0、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4.7H20、37.3mg/L Na2.EDTA.H2O、lOOmg/L Myo-1nsitol (肌醇)、2.0mg/L Glycine(甘氨酸)、0.lmg/L Thiamine.HCl (維生素BI)、0.5mg/L Nicotinic.acid(煙酸)、0.5mg/L Pyridoxine.HCl(維生素B6)，MH基本培養(yǎng)基的pH為5.8;
[0047]步驟(5)所述的煉苗移栽的方式優(yōu)選為:將組培生根苗移到溫室中適應外界環(huán)境5?7d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗I?2d，將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到混合基質中，移栽完后淋透定根水；
[0048]所述的混合基質優(yōu)選為:泥炭土與珍珠巖按照體積比為3: I混合；
[0049]所述的混合基質使用前優(yōu)選用質量分數(shù)為I?2%。的高錳酸鉀滅菌；
[0050]步驟(6)中所述的移栽幼苗管理的方式優(yōu)選為:移栽后第一周采用蓋塑料膜保濕，隨后揭開薄膜，保持基質濕潤，空氣相對濕度在95%以上，控制培養(yǎng)溫度15?30°C，蔭棚用70%的遮光網(wǎng)遮光;在移栽后當天采用質量體積百分比濃度0.1 %的百菌清或多菌靈溶液噴施小苗，之后每隔7?10天噴霧一次;移栽后待幼苗生長穩(wěn)定，長出新芽和新根后，噴施質量體積百分比濃度I?2%。的復合肥，根據(jù)幼苗生長狀況，每隔7?10天噴施一次，并逐步增加光照強度，直到進行全光照常規(guī)管理；
[0051 ]本發(fā)明的原理:本發(fā)明以生長速度快、干型通直、材性優(yōu)良、樟腦樟油含量高及抗逆性強的成年優(yōu)良單株為母本，以基部萌枝為外植體，通過基本培養(yǎng)基選擇、激素種類、濃度及其配比的篩選，建立其高效的離體植株再生快繁技術，達到增殖芽健壯伸長生長快、增值率高、生根率高、生根苗健壯、移栽成活率高的目的。上述黃樟成年優(yōu)樹的高效離體植株再生方法，外植體的腋芽誘導率高達100%;增殖系數(shù)達10.5以上，增殖芽伸長生長快，培養(yǎng)20?30d芽高達3?4cm;生根率可達96%，平均根數(shù)為3.4根/株;組培生根苗健壯、移栽成活率高達93%。
[0052]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
[0053](I)本發(fā)明提供的黃樟離體植株再生的方法誘導速度快、誘導率高;殖系數(shù)大、叢芽粗壯、伸長生長快;生根率高，根系發(fā)達，生根苗粗壯、移栽成活率高，苗木生長健壯整齊。
[0054](2)本發(fā)明操作簡單，陳本低，易于大規(guī)模推廣使用，通過規(guī)?；?，將為我國黃樟優(yōu)良單株的無性化推廣提供技術支持，為提升黃樟人工林經(jīng)濟效益提供優(yōu)質種苗保障，有著極其重大的意義。
【附圖說明】
[0055]圖1是實施例1優(yōu)樹無菌材料的腋芽誘導的結果圖。
[0056]圖2是實施例1誘導腋芽形成的芽叢的形態(tài)圖。
[0057]圖3是實施例1增殖培養(yǎng)基中的增殖苗的形態(tài)圖。
[0058]圖4是實施例1生根培養(yǎng)基中的組培生根苗的形態(tài)圖。
[0059]圖5是實施例1生根培養(yǎng)基中的組培生根苗的根系形態(tài)圖。
[0060]圖6是實施例1生根移栽苗的形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0061]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0062]根據(jù)黃樟優(yōu)樹嫩枝的生理狀態(tài)、離體培養(yǎng)的營養(yǎng)需求設計MH基本培養(yǎng)基，以下實施例中涉及到的MH基本培養(yǎng)基的配方如下:
[0063]720mg/L NH4NO3、1800mg/L KN03、340mg/L CaCl2.2H20、200mg/L Ca(N03)2、370mg/L MgSO4.7H20、170mg/L KH2PO4、22.3mg/L MnSO4.4H20、8.6mg/L ZnSO4.7H20、6.2mg/L H3B03、0.83mg/L K1、0.25mg/L Na2Mo04.2H2CK0.025mg/L CuSCU.5出0、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4.7H20、37.3mg/L Na2.EDTA.H2O、lOOmg/L Myo-1nsitol (肌醇)、2.0mg/L Glycine(甘氨酸)、0.lmg/L Thiamine.HCl (維生素BI)、0.5mg/L Nicotinic.acid(煙酸)、0.5mg/L Pyridoxine.HCl(維生素B6);其pH值為5.8;
[0064]所述的I /2MH基本培養(yǎng)基為將MH基本培養(yǎng)基中所含大量元素(NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H20,MgSO4.7H20、KH2P04)的用量減半，其余成分不變。
[0065]實施例1一種黃樟成年優(yōu)良單株的高效離體植株再生方法
[0066](I)外植體采集和消毒:選取干型通直圓滿、樹姿秀麗、生長速度快、富含樟腦和樟油、無病蟲害、樹齡15年以上的黃樟優(yōu)良單株為母本，將所選優(yōu)樹進行基部環(huán)割促進基部萌枝，采集外植體前，每隔7d用多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝5次；10月份天氣晴朗的上午10時左右，剪取樹干基部半木質化萌枝，去葉后保濕處理后帶回實驗室，用純凈水清洗干凈置4°(:冰箱保存?zhèn)溆?然后將枝條剪成4cm長、帶2個葉腋的莖段，在超凈工作臺上先用無菌水擦洗干凈，再用體積分數(shù)0.1 %的新潔爾滅溶液輕輕刷洗7min，隨后用無菌水沖洗2次;在體積分數(shù)為70 %的酒精中浸泡20s，倒掉酒精后無菌水沖洗2次;然后加入質量分數(shù)0.1 %的升汞溶液，浸泡5min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠備用；
[0067](2)腋芽誘導培養(yǎng):將步驟(I)消毒好的帶葉腋莖段切除葉柄、莖段兩端受傷部位，隨后接種到誘導培養(yǎng)基(MH+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+卡拉膠8g/L(激素購自Sigma-Aldrich公司)，pH為5.8)中進行誘導培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60μηιο1.m—2.s1)時間為12h/d)，每瓶接種一個外植體;誘導培養(yǎng)4?5d之后，葉柄開始松動脫落，腋芽萌動，誘導培養(yǎng)25d后一個葉腋能萌出多個腋芽(圖1、圖2)，腋芽平均高度為3.5cm，誘導率為100% ；
[0068](3)叢芽增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的腋芽截成1.0?1.5cm的莖段轉接入增殖培養(yǎng)基(MH+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH為5.8)中進行增殖培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60ymol.m—2.s—O時間為12h/d)，增殖培養(yǎng)30d后，單芽形成增殖苗(芽叢)，芽伸長生長快，增殖系數(shù)和有效芽(芽高3 2cm)分別高達10.5和9.61個/叢(圖3);
[0069](4)生根培養(yǎng):從步驟(3)培養(yǎng)得到的增殖苗中切取健壯的有效頂芽，長度為2cm，轉接到生根培養(yǎng)基(1/2MH+NAA 0.3mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6g/L，pH為5.8)中進行生根培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60ymol.m—2.s—O時間為12h/d)，生根培養(yǎng)20d后，得到組培生根苗；其中，不定根的誘導率為96%，平均根數(shù)3.4條/株(圖4、圖5);
[0070](5)煉苗與移栽:將步驟(4)培養(yǎng)得到的組培生根苗移到溫室中適應外界環(huán)境7d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗ld，將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到用質量分數(shù)為1%。的高錳酸鉀滅過菌的泥炭土與珍珠巖體積比為3:1的混合基質中，該移栽成活率為93% (圖6);
[0071](6)移栽幼苗管理:移栽后第一周采用蓋塑料膜保濕，隨后揭開薄膜，保持基質濕潤，空氣相對濕度在95%以上，控制培養(yǎng)溫度30°C，蔭棚用70 %的遮光網(wǎng)遮光；在移栽后當天采用質量體積百分比濃度0.1%的百菌清溶液噴施小苗，之后每隔10天噴霧一次;移栽后待幼苗生長穩(wěn)定，長出新芽和新根后，噴施質量體積百分比濃度1%。的復合肥，根據(jù)幼苗生長狀況，每隔7天噴施一次，并逐步增加光照強度，直到進行全光照常規(guī)管理。
[0072]實施例2—種黃樟成年優(yōu)良單株的高效離體植株再生方法
[0073](I)外植體采集和消毒:選取干型通直圓滿、樹姿秀麗、生長速度快、富含樟腦和樟油、無病蟲害、樹齡15年以上的黃樟優(yōu)良單株為母本，將所選優(yōu)樹進行基部環(huán)割促進基部萌枝，采集外植體前，每隔Sd用多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝5次;9月份天氣晴朗的上午10時左右，剪取樹干基部半木質化萌枝，去葉后保濕處理后帶回實驗室，用純凈水清洗干凈置4°(:冰箱保存?zhèn)溆?然后將枝條剪成3cm長、2個帶葉腋的莖段，在超凈工作臺上先用無菌水擦洗干凈，再用體積分數(shù)為0.1 %的新潔爾滅溶液輕輕刷洗5min，隨后用無菌水沖洗I次;在體積分數(shù)為70%的酒精中浸泡30s，倒掉酒精后無菌水沖洗I次，然后加入質量分數(shù)為0.05%的升汞溶液，浸泡3min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠備用；
[0074](2)腋芽誘導培養(yǎng):將步驟(I)消毒好的帶葉腋莖段切除葉柄、莖段兩端受傷部位，然后接種到誘導培養(yǎng)基(MH+0.lmg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+蔗糖25g/L+卡拉膠7.5g/L(激素購自Sigma-Aldrich公司)，pH為5.9)中進行誘導培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60μηιο1.m—
2.s_1)時間為12h/d)，每瓶接種一個外植體;誘導培養(yǎng)5?6d之后，葉柄開始松動脫落，腋芽萌動，誘導培養(yǎng)20d后一個葉腋能萌出多個腋芽，腋芽平均高度為2.9cm，誘導率為95% ;
[0075](3)叢芽增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的腋芽截成1.0?1.5cm的莖段轉接入增殖培養(yǎng)基(MH+6-BA 0.5mg/L+KT 0.3mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂5g/L，pH為5.9)中進行增殖培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60μπιο1.πΓ2.s—O時間為12h/d)，增殖培養(yǎng)20d后，單芽形成增殖苗(芽叢)，芽伸長生長快，增殖系數(shù)和有效芽(芽高3 2cm)分別高達7.82和6.3個/叢；
[0076](4)生根培養(yǎng):從步驟(3)培養(yǎng)得到的增殖苗中切取健壯的有效頂芽，長度為3cm，轉接到生根培養(yǎng)基(1/2MH+NAA 0.3mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，pH為6.0)中進行生根培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25 0C，光照(60μπιοI.m—2.s—1)時間為12h/d)，生根培養(yǎng)15d后，得到組培生根苗；其中，不定根的誘導率為90%，平均根數(shù)2.8條/株；
[0077](5)煉苗與移栽:將步驟(4)培養(yǎng)得到的組培生根苗移到溫室中適應外界環(huán)境5d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗ld，將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到用質量分數(shù)為1%。的高錳酸鉀滅過菌的泥炭土與珍珠巖體積比為3:1的混合基質中，該移栽成活率為93%;
[0078](6)移栽幼苗管理:移栽后第一周采用蓋塑料膜保濕，隨后揭開薄膜，保持基質濕潤，空氣相對濕度在95%以上，控制培養(yǎng)溫度25°C，蔭棚用70 %的遮光網(wǎng)遮光；在移栽后當天采用質量體積百分比濃度0.1%的百菌清溶液噴施小苗，之后每隔10天噴霧一次;移栽后待幼苗生長穩(wěn)定，長出新芽和新根后，噴施質量體積百分比濃度2%。的復合肥，根據(jù)幼苗生長狀況，每隔7天噴施一次，并逐步增加光照強度，直到進行全光照常規(guī)管理。
[0079]實施例3—種黃樟成年優(yōu)良單株的高效離體植株再生方法
[0080](I)外植體采集和消毒:選取干型通直圓滿、樹姿秀麗、生長速度快、富含樟腦和樟油、無病蟲害、樹齡15年以上的黃樟優(yōu)良單株為母本，將所選優(yōu)樹進行基部環(huán)割促進基部萌枝，采集外植體前，每隔1d用多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝4次；11月份天氣晴朗的上午10時左右，剪取樹干基部半木質化萌枝，去葉后保濕處理后帶回實驗室，用純凈水清洗干凈置4°C冰箱保存?zhèn)溆?然后將枝條剪成2cm長、I個帶葉腋的莖段，在超凈工作臺上先用無菌水擦洗干凈，再用體積分數(shù)為0.1 %的新潔爾滅溶液輕輕刷洗3min，隨后用無菌水沖洗I次;在體積分數(shù)為75 %的酒精中浸泡30s，倒掉酒精后無菌水沖洗I次;然后加入質量分數(shù)為0.1 %的升汞溶液，浸泡8min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液用無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠備用；
[0081](2)腋芽誘導培養(yǎng):將步驟(I)消毒好的帶葉腋莖段切除葉柄、莖段兩端受傷部位，然后接種到誘導培養(yǎng)基(MH+1.0mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+蔗糖40g/L+卡拉膠7g/L(激素購自Sigma-Aldrich公司)，pH為6.0)中進行誘導培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60ymol.m—2.s
1)時間為12h/d)，每瓶接種一個外植體;誘導培養(yǎng)4?5d之后，葉柄開始松動脫落，腋芽萌動，誘導培養(yǎng)30d后一個葉腋能萌出多個腋芽，腋芽平均高度為3.7cm，誘導率為91 % ;
[0082](3)叢芽增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的腋芽截成1.0?1.5cm的莖段轉接入增殖培養(yǎng)基(MH+6-BA 2.0mg/L+KT lmg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂6g/L，pH為6.0)中進行增殖培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25 0C，光照(60μπιο1.m—2.s—1)時間為12h/d)，增殖培養(yǎng)25d后，單芽形成增殖苗(芽叢)，芽伸長生長快，增殖系數(shù)和有效芽(芽高3 2cm)分別達9.7和8.64個/叢；
[0083](4)生根培養(yǎng):從步驟(3)培養(yǎng)得到的增殖苗中切取健壯的有效頂芽，長度為2cm，轉接到生根培養(yǎng)基(1/2MH+NAA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6g/L，pH為5.9)中進行生根培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C，光照(60ymol.m—2.s—O時間為12h/d)，生根培養(yǎng)20d后，得到組培生根苗；不定根的誘導率為98%，平均根數(shù)2.3條/株；
[0084](5)煉苗與移栽:將步驟(4)培養(yǎng)得到的組培生根苗移到溫室中適應外界環(huán)境5d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗ld，將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到用質量分數(shù)為2%。高錳酸鉀滅過菌的泥炭土與珍珠巖體積比為3:1的混合基質中，該移栽成活率為93%;
[0085](6)移栽幼苗管理:移栽后第一周采用蓋塑料膜保濕，隨后揭開薄膜，保持基質濕潤，空氣相對濕度在95%以上，控制培養(yǎng)溫度20°C，蔭棚用70 %的遮光網(wǎng)遮光；在移栽后當天采用質量體積百分比濃度0.1%的百菌清溶液噴施小苗，之后每隔10天噴霧一次;移栽后待幼苗生長穩(wěn)定，長出新芽和新根后，噴施質量體積百分比濃度1%。的復合肥，根據(jù)幼苗生長狀況，每隔7天噴施一次，并逐步增加光照強度，直到進行全光照常規(guī)管理。
[0086]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種黃樟離體植株再生的方法，其特征在于包含如下步驟: (1)外植體采集:取黃樟樹干基部萌枝，作為外植體，然后消毒； (2)腋芽誘導:將步驟(I)消毒后的外植體接種到誘導培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，得到腋芽； (3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)得到的腋芽轉接到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，得到增殖苗； (4)生根培養(yǎng):從步驟(3)培養(yǎng)得到的增殖苗中切取頂芽轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，得到組培生根苗； (5)煉苗與移栽:將步驟(4)培養(yǎng)得到的組培生根苗移到溫室煉苗移栽，得到容器苗； (6)移栽幼苗管理。2.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的外植體采集的時間為9?11月。3.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的外植體為:半木質化萌枝去葉后切成帶I?2個葉腋的莖段。4.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)基包含MH基本培養(yǎng)基以及6-BA 0.1?1.0mg/L、NAA 0.0l?0.lmg/L、鹿糖25?40g/L和卡拉膠7?8g/L，誘導培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0。5.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)基包含MH基本培養(yǎng)基以及6-BA 0.5?2mg/L、KT 0.3?lmg/L、NAA 0.05?0.2mg/L、蔗糖25?40g/L和瓊脂5?6g/L，增殖培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0。6.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)基包含1/2MH基本培養(yǎng)基以及NAA 0.1?0.5mg/L、蔗糖15?20g/L、瓊脂5?6g/L，生根培養(yǎng)基的pH為5.8?6.0。7.根據(jù)權利要求4?6任一項所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 所述的MH基本培養(yǎng)基包含如下組分: 720mg/L NH4N03、1800mg/L KN03、340mg/L CaCl2.2H20、200mg/L Ca(NO3)2、370mg/LMgSO4.7H20、170mg/L KH2PO4、22.3mg/L MnSO4.4H20、8.6mg/L ZnSO4.7H20、6.2mg/LH3B03、0.83mg/L K1、0.25mg/L Na2MoO4.2H20、0.025mg/L CuSO4.5H20、0.025mg/L C0CI2、27.8mg/L FeSCU.7Η2θ、37.3mg/L Na2.EDTA.H2O、lOOmg/L Myo-1nsitol、2.0mg/LGlycine、0.lmg/L Thiamine.HCl、0.5mg/L Nicotinic.acid、0.5mg/L Pyridoxine.HCl，MH基本培養(yǎng)基的pH為5.8。8.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的誘導培養(yǎng)的條件為溫度為25±2°C，光照時間為8?12h/d; 步驟⑶中所述的增殖培養(yǎng)的條件為25 ± 2 °C，光照時間為8?12h/d; 步驟⑷中所述的生根培養(yǎng)的條件為25 ± 2 °C，光照時間為8?12h/d。9.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(5)所述的煉苗移栽的方式為:將組培生根苗移到溫室中適應外界環(huán)境5?7d，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗I?2d，將組培苗取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到混合基質中，移栽完后淋透定根水。10.根據(jù)權利要求1所述的黃樟離體植株再生的方法，其特征在于: 步驟(6)中所述的移栽幼苗管理的方式為:移栽后第一周采用蓋塑料膜保濕，隨后揭開薄膜，保持基質濕潤，空氣相對濕度在95 %以上，控制培養(yǎng)溫度15?300C，蔭棚用70%的遮光網(wǎng)遮光;在移栽后當天采用質量體積百分比濃度0.1 %的百菌清或多菌靈溶液噴施小苗，之后每隔7?10天噴霧一次;移栽后待幼苗生長穩(wěn)定，長出新芽和新根后，噴施質量體積百分比濃度I?2%。的復合肥。
【文檔編號】A01H4/00GK105900834SQ201610228167
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】鄧小梅, 白紅娟, 奚如春, 魯好君, 趙帥, 陳曉陽
【申請人】華南農業(yè)大學