使用柑橘衰退病毒載體進行外源基因表達的制作方法【專利摘要】本發(fā)明揭示了基于對柑橘衰退病毒的修改、為有益目的用于轉(zhuǎn)染柑橘樹的病毒載體。本發(fā)明揭示了包括含有一個或多個編碼異源性多肽的基因盒的病毒載體。所述基因盒位于病毒基因組上的理想位點，使得增加表達量的同時保存病毒的功能性。本發(fā)明同時揭示了用病毒載體轉(zhuǎn)染植物的方法以及被病毒轉(zhuǎn)染的植物的實施例?！緦＠f明】使用柑橘衰退病毒載體進行外源基因表達[0001]相關(guān)申請的交叉參考[0002]本申請根據(jù)美國法典第35篇第119條(35USC119)要求2011年9月21日提交的美國專利申請第61/537,154號的優(yōu)先權(quán)，并通過引用將其納入本文中。【
背景技術(shù)：
】[0003]病毒載體的早期開發(fā)目的是廉價生產(chǎn)該領(lǐng)域可等比擴大的專門蛋白。最初使用的是一種植物病毒載體，即一種雙鏈DNA病毒花挪菜花葉病毒（Brissonetal.，1984;61'0116111301'116丨31.，1981)。然而，這種病毒穩(wěn)定性過低，因而無法使用（？111^6代16丨31·，1990)。反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的發(fā)展使得RNA病毒也能夠被利用，載體的開發(fā)有了更多選擇(Ahlquistetal.，1984)。[0004]病毒載體是基礎(chǔ)研究的重要元素，有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛力。但外源插入物質(zhì)穩(wěn)定性不高是病毒載體用于應(yīng)用領(lǐng)域蛋白表達商業(yè)化的一個主要缺點?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本申請是基于多項探索利用CTV載體表達806到3480個核苷酸外源基因的局限性研究。在一個實施例中，基因盒被引入CTV基因組中以替換p13基因。在其他實施例中，基因被插入在不同位點（例如，Pl3-p20、p20-p23和p23-3'NTR(非轉(zhuǎn)錄區(qū)））。在另一個實施例中，檢測了P23融合與蛋白酶加工的作用。在可替代的實施例中，基因被插入在IRES序列后來創(chuàng)建雙順反子信息。[0006]27個表達載體被創(chuàng)造并在本生煙原生質(zhì)體和植物中進行檢測。值得注意的是，這里介紹的多數(shù)新開發(fā)出的載體結(jié)構(gòu)在植物中復(fù)制、系統(tǒng)地播散，產(chǎn)生外源基因。檢測到的表達量最大的載體包括P13_p20或p23-3'NTR的"添加基因"結(jié)構(gòu)。類似地，插入基因取代p13基因的載體有效地表達了不同的報告基因。然而，報告基因的最優(yōu)表達取決于插入基因的大小和部位。表達最優(yōu)的小基因為靠近3'端處的基因，而表達最優(yōu)的大基因來自多個內(nèi)部位點。[0007]在本生煙和柑橘上都實現(xiàn)了相同載體上兩種基因的同時有效表達。本文介紹的新CTV載體的基因組有獨特的彈性結(jié)構(gòu)，能夠通過多種方法容納并表達外源基因。[0008]對一種有效的載體進行基因工程處理需要平衡不同因素。載體需要精心設(shè)計，讓植物中的復(fù)制和系統(tǒng)轉(zhuǎn)移最小化，同時外源蛋白的表達最大化（Shivprasadetal.，1999)。最后一個因素是載體的穩(wěn)定性。簡言之，載體的有用性直接與其穩(wěn)定性相關(guān)。穩(wěn)定性是載體減少重組、提高競爭力的結(jié)果，所產(chǎn)生的重組體丟失部分或全部插入序列?！靖綀D說明】[0009]圖1.在P13位點GFP替換產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔP33圖示(方框代表開放閱讀框，藍色框代表復(fù)制基因塊，紅色框代表線性病毒保守基因塊(KaraSev，2000);黑色圈和黑色框代表沉默抑制子(Luetal.，2004);金色框代表可能有某些柑橘病毒基因型感染的基因（Tatinenietal.,2008);實心黑框代表刪除p33控制子元件和0RF(ntsl0858-11660基因庫登記號AY170468)(Satyanarayanaetal.,1999;2000;2003))。箭頭指向CTV前導(dǎo)蛋白酶的加工，LP1與LP2是兩個串聯(lián)的前導(dǎo)蛋白酶，MT(甲基轉(zhuǎn)移酶）、Hel(HeliCaSe)、RdRp(RNA依賴性RNA聚合酶，Ap33(33kda蛋白序列刪除）、p6(6kda蛋白）、Hsp70h(熱休克蛋白70同源體）、p61(61kda蛋白）、CPm(次要衣殼蛋白）、CP(主要衣殼蛋白、細胞內(nèi)沉默抑制子）、pl8(18kda蛋白）、pl3(13kda蛋白）、p20(20kda蛋白、細胞內(nèi)/細胞間沉默抑制子）、p23(23kda蛋白，細胞內(nèi)沉默抑制子），分別通過BYSV的CP-CE、GLRaV-2與BYV驅(qū)動GFP的修飾產(chǎn)生表達載體CTV33-A13-BY-GFP-57(C57)、CTV33-A13-G-GFP-65(C65)與CTV33-A13-B-6?卩-66(066)。（8)轉(zhuǎn)染了野生型CTV(WT)和基于CTV的表達載體轉(zhuǎn)錄物(T)及其傳代載體(P)的本生煙原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)焚光立體顯微鏡下三種載體(71733-Δ13-BY-GFP-57、CTV33-A13-G-GFP-65、CTV33-A13-B-GFP-66轉(zhuǎn)染的本生煙原生質(zhì)體典型放大圖像。（D)用CTV33-A13-G-GFP-65與CTV33-A13-B-GFP-66感染的柑橘樹皮韌皮部熒光立體顯微鏡低倍鏡(左)與高倍鏡(右)圖像。[0010]圖2.pl3的⑶S替換產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RAP33及其修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-Δ13-BY-⑶S-61圖示，后者中p13及其控制子元件在BYSV的CP-CE控制下被⑶S取代。（B)感染了野生型CTV(WT)和基于CTV的表達載體CTV33-Δ13-BY-GUS-61(C61)(T)及其傳代載體(P)的本生煙原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)CTV33-A13-BY-GUS-61感染的柑橘樹皮(右)與樹皮塊固定前⑶S溶液(左）中GUS活性的典型示例(A=健康對照，B=感染）。[0011]圖3.在pl3與p20之間插入GFP產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔP33及在BYSV控制下于pl3與p20之間插入GFP0RF修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-13-BY-GFP-69圖示。（B)感染了野生型病毒(WT)和表達載體CTV33-13-BY-GFP-69(C69)轉(zhuǎn)錄物(T)及其傳代載體(P)的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。感染了CTV33-13-BY-GFP-69的本生煙(C)與阿蕾檬韌皮部標本(D)的焚光立體顯微鏡不例圖片。[0012]圖4.在p20與p23之間插入GFP產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔP33及其修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-20-B-GFP-49與CTV33-20-BY-GFP-58圖示。（B)感染了野生型病毒(訂）與表達載體〇733-20-8-6??-49(049)和<：1'￥33-20-8￥-6??-58(058)轉(zhuǎn)錄物（1')及其傳代載體(P)的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)UV光下原生質(zhì)體（右）與樹葉(左）熒光圖像提示載體有效移動不足。（D)在CTV基因組不同位點插入相同基因的Westernblots免疫印跡分析。BCN5(Folimonovetal.,2007)原始CTV載體(BYV啟動子之后在CPm與CP之間有GFP)、構(gòu)建的載體CTV33-23-BY-GFP-37(C37,在p20與p23之間插入BYSV驅(qū)動的GFP)、CTV33-20-BY-GFP-58(C58，在p20與p23之間插入BYSV驅(qū)動的GFP)、CTV33-13-BY-GFP-69(C69,在pl3與p20之間插入BYSV驅(qū)動的GFP)、CTV33-A13-BY-GFP-57(在pl3用BYSVCP-CE驅(qū)動的GFP取代）和CTV33-27-BY-GFP-63(C63,在CPm與CP之間插入BYSVCP-CE驅(qū)動的GFP0RF)示意圖。[0013]圖5.在p23與3'NTR之間插入GFP產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔp33與在BYSV、GLRaV-2和BYVCP-CE控制下于p23之后插入GFP修飾產(chǎn)生的表達載體(：1'￥33-23-8￥-GFP-37(C37)、CTV33-23-G-GFP-40(C40)和CTV33-23-B-GFP-42(C42)示意圖。（B)野生型病毒(WT)和表達載體CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40與CTV33-23-B-GFP-42轉(zhuǎn)錄物(T)及其傳代載體(P)轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)感染了三種構(gòu)建的載體CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40與CTV33-23-B-GFP-42的本生煙熒光立體顯微鏡放大圖示例。(D)感染了CTV33-23-BY-GFP-37與CTV33-23-G-GFP-40的阿蕾檬韌皮部組織熒光圖像示例。[0014]圖6.在p23與3'NTR之間插入GUS產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔP33與在BYSVCP-CE控制下于p23與3'NTR之間插入GUS產(chǎn)生的表達載體CTV33-23-BY-GUS-60(C60)示意圖。(B)野生型病毒(WT)與表達載體CTV33-23-BY-GUS-60轉(zhuǎn)錄物(T)轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)本生煙組織和柑橘韌皮部GUS蛋白的酶活性(藍色表示感染的植物，無色組織和溶液代表健康對照和經(jīng)相同處理的GUS溶液。[0015]圖7.IRES序列后插入GFP產(chǎn)生基于CTV的表達載體。（A)CTV9RΔP33與CTVΔCla333R及p23后的修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-23-ITEV-GFP-41、具有TEV5'NTRIRES和3xARC-lIRES的CTV33-23-I3XARC-GFP-43,以及CTVp333R-23-ITEV-GFP、分別具有TEV5'NTRIRES與3xARC-lIRES的CTVp333R-23-I3XARC-GFP示意圖。（B)野生型病毒（WT)、CTV33-23-ITEV-GFP-41(C41)與CTV33-23-I3XARC-GFP-43(C43)轉(zhuǎn)染的本生煙原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernb1〇t)分析;T=轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體分離到的RNA，P=從RNA轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中分離出的病毒體轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體，從后者分離出的RNAj-CTVpSSSRIS-ITEV-GFPU列）、CTVp333R-23-I3XARC-GFP(B列）、CTVp333R(C列）和CTVp333R-23-B-GFP(在p23之后插入BYVCP-CE驅(qū)動表達的GFP)(D列)轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析。[0016]圖8.6??與蛋白酶在?23融合產(chǎn)生基于(：17的表達載體。（4)(：1791?八1)33與融合兩種TEV蛋白酶（NIa與HC-Pro)及其識別序列產(chǎn)生表達載體CTV33-23-HC-GFP-72、CTV33-23-NIa-GFP-73、CTV33-23-HC0-GFP-74和CTV33-23-NIa0-GFP-75的示意圖。[0017]圖9.本生煙熒光對比圖。（A)攜帶構(gòu)建的載體CTV33-23-HC-GFP-72、CTV33-23-NIa-GFP-73、CTV33-23-HC0-GFP-74與CTV33-23-NIa.0.-GFP-75(有GFP融合）和CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40與CTV33-23-B-GFP-42(游離GFP)樹葉在手持UV燈(右圖）和白光（左圖）下的熒光對比圖。（B)攜帶構(gòu)建的載體CTV33-23-HC-GFP-72與CTV33-23-NIa-GFP-73(有GFP融合）和CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40與CTV33-23-B-GFP-42(p23后有自身控制子元件控制的GFP(游離GFP))的本生煙整株植物在手持UV燈(右圖）和白光(左圖）下的熒光對比圖。（C)攜帶構(gòu)建載體CTV33-23-HC-GFP-72與CTV33-23-NIa-GFP-73的相同樹葉背面(下面)和正面(上面)在手持UV燈(右圖）和白光(左圖）下的對比圖。[0018]圖10.對浸潤本生煙葉片的不同的表達載體使用GFP抗體進行Westernblot免疫印跡分析。A=CTV9RAp33GFP(在CPm和CP之間插入受BYVCP-CE控制子元件控制的GFP(產(chǎn)生游離GFP)(Tatinenietal.，2008))，B=CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51，C=CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54，D=空白，E=CTV33-Δ13-BY-GFP-NIa-GUS-78，F(xiàn)=CTV33-23-HC-GFP-72，G=CTV33-23-NIa-GFP-73〇[0019]圖11.雜交基因（GFP/蛋白酶/GUS融合）替換pl3產(chǎn)生表達載體。（A)CTV9RAP33及對其進行修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-Δ13-BYGFP-HC-⑶S-77與CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的示意圖，后兩者各攜帶一個受BYSVCP-CE控制的融合基因，即分別攜帶TEVHC-Pro與NIa，兩旁為GFP與⑶SJB)本生煙與阿蕾檬中報告基因的活性。（a.)感染CTV33-A13-BYGFP-HC-GUS-77或CTV33-A13-BYGFP-NIa-GUS-78的本生煙植物標本在白光和(b.)在紫外光下的圖片。（C.)感染了CTV33-A13-BYGFP-NIa-GUS-78的本生煙上剝離下的韌皮部的熒光立體顯微鏡圖。（d.)本生煙葉中GUS活性標本的對比圖，對照葉（左圖）和感染葉（右圖）。4.)健康的阿雷檬剝離下的韌皮部與浸泡于GUS溶液的韌皮部對比圖。（f.)感染了CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的阿雷檬剝離下的韌皮部圖。[0020]圖12·本生煙中構(gòu)建載體的穩(wěn)定性。（A)攜帶二元載體CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77(GFP/HC-Pro/GUS)土壤接種本生煙葉正面的熒光顯微鏡圖。（B)對相同葉片進行GUS活性檢測提示兩個報告基因幾乎完全重疊。[0021]圖13.在p23與3'NTR之間插入雜交基因（GFP/蛋白酶/⑶S融合)構(gòu)建表達載體。（A)CTV9RΔP33、分別插入受BYSVCP-CE控制的含HC-Pro和NIa蛋白酶雜交基因的表達載體CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51與CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、分別插入受GLRaV-2驅(qū)動的含HC-Pro和NIa蛋白酶融合基因的表達載體CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53(C53)與CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54(C54)、分別插入受BYV驅(qū)動的含HC-Pro和NIa蛋白酶融合基因的表達載體CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-55(C55)與CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-56(C56)的示意圖。（B)用野生型病毒（WT)、C53、C54、C55和C56構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體諾瑟雜交（Northernblot)分析。[0022]圖14.在p23之后插入雜交基因（GFP/蛋白酶/GUS)產(chǎn)生的報告基因的活性。（A)(a.)感染了CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51、CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53、CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52或CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54的本生煙樣本在白光和(b.)手持紫外光下的樣本圖。（c.)感染后本生煙葉與對照葉的GUS活性對比圖（1、2號管分別為固定前和固定液中的健康葉組織，3、4號管分別為溶液和感染葉組織，G管為GUS分析緩沖液。（B.)阿雷檬中報告基因的活性：（a.)感染了CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51的阿雷檬剝離下的韌皮部熒光立體顯微鏡圖。（b.)感染和健康的阿雷檬剝離下的韌皮部GUS活性（1、2號管分別為溶液和固定液中的健康葉組織，3、4號管分別為溶液和感染葉組織）。[0023]圖15.雙分子熒光互補（8丨？〇法驗證理論。（4)(：1^^(：133331?(6〇￥(^6七31·，2001，Satyanarayanaetal.,2003)復(fù)制子及其修飾產(chǎn)生的表達復(fù)制子的示意圖：（a.)在p23與3'NTR之間插入兩個BiFC基因產(chǎn)生CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC，在p23之后插入一個基因的對照載體〇^口3331?-23-8￥1^111^(13.)或〇^口3331?-23-6匕？08(：((3.)。（8)用CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC(a·道）、CTVp333R-23-BYbJunN(c·道）和CTVp333R-23-GbFosC(b.道)轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的諾瑟雜交(Northernblot)分析。（C)立體顯微鏡(上圖）和激光掃描共聚焦顯微鏡(下圖）下轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的熒光圖提示熒光來自細胞核。[0024]圖16.在pl3用BiFC基因替換產(chǎn)生基于CTV的表達載體。(A)CTV9RΔP33及其修飾產(chǎn)生的載體CTV33-A13-BYbJunN-GbFosC-76和對照載體CTV33-23-G-bFosC-98與CTV33-23-BY-bJunN-97(在p23之后ntsl9020-19021插入）的示意圖。（B)感染后本生煙的熒光圖示例。[0025]圖17.構(gòu)建基于CTV的表達載體同時表達來自兩個控制子元件的兩個基因。（A)CTV9RΔp33及其修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59與CTV33-Δ13-8丫1^111^-23-6匕？〇8(：-67的示意圖。（8)用野生型病毒（11'，1')、兩個克隆的0^33-&13-BYbJunN-23-GbFosC-67(C67，Tl與T2)，用3'NTR+p23作為探針行RNA轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體諾瑟雜交(Northernblot)分析（Satyanarayanaetal·，1999)。（C)本生煙組織的焚光立體顯微鏡圖（CTV33-23-BY-bJunN-Gb-FosC-59=a.，b.，c.和d;CTV33-A13-BYbJunN-23-GbFosC-67=^)(&.)芽(13.)花冠((3.)葉((1.)剝離下的韌皮部(6.)浸潤的葉片。[0026]圖18.基于CTV的表達載體，同時表達來由兩個控制子元件控制的兩個基因。（A)CTV9RΔp33及其修飾產(chǎn)生的表達載體CTV33-Δ13-BYGUS-23-GGFP-71的示意圖。（B)用野生型病毒(WT)與CTV33-A13-BYGUS-23-GGFP-71(C71)表達載體RNA以3'NTR+p23作為探針轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的諾瑟雜交(Northernblot)分析(Satyanarayanaet&1.，1999)。（〇在白光(a.)和手持UV光(b.)下觀察到的本生煙與阿雷檬植物中報告基因的生物學(xué)活性。（c.)健康本生煙（1號管（分析溶液）和2號管（組織））與感染本生煙（3號管（分析溶液）和4號管（組織））中的GUS活性。（d.)剝離韌皮部的熒光顯微鏡圖。（e.)阿雷檬中的GUS分析活性，與(c.)相似。[0027]圖19.阿雷檬中不同載體的Westernblots免疫印跡分析，以評估GFP和GUS的表達。（A)測定感染了Ap33CTV9R的708號阿雷檬（Tatinenietal.,2008)、感染了BCN5的1808號阿雷檬(Folimonovetal.,2007))、感染了CTV33-23-G-GFP-40的1916號阿雷檬、感染了0^33-23-8丫-6卩卩-37的1874號阿雷檬、感染了(：1733-13-8￥-6卩?-69的1934、1935、1937號阿雷檬、感染了CTV33-Δ13-G-GFP-65的1931號阿雷檬與感染了CTV33-Δ13-B-GFP-66的1939號阿雷檬中的GFP與CP抗體，以評估GFP相對于CP的表達水平。（B)測定感染了CTV33-A13-BYGUS-61的2084、2085、2086、2087號阿雷檬、感染了(：1'￥33-23-8￥61]5-60的2132號阿雷檬、感染了表達載體CTV33-A13-BYGFP-NIa-GUS-78的2096號阿雷檬中的GUS與CP抗體，以評估GUS相對于CP的表達水平。其中，E=空管，緩沖液=-iveC。[0028]圖20.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達四個控制子元件控制的四個基因。（A)CTV9R示意圖。（B)對CTV9R進行修飾構(gòu)建表達載體CTVΔ13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118,該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的4個基因。第1個基因為次要衣殼蛋白和主要衣殼蛋白之間的紅色熒光蛋白基因（tagRFP)，受甜菜黃化病毒（BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制，第2個和第3個基因分別替換了p13基因，分別為截短的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子bFos與bjun和EYFP的C、N末端融合(Huetal.,2002)而成，受葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第4個基因為p23后的TMVCP，受CTV雙重主要CP-CE的控制。[0029]圖21.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)CTV9R示意圖。（B)對CTV9R進行修飾構(gòu)建表達載體CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129，該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1、2個基因分別替換了p13基因，分別為截短的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子bFos與bjun和EYFP的C、N末端融合(Huetal.,2002)而成，受葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第4個基因為p23后的TMVCP，受CTV雙重主要CP-CE的控制。[0030]圖22.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)0791?示意圖。（8)對0'￥91?進行修飾構(gòu)建表達載體(：17-81^^-8￥6??-01^^-117，該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因為在次要和主要衣殼蛋白之間的紅色熒光蛋白基因，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因為pl3-p20基因之間插入的綠色熒光蛋白（GFPC3)，受到甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因為P23之后的TMVCP，受CTV雙重主要CP-CE控制。[0031]圖23.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)CTV9R示意圖。（B)對CTV9R進行修飾構(gòu)建表達載體CTV-BASL-BYPTA-CP7-119,該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因是從大蒜(ASL)中提取的凝集素，位點在次要和主要衣殼蛋白之間，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因是從半夏(PTA)中提取的凝集素，位點在pl3-p20基因之間，受甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因為中國鱟(P7)中提取的抗微生物肽，位點在p23之后，受CTV雙重主要CP-CE控制。[0032]圖24.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)CTV9R示意圖。（B)對CTV9R進行修飾構(gòu)建表達載體CTV-BASL-BYPTA-CP7-119,該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因是從大蒜(ASL)中提取的凝集素，位點在次要和主要衣殼蛋白之間，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因是從半夏(PTA)中提取的凝集素，位點在pl3-p20基因之間，受甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因為中國鱟(P7)中提取的抗微生物肽，位點在p23之后，受CTV雙重主要CP-CE控制。[0033]圖25.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)CTV9R示意圖。（B)對CTV9R進行修飾構(gòu)建表達載體CTV-BASL-BYP10-CP7-131，該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因是從大蒜(ASL)中提取的凝集素，位點在次要和主要衣殼蛋白之間，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因是從野豬(P10)中提取的微生物肽，位點在Pl3-p20基因之間，受甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因為中國鱟(P7)中提取的抗微生物肽，位點在p23之后，受CTV雙重主要CP-CE控制。[0034]圖26.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達三個控制子元件控制的三個基因。（A)CTV9RΔp33示意圖。（B)對CTV9RΔp33進行修飾構(gòu)建表達載體CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79,該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因為在次要和主要衣殼蛋白之間的綠色熒光蛋白基因，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因為Pl3_p20基因之間插入的來自大腸桿菌的a-葡糖醛酸酶(GUS)基因，受甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因為p23之后的TMVCP，受葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)CP-CE的控制。[0035]圖27.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達四個控制子元件控制的四個基因。（A)CTV9RAp33示意圖。（B)對CTV9RAp33進行修飾構(gòu)建表達載體CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81，該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因為在次要和主要衣殼蛋白之間的綠色熒光蛋白基因，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2、3個基因分別為截短的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子bFos與bjun和EYFP的C、N末端融合(Huetal.，2002)而成，受葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。在P23基因之后插入bFosC基因。[0036]圖28.構(gòu)建基于CTV的表達載體，同時表達四個控制子元件控制的四個基因。（A)CTV9RΔp33示意圖。（B)對CTV9RΔp33進行修飾構(gòu)建表達載體CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82，該載體表達了CTV基因組內(nèi)不同位點的3個基因。第1個基因為在次要和主要衣殼蛋白之間的綠色熒光蛋白基因(GFPC3)，受甜菜黃化病毒(BYV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2個基因替換了CTVpl3基因，為截短的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子bFos與EYFP的N末端融合(bJunN)(Huetal.，2002)而成，受甜菜黃矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3個基因在P23之后，為截短的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子bFos與EYFP的C末端融合(bJunC)而成，受葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)CP-CE的控制。[0037]圖29·浸潤本生煙葉尖的無染色電鏡照片。（A)攜帶CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79載體的浸潤本生煙葉尖形成CTV載體病毒體和TMV假病毒體，提示TMV衣殼蛋白基因的表達。(B)攜帶CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82載體的浸潤本生煙葉尖形成病毒體。[0038]發(fā)明詳述[0039]病毒載體的早期開發(fā)目的是廉價生產(chǎn)該領(lǐng)域可等比擴大的專門蛋白。最初使用的是一種植物病毒載體，即一種雙鏈DNA病毒花挪菜花葉病毒（Brissonetal.，1984;61'0116111301'116丨31.，1981)。然而，這種病毒穩(wěn)定性過低，因而無法使用（？111^6代16丨31·，1990)。反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的發(fā)展使得RNA病毒也能夠被利用，載體的開發(fā)有了更多選擇(Ahlquistetal.，1984)。關(guān)于以RNA病毒作為載體，目前存在很大爭議（Siegel，1983，1985;VanVluten_Dotting，1983VanVluten-Dottingetal.,1985)。有人認為缺乏RENA病毒復(fù)制酶缺乏校正機制，將導(dǎo)致過快的序列飄逸，在復(fù)制期間難以維持外源序列。然而，RNA病毒載體的后續(xù)開發(fā)與應(yīng)用證明了該擔憂并無必要。[0040]人們一直在致力于建立基于柑橘衰退病毒(CTV)的柑橘樹病毒載體。CTV是已知的植物病毒中RNA最大的病毒，約為20kb(Karasevetal.，1995;Pappuet兩個保守基因塊，與復(fù)制和病毒體的形成有關(guān)(KaraSev，2000)。復(fù)制基因塊位于基因組的5'端，通過多蛋白策略從基因組RNA表達而來，有a+Ι核糖體讀框移位，偶有RNA依賴性RNA聚合酶的表達(Karasevetal.，1995)<XTV的絲狀病毒體由兩種衣殼蛋白包被，主要衣殼蛋白（〇?)包被大約97%的病毒體，次要衣殼蛋白（0?111)包被了5'約70〇11^病毒體(Satyanarayanaetal.，2004)。病毒體的形成是一個復(fù)雜的過程，除衣殼蛋白之外，還需兩種蛋白參與（Hsp70h與p61)(Satyanarayanaetal.，2000,2004;Tatinenietal·，2010)。這4個基因及6個殘留基因分別通過3共末端亞基因組(sg)RNA的集合套表達(Hi1fetal.，1995)。在每個0RF上游有一個控制子元件(CE)，決定了轉(zhuǎn)錄水平(Gowdaetal.，2001))。轉(zhuǎn)錄水平也與+1轉(zhuǎn)錄起始位點（Ayll0netal.,2003)、0RF上游是否有非轉(zhuǎn)錄區(qū)(Gowdaetal·,2001)和0RF對3'端的封閉性（Satyanarayanaetal·,1999)相關(guān)。[00411第一代CTV載體的研究過程考慮了CP基因融合、插入其他基因、替換p130RF這三種方法(Folimonovetal.，2007)。？1301^的替換和衣殼蛋白0RF的融合并不能構(gòu)建有效的載體，但插入其他基因可產(chǎn)生多種載體，能夠表達相對較多的外源基因，在柑橘樹中可穩(wěn)定數(shù)年。然而，最初設(shè)計基于CTV的載體時在這一大體積病毒中僅研究了少數(shù)外源基因的表達。在此過程中，發(fā)明人嘗試探究了CTV成為載體的局限性，即該病毒基因組的不同位點是否可以插入其他基因，對于不同大小的插入基因，應(yīng)如何得到最大化的表達量等。發(fā)明人也探究了與不同病毒基因進行融合的各種方法是否可行，是否可以同時表達多個外源基因。令人驚喜的是，本文介紹的CTV載體可在基因組內(nèi)不同位點接受處理，產(chǎn)生切實可行的多種不同的載體構(gòu)建方法。[0042]一旦柑橘感染了含外源基因的CTV載體，可通過移植方便地將載體轉(zhuǎn)移到其他柑橘樹。但CTV載體系統(tǒng)的缺點在于很難讓最初的柑橘樹感染上新構(gòu)建的載體。通過土壤接種、基因槍轟擊或用RNA轉(zhuǎn)錄體的機械培育從CDNA直接培養(yǎng)柑橘及其困難，而且結(jié)果不可預(yù)測（Gowdaetal·，2005;Satyanarayanaetal·,2001)。另一個方法是用從本生煙原生質(zhì)體純化得到的病毒體培育（Folimonovetal.，2007;Robertsonetal.，2005;Satyanarayanaetal.，2001;Tatinenietal·,2008)。然而，只有約0.01-0.1%的原生質(zhì)體能夠感染上體外轉(zhuǎn)錄的RNA(Satyanarayanaetal.,2001)。但因為病毒體對原生質(zhì)體的傳染性大于RNA(Navas-Castilloetal.，1997)，發(fā)明人可通過原生質(zhì)體傳代擴大感染率(Folimonovetal.,2007；Robertsonetal.,2005；Satyanarayanaetal.,2001；Tatinenietal.,2008)。雖然可行，但該系統(tǒng)極難操作。發(fā)明人現(xiàn)在能夠土壤接種本生煙，引起系統(tǒng)性感染。結(jié)果可在這些植物中更快地進行載體分析，為柑橘樹的培育提供大量重組病毒。因此，發(fā)明人對本生煙和柑橘中不同載體的活性進行了研究。[0043]根據(jù)一個實施例，本發(fā)明涉及了CTV病毒載體與基因盒的聯(lián)合構(gòu)建，該基因盒中含編碼異源性多肽的多核苷酸。該基因盒位于CTV基因組的靶位點。在一個更具體的實施例中，CTV病毒載體被構(gòu)建成使得在CTV基因組pl3-p20、p20-p23或p23-3'NTR插入基因盒。在其他實施例中，CTV病毒載體被構(gòu)建成在一個或多個位點插入多個基因。本文顯示CTV病毒載體能夠成功地容納至少3個或4個基因進行表達，同時維持載體的功能和傳染性不變。[0044]在一些相關(guān)實施例中，本發(fā)明涉及一種植物，該種植物包括至少一個CTV病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞，CTV病毒載體被構(gòu)建成包含一個基因盒，該基因盒包含異源性多肽編碼多核苷酸，CTV病毒載體被構(gòu)建成在CTV基因組Pl3-p20、p20-p23或p23-3'NTR插入一個或多個基因盒。其他相關(guān)實施例涉及用具體載體感染植物后，讓植物表達至少一種異源性多肽的方法。[0045]在一個進一步的實施例中，本發(fā)明涉及將CTV病毒載體構(gòu)建成包括至少一個含異源性多肽編碼多核苷酸的基因盒，其中CTV病毒載體被處理成使在CTVp13基因位點能夠插入該基因盒。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明涉及了一種包含至少一個CTV病毒載體轉(zhuǎn)染細胞的植物，或者通過具體載體感染植物來在植物中表達異源性多肽的方法。[0046]在另一個實施例中，本發(fā)明涉及CTV病毒載體被構(gòu)建成包括至少一個含異源性多肽編碼核苷酸與共輒IRES序列的基因盒。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明涉及了一種包含至少一個CTV病毒載體轉(zhuǎn)染細胞的植物，或者通過具體載體感染植物來在植物中表達異源性多肽的方法。[0047]在進一步的實施例中，本發(fā)明涉及CTV病毒載體被構(gòu)建成包含一個含從p230RF開始的連續(xù)氨基酸編碼子多核苷酸序列的基因盒，編碼兩側(cè)均有剪切位點的第一異源性多肽(蛋白酶)和第二異源性多肽。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明涉及了一種包含至少一個CTV病毒載體轉(zhuǎn)染細胞的植物，或者通過具體載體感染植物來在植物中表達異源性多肽的方法。[0048]在進一步的實施例中，多核苷酸中進一步包括上文所述第一異源性多肽上游的編碼第一控制子元件的序列、編碼兩側(cè)有剪切位點的蛋白酶的第二序列、和編碼第二異源性多妝的序列。[0049]根據(jù)另一個實施例，本發(fā)明涉及將CTV病毒載體構(gòu)建成包括一個第一基因盒，該基因盒包括一個編碼第一異源性多肽的多核苷酸序列和所述編碼第一異源性多肽序列上游的一個第一控制子元件;和一個第二基因盒，該基因盒包括一個編碼第二異源性多肽的多核苷酸序列和所述編碼第二異源性多肽序列上游的一個第二控制子元件?？蛇x擇的，CTV病毒載體進一步包括一個第三基因盒，該基因盒包括一個編碼第三異源性多肽的多核苷酸序列和所述編碼第三異源性多肽序列上游的一個第三控制子元件；和一個第四基因盒，該基因盒包括一個編碼第四異源性多肽的多核苷酸序列和所述編碼第四異源性多肽序列上游的一個第四控制子元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會懂得只要保證維持載體的功能和傳染性，就能繼續(xù)在載體中增加基因盒。在相關(guān)實施例中，本發(fā)明涉及一種包含至少一個CTV病毒載體轉(zhuǎn)染細胞的植物，或者通過具體載體感染植物來在植物中表達異源性多肽的方法。[0050]根據(jù)本發(fā)明所教授的內(nèi)容使用的控制子元件(CE)包括，但不局限于，CTV同源性控制子元件或異源性控制子元件。異源性控制子元件包括，但不局限于，三種線形病毒甜菜黃化病毒（8￥￥)(第13547到13640的941^8，基因庫登記號4?190581)(?6代11^81〇￥6七31·，1999)、甜菜黃矮病毒(BYSV)衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)(第8516到8616的lOlnts，基因庫登記號U51931)和葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)(第9454-9651的198nts，基因庫登記號DQ286725)。根據(jù)本發(fā)明，其他控制子元件，特別是有強啟動子樣活性的控制子元件，亦可以被應(yīng)用，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。[0051]上述及其他實施例在以下被進一步進行描述，并被包括在所附權(quán)利要求中。[0052]以下實施例1-7的材料和方法[0053]質(zhì)粒的構(gòu)建[0054]使用pCTV9RΔp33與pCTVΔCla333R(Gowdaetal·，2001;Satyanarayanaetal.，1999,2000,2003;Tatinenietal.,2008)作為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建原生質(zhì)體反向遺傳系統(tǒng)所用的所有表達載體。核苷酸計數(shù)（nts)是基于T36克隆全長（基因庫登記號AY170468)(Satyanarayanaetal·,1999,2003)。融合煙草燭紋病毒（TEV)的5'非轉(zhuǎn)錄區(qū)（NTR)(核苷酸(nts)2-144基因庫登記號DQ986288)(Carrascoetal.,2007)和p23終止密碼子之后的3xARC-l(活性核糖體互補序列）（T36克隆全長中的核苷酸19020-19021)(Akergenovetal.,2004)使用重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)(Hortonetal.,1989)構(gòu)建CTVp333R-23-ITEV-GFP和CTVp333R-23-I3XARC-GFP(圖7A)。通過在不同位點插入基因和(或）替換基因構(gòu)建表達載體，從三種線性病毒的衣殼蛋白控制子元件(CP-CE)選擇異源性控制子元件(CE):甜菜黃化病毒（BYV)(第13547-13640的94nts，基因庫登記號AF190581)(Peremyslovetal·,1999)、甜菜黃矮病毒(BYSV)(第8516-9616的lOlnts)(Karasevetal·,1996)和葡萄卷葉相關(guān)病毒-2(GLRaV-2)(第9454-9651的198nts，基因庫登記號DQ286725)，以驅(qū)動周期3GFP(GFP)(Chalifeetal.，1994;Cramerietal.，1996)的0RF、大腸桿菌β-葡糖酸酸酶(⑶5)01^4卩〇8丫(：155-238化卩〇8〇、1^111^價-154(1^111^)。通過從質(zhì)粒？81卩(：^^〇8￥(：155與pBiFC-bJunYN155(Huetal·，2002)及CTV9R(Satyanarayanaetal·，1999;2003)的重疊延伸PCR創(chuàng)建載體CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC、CTVp333R-23-BYbJunN、CTVp333R-23-GbFosC(圖15A)。因雙分子熒光基因（BiFC)中存在兩個Notl位點，重疊延伸PCR產(chǎn)物被Notl限制性內(nèi)切酶部分消化。在StuI和Notl消化后的pCTVACla333R引入PCR產(chǎn)物（圖7A和圖3-15A)〇[0055]通過用Pstl(ntsl7208-17213)和Notl或StuI消化質(zhì)粒，將pCTV9RAp33中構(gòu)建的表達質(zhì)粒插入CTV基因組（在第19,293最末(^￥核苷酸后插入）。使用重疊延伸？0?(!1〇^〇11etal.，1989)在不同的位點插入適當?shù)幕颉Ｍㄟ^刪除pl30RF的ntsl7293-17581和重疊延伸PCR替換pl3基因（圖3-1A、圖3-2A、圖3-11A、圖3-16A、圖3-17A和圖3-18A)。類似地，通過重疊延伸PCR在pl3與p20之間（nts#17685-17686)(圖3A)、p20-p23之間（nts#18312-18313)(圖4A)、p23-3'NTR之間（nts#19020-19021)(圖3-5A、圖3-6A、圖3-13A、圖3-16A、圖3-17A和圖3-18A)插入基因。通過融合相隔HC-Pro蛋白酶基序（nts1966-2411，基因庫登記號111458)6?卩01^(〇^1丨€66七31.，1994;(^1111646七31.，1996)和(；1]501^創(chuàng)建雜交基因，其識別序列與GUS的N末端（ATGAAAACTTACAATGTTGGAGGGATG(nts2412-2438基因庫登記號M11458))(Allisonetal·，1985;Carringtonetal.,1989)(氨基酸序列（A.A)MKTYNVGlGM)(箭頭指示加工位點）和GFP的C末端(ATGAAGACCTATAACGTAGGTGGCATG)融合，插入在p23之后（圖13A)或替換pl3(圖3-11A)，受不同的控制子元件控制。使用TEV的NIa蛋白酶基序(nts6270-6980基因庫登記號M11458)(Allisonetal.,1985)及其識別序列（位于GFPC末端的GAGAATCTTTATTTTCAGAGT(nts8499-8519基因庫登記號Ml1458)(A.A.ENLYFQiS)(箭頭指示加工位點）（CarringtonandDougherty,1988)和位于GUSN末端的GAAAACCTATACTTCCAATCG)構(gòu)建類似的雜交基因。利用氨基酸遺傳密碼子的冗余消除識別基序核苷酸序列的完全重復(fù)。使用相似方法在CTV33-23-HC-GFP-72和CTV33-23-NIa-GFP-73的P230RF與GFP0RF之間插入構(gòu)建雜交基因（圖8)。交換蛋白酶識別基序產(chǎn)生控制載體CTV33-23-HC0-GFP-74與CTV33-23-NIa0-GFP-75(圖8)。[0056]對二元質(zhì)粒pCAMBIACTV9R(Gowdaetal·,2005)進行修飾，刪除ntsl0858-11660消除p33基因（Satyanarayanaetal.，2000;Tatinenietal.,2008)，在基于地下三葉草斑駁病毒構(gòu)建的核糖體之后插入Swal位點（Turpenetal.,1993)。對修飾后的二元質(zhì)粒PCAMBIACTV9RΔp33用PstI(正向引物C-749)和Swal(逆向引物C-1894)中插入pCTV9RΔp33骨架中表達載體的PCR擴增產(chǎn)物。向載體CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59(圖17)、CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67(圖17)、CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76(圖16)、CTV33-23-GbFosC-98(圖16)和CTV33-23-BYbJunN-97(圖16)中插入雙分子熒光互補(BiFC)基因時使用了引物將PstI換為相容的NSil(引物C-2085)以便克?。╞FosC基因序列含有一個PstI位點，而bJunN基因序列含有兩個PstI位點）。對不同的表達載體進行正確插入的初步篩查，使用適當?shù)拿高M行限制性消化。通過在生物科技多學(xué)科中心（ICBR)(佛羅里達大學(xué)，佛羅里達州甘斯威爾市)測序證實了插入表達載體的外源基因結(jié)合位點。所有引物在以下表1-1中列出。[0057]表1-1.構(gòu)建表達載體所用的引物列表[0058][0068][0069]聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)[0070]使用稀釋的質(zhì)粒（1:50)作為模板，使用VentDNA聚合酶（馬薩諸塞州伊普斯維奇市新英格蘭生物實驗室)根據(jù)使用說明建議進行PCR。[0071]土壤注射/浸潤法[0072]根據(jù)Gowdaetal.，（2005)發(fā)明的過程加以微小改良進行本生煙的土壤接種。用含有CTV、變異體(表達載體)和沉默抑制子(番茄叢矮病毒(Gowdaetal.，2005)、GLRaV-2的p24(Chibaetal.，2007)、蕪菁花葉病毒的Pl/HC-Pro(Kasschauetal.，2003)和番茄褪綠病毒的p22(Cafiizarcsetal.,2008))的二元質(zhì)粒進行根瘤農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程使用熱休克法(37°C，5分鐘），再在添加了抗生素(卡那霉素(50μg/ml)和利福平(50yg/ml))的LuriaBurtani(LB)培養(yǎng)基(密蘇里州圣路易市Sigma-Aldrich)平皿中28°C培育48小時。用添加了抗生素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)菌落(每個構(gòu)建的載體2個菌落），作為種菌培養(yǎng)。次日將0.5ml種菌接種于35ml添加了抗生素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。以6000r/min(rpm)轉(zhuǎn)速離心細菌培養(yǎng)液，用10毫摩爾(mM)MgCL2與10mMMES重新懸浮沉淀，用10mMMgCL2與10mMMES洗滌沉淀，再懸浮于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，即含有乙酰丁香酮的10mMMgCL2與10mMMES，最終濃度為150μΜ。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮液至少5小時，然后注射入本生煙莖或浸潤本生煙葉的下表面。[0073]植物生長條件[0074]在生長房（21°C，24小時中光照16小時）中培養(yǎng)本生煙，移植后4小時用于土壤注射或浸潤。[0075]柑橘植物感染[0076]從本生煙葉的浸潤葉或全部葉中獲得重組CTV病毒體以感染柑橘植物。該病毒體部分純化，在TL100或SW41轉(zhuǎn)子上利用蔗糖片上富集病毒體(Robertsonetal.,2005)。對表達兩種外源蛋白的載體病毒體使用梯度法濃縮2倍，再分別在TL100或SW41轉(zhuǎn)子上利用蔗糖片梯度進行濃縮(GarnseyandHenderson,1982)。在1-1.5年的阿雷檬幼苗中通過樹皮接種法接種柑橘植物(Robertsonetal.,2005)，在25-32°C的溫室內(nèi)生長。[0077]原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)染、RNA分離與諾瑟雜交(NorthernBlot)分析[0078]根據(jù)Nava-Castilloetal.，（1997)發(fā)明的方法制備本生煙葉原生質(zhì)體。對3周本生煙葉進行表面消毒，使用無菌刀在下表面輕劃一道，在暗室過夜培養(yǎng)（16-20小時），培養(yǎng)基為0.7MMMC(0.7M甘露醇、5mMMES，10mMCaCl2)加1%纖維素（YakultHonsh，Tokyo，Japan)和0.5%聚半乳糖醛酸酶(加利福尼亞州1^]〇1]^市〇3113；[001161]1實驗室）。[0079]使用Sp6RNA聚合酶(威斯康星州EpicentreTechnologies實驗室）在NotI或StuI線性質(zhì)粒DNA上得到加帽體外RNA(Satyanarayanaetal.,1999)，使用PEG(聚乙二醇)轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，該方法參考Satyanarayanaetal.,(1999)。轉(zhuǎn)染4天后，使用原生質(zhì)體制備總RNA用于諾瑟雜交(Northernblot)分析，并分離病毒體。將原生質(zhì)體等量分裝于2個1.5ml離心管中。第一個離心管用液氮快速冷凍，在-80°C保存，用于分離病毒體，后續(xù)培養(yǎng)新一批的原生質(zhì)體以擴增病毒體(Satyanarayanaetal.,2000)。第二個離心管用于分離RNA，用Buffard緩沖液破壞原生質(zhì)體，再用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取，用甲醇沉淀，該方法參考Navas-Castilloetal·，（1997)與Robertsonetal·，（2005)。用20μ1無DNAse/RNAase水重懸總RNA，用于諾瑟雜交(Northernblot)分析，分析方法參考Lewandowski與Dawson(1998)。簡言之，在變性緩沖液(8.6%甲醛、67%甲酰胺1XM0PS溶液(5mM乙酸鈉、ImMEDTA、0.02MMOPSpH=7.0))中對分離的RNA進行熱變性，用0.9%瓊脂凝膠1XM0PS(含1·9%甲醛）溶液分離RNA，通過電印記法轉(zhuǎn)染到尼龍膜上（BoehringerMannheim，Germany)。在68°C的雜交箱(密蘇里州圣路易市Sigma-Aldrich)中進行預(yù)雜交(至少1小時）和雜交(過夜）。使用900nts的地高辛標記RNA探針（相應(yīng)于CTV基因組的3'端）（聯(lián)合鏈特異性CTVRNA探針）（Satyanarayanaetal·,1999)進行雜交，但如果外源基因位于p23之后，根據(jù)使用說明建議(德國BoehringerMannheim)通過PCR擴增的DNA(含有CTV3'NTR和SP6噬菌體啟動子(C-1982)的反向引物)制造地高辛標記的RNA探針，與p23之后插入的序列和CTV的3'NTR序列互補。[0080]WesternBlots免疫印跡分析[0081]在盛有液氮的研缽中磨碎植物組織，加入Laemmli緩沖液(50mMTris-ClpH6.8、2·5%2-巰基乙醇、2%SDS、0·1%溴酚藍、10%甘油）（每100mg組織加入100μ1)。樣本轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，水浴煮沸3分鐘，再最大轉(zhuǎn)速離心2分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到新管中，在-20°C下貝士存待用。使用12%SDS-聚丙稀酰胺凝膠(加利福尼亞州Hercules市Bio-Rad公司生產(chǎn))進行電泳，之后用半干法在2小時內(nèi)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(加利福尼亞州Hercules市Bio-Rad公司生產(chǎn)）。室溫下封閉膜1小時，之后用一抗(可以為CP(1:5000)、GFP(1:100)(加利福尼亞州PaloAlto市ClontechLaboratories實驗室)或⑶S(1:1000)(俄勒閃州尤金市Molecularprobes)在室溫下孵育1小時，再用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔二抗（1:10,000)(英國白金漢郡Amersham公司生產(chǎn))孵育1小時。最后，根據(jù)生產(chǎn)建議，使用在X射線膜(紐約州羅切斯特市柯達公司生產(chǎn)）上沖洗的蛋白質(zhì)印跡法化學(xué)熒光系統(tǒng)（英國白金漢郡Amersham公司生產(chǎn)）。[0082]植物與原生質(zhì)體拍照[0083]使用佳能相機（CanonEOSDigitalRebelXTi400D,紐約州LakeSuccess市）米集植物在紫外線(UV)或白光下的照片。使用熒光解剖鏡(ZeissStemiSV11UV-熒光解剖鏡，德國Jena市CarlZeissJena,GmbH.公司生產(chǎn))采集部分植物或原生質(zhì)體的封閉焚光圖。使用共聚焦掃描顯微鏡采集高分辨率原生質(zhì)體圖像(LeicaTCSSL，賓夕法尼亞州埃克斯頓市LeicaMicrosystems，Inc·公司生產(chǎn)）。[0084]酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)[0085]根據(jù)Garnsey與Cambra(1991)發(fā)明的方法使用雙抗體插夾式ELISA。使用兔多克隆抗體（lμg/ml)包覆ELISA板。對植物組織樣本以1:20用roS-T(磷酸鹽緩沖液生理鹽水-1%Tween20)提取緩沖液稀釋。使用MabECTV172(稀釋倍數(shù)1:100K)檢測抗體。[0086]GUS分析[0087]對土壤接種柑橘樹皮或本生煙的葉表面進行酒精消毒(70%乙醇），再用10%次氯酸鈉消毒，用無菌蒸餾水洗滌3次之后，進行GUS染色。樣本在含lmg/mlX-gluc(單環(huán)己胺鹽：密蘇里州圣路易市GoldBiotechnology公司生產(chǎn)）的EDTA-磷酸鹽緩沖液（0.1MNa2HP〇4、ImMNa2EDTA)中培養(yǎng)。用95%乙醇：冰醋酸（3:1)固定組織。[0088]實施例1:檢測基于CTV的表達載體的系統(tǒng)[0089]在三個系統(tǒng)中檢測基于CTV的表達載體，分別為本生煙葉肉原生質(zhì)體、本生煙整株植物、阿雷檬整株植物。感染整株植物的載體構(gòu)建使用CTV全長cDNA克隆(PCTV9R)與p33基因大部分刪除的突變體(PCTV9RAP33)，后者有一個PstI限制位點刪除，更易克隆，且保留感染多數(shù)柑橘類植物的能力（Tatinenietal.,2008)。對本生煙原生質(zhì)體進行較快速分析，要求在SP6轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒(Satyanarayanaetal.，1999)上構(gòu)建載體。原生質(zhì)體中使用多數(shù)3'基因刪除的微復(fù)制子pCTVACla333R(Gowdaetal.,2001)較方便?？偰繕耸堑玫礁腥玖瞬煌腃TV表達載體的柑橘樹，這一目標更難、更耗時。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)土壤接種柑橘樹很難。因此，為避免這一難題，對病毒體進行擴增、濃縮以通過莖桿或樹葉感染柑橘樹(Robertsonetal.，2005;Satyanarayanaetal.，2001)?？梢允褂弥亟MCTV載體的體外轉(zhuǎn)錄體和通過天然樹液中病毒體傳代擴增的病毒感染本生煙原生質(zhì)體（Folimonovetal.,2007;Satyanarayanaetal.,2001;Tatinenietal.,2008)。此外，在土壤接種之后可以在本生煙植物中擴增重組CTV(Gowdaetal.,2005)。病毒可以感染土壤接種部分的葉肉細胞，但隨著病毒能夠系統(tǒng)性進入上部非接種樹葉，病毒聚集于維管組織，通常導(dǎo)致葉脈清空和后期壞死。在本生煙植物系統(tǒng)感染期間對所有載體進行檢查。因CTV病毒體離心之后并不重新懸浮，可以通過離心法加鹿糖密度梯度濃縮病毒體(Garnseyeta；L，1977;Robertsonetal.，2005)。接種后，去除柑橘植物頂端，在2-3個月之后監(jiān)測新生長部分的病毒系統(tǒng)性感染。一旦柑橘樹被感染，使用第一株感染植物的接種體（出芽、樹葉碎片或新芽)感染新的植物待用。整個過程約持續(xù)1年時間。因此研究者選擇在柑橘樹中僅研究最有前景的載體。一些后期開發(fā)的載體尚未進行過柑橘研究。[0090]實施例2:在CTV基因組內(nèi)不同部位增加基因[0091]在pl3基因位點插入[0092]曾有研究者(Folimonovetal.，2007)在有效的CTV載體中兩個衣殼蛋白基因之間插入其他基因，使得外源性基因成為3'端開始的第6個基因。但表達量最高的CTV基因趨向于靠近3'端。因此在靠近3'端插入基因?qū)?dǎo)致表達量增加。P13是3'端數(shù)起的第3個基因，是表達量相對較高的基因，多數(shù)CTV宿主的感染并不需要該基因（Tatinenietal.，2008;Tatinenietal.，inpreparation)。但既往用GFP0RF替換pl30RF的嘗試均告失敗(Folimonovetal.,2007)。失敗原因有多種可能性。此前設(shè)計載體時假設(shè)翻譯在第1個起始密碼子處開始，但P130RF有第二個框內(nèi)AUG。轉(zhuǎn)錄可能從第2個AUG開始。但在第2個AUG之后融合GFP0RF也未表達報告基因（Gowdaetal.，結(jié)果未發(fā)表）。第二個可能的原因是pl3控制元件（CE)可能延伸進入pl30RF或核糖體募集直接從0RF內(nèi)開始。于是研究者刪除了P13CE和0RF，在pl3位點異源性CE之后插入一個新的0RF。受BYSV(101nts，8516-8616,基因庫登記號U51931)、GLRaV-2(198nts,9454-9651，基因庫登記號DQ286725)或BYV控制的GFPORF被設(shè)計成pCTV9RΔp33，替代ntsl7293-17581(分別為CTV33-Δ13-BY-GFP-57，CTV33-Δ13-G-GFP-65，CTV33-A13-B-GFP-66)(圖1A)。使用RNA轉(zhuǎn)錄體接種系列原生質(zhì)體，判斷哪些載體能夠復(fù)制，哪些病毒體能夠在原液中傳代形成新一批原生質(zhì)體。感染后原生質(zhì)體的熒光(未列出數(shù)據(jù))和諾瑟雜交(northernblot)分析證實了表達載體通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移能夠有效傳代（圖1B)。此外，GFPmRAN的水平與CP相似。載體序列CTV33-A13-BY-GFP-57、CTV33-A13-G-GFP-65和CTV33-A13-B-GFP-66被轉(zhuǎn)移到土壤細菌二元質(zhì)粒中，以土壤接種本生煙。通過對葉、出芽、花和花冠的熒光成像，發(fā)現(xiàn)這三種載體感染了本生煙，在本生煙維管系統(tǒng)中大量轉(zhuǎn)移(圖1C)，早期出現(xiàn)維管清除，ELISA也能證實這一點(未列出數(shù)據(jù)）。[0093]擴增CTV33-A13-G-GFP-65與CTV33-A13-B-GFP-66,用于接種阿雷檬植物。最初感染的植物的維管系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著的熒光(圖1D)。這些植物接種2年后仍可見熒光。[0094]在相同位點用GUS0RF(1812nts)替換GFP0RF(720nts)研究更大外源基因的表達。選擇BYSVCP-CE驅(qū)動表達載體CTV33-A13-BY-GUS-61中的⑶S0RF(圖2A)。用該載體的RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，經(jīng)諾瑟雜交(northernblot)分析證實，病毒能夠復(fù)制且能從一批原生質(zhì)體有效傳代給另一批(圖2B)。此外，分析結(jié)果提示GUSmRNA的蓄積水平與CPmRNA相同，載體CP和CPmmRNA與野生型病毒相似。本生煙土壤接種的⑶S染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體能夠感染植物并在維管系統(tǒng)中播散，這一結(jié)果也經(jīng)ELISA(未列出數(shù)據(jù))與維管清除表型的證實。[0095]從攜帶CTV33-Δ13-BY-GUS-61的本生煙浸潤葉片分離到的病毒體感染了阿雷檬，經(jīng)ELISA(數(shù)據(jù)未顯示）和GUS蛋白生物活性（圖2C)的證實。柑橘樹接種后1.5年，GUS基因仍具有生物學(xué)活性。[0096]從技術(shù)上看，上述基因工程產(chǎn)物替換了一個基因（P13)而非增加一個基因，為了檢查在pl3和p20之間插入其他基因的載體，在ntsl7685-17686之間插入BYSV的CP-CE，以控制GFP0RF，產(chǎn)生CTV33-13-BY-GFP-69(圖3A)。該載體應(yīng)在pl3和p20的次基因組之間產(chǎn)生另一個次基因組RNA。研究本生煙原生質(zhì)體和植物中的載體CTV33-13-BY-GFP-69。在原生質(zhì)體系統(tǒng)中，CTV33-13-BY-GFP-69能有效復(fù)制，可從一批原生質(zhì)體順利傳代給新一批原生質(zhì)體即證明了這一點，焚光成像(數(shù)據(jù)未列出）和諾瑟雜交(northernblot)雜交分析也證實了病毒體的形成（圖3B)。外源性mRNA蓄積水平相對高，但CPmRNA蓄積水平下降。與pl3結(jié)構(gòu)替換相似，表達載體CTV33-13-BY-GFP-69經(jīng)土壤接種法進入本生煙之后，新的載體能夠在維管組織中播散(圖3C)。[0097]載體CTV33-13-BY-GFP-69可感染阿雷檬，在整個維管組織中可見強熒光（圖3C)，ELISA也證實了這一點(數(shù)據(jù)未顯示）。植物接種后2年仍有熒光。[0098]在p20和p23之間插入[0099]為研究靠近CTV3'NTR外源基因的表達，在p20和p23之間(ntsl8312-18313)插入基因。使用BYV或BYSVCP-CE驅(qū)動基于T36CTV9RΔp33的兩個載體（CTV33-20-B-GFP-49和CTV33-20-BY-GFP-58)中的GFPmRNA(圖3-4A)。新載體在p20和p23sgRNA之間產(chǎn)生其他sgRNAmRNA(圖4B)。但p20sgmRNA的蓄積顯著減少。兩個載體均可在原生質(zhì)體中復(fù)制并傳代，但原生質(zhì)體的傳代減少，表現(xiàn)為GFP焚光細胞數(shù)量減少，諾瑟雜交(northernblot)分析也可以證實這一點（圖4B和C)<XTV33-20-B-GFP-49或CTV33-20-BY-GFP-58載體浸潤本生煙葉有一過性表達時，載體復(fù)制，焚光鏡下可見大量GFP產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示），westernblots免疫印跡分析也證實這一點（圖4D)。然而，載體經(jīng)土壤接種進入本生煙植物后，載體復(fù)制，但進入上部非接種葉片的運動為隨機的，常有失敗。因本生煙的系統(tǒng)性感染并不確定，未再嘗試接種柑橘。[0100]在p23和3'NTR之間插入[0101]下一個待檢測位點為在最靠近3'端插入基因，該位點的外源基因表達水平預(yù)計最高（Navas-Castilloetal.，1997;Hilfetal.，1995)。雖然已經(jīng)分析過3'NTR(Satyanarayanaetal.,2002a)，目前尚不明確該區(qū)域增加一個基因是否能夠產(chǎn)生有效復(fù)制。在煙草花葉病毒(TMV)與苜?；ㄈ~病毒(AMV)的CP基因與3'NTR之間插入其他基因均未能產(chǎn)生有活性的載體（Dawsonetal·，1989;S^nchez-Navarroetal·，2001)dBYSV、GLRaV-2或BYV中在GFPORF之間的CP-CE被插入第19020和19021核苷酸之間，分別構(gòu)建載體CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40和CTV33-23-B-GFP-42(圖5A)。所有構(gòu)建的載體被轉(zhuǎn)染進原生質(zhì)體后均能復(fù)制和有效傳代，經(jīng)諾瑟雜交(northernblot)分析（圖5B)與GFP熒光分析(數(shù)據(jù)未列出）證實。GFPmRNA為蓄積率最高的mRNA，與其他mRNA相比，較野生型基因中的積累率僅輕度降低（圖5B)。此外，在p230RF3'端插入GFP得到積累率最高的外源基因mRNA。將CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40和CTV33-23-B-GFP-42經(jīng)土壤接種法接種到本生煙植物中。該感染通過維管組織進行系統(tǒng)性播散，熒光（圖5C)、表型（維管清除和壞死)與ELISA(數(shù)據(jù)未列出）均證實了這一點。本生煙維管組織中的熒光非常明亮，感染植物中的熒光可維持終生(圖5C)。[0102]構(gòu)建載體CTV33-23-BY-GFP-37通過傳代能夠在12批原生質(zhì)體中擴增，此后再接種柑橘。用濃縮的病毒體接種葉肉的阿雷檬也變得具有傳染性。經(jīng)GFP熒光法和ELISA(數(shù)據(jù)未列出）證實了柑橘的感染(圖3-5D)。通過土壤接種本生煙擴增構(gòu)建的載體CTV33-23-G-GFP-40,再對柑橘接種。感染率為1/4,經(jīng)熒光（圖5D)和ELISA(數(shù)據(jù)未列出）證實。與本生煙相似地，柑橘接種后12周維管組織仍可見強熒光，此后的2.5年均有熒光（圖f5D)。[0103]為了檢查載體在該位點表達更大基因的能力，在p23基因3'端插入BYSVCP-CE及之后的⑶S0RF，構(gòu)建CTV33-23-BY-GUS-60(圖6A)。構(gòu)建的載體在成功轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中復(fù)制。但根據(jù)諾瑟雜交(northernblot)分析，所有CTV次基因組RNA的蓄積水平均顯著低于野生型病毒（圖6B)。此外，CTV33-23-BY-GUS-60載體在原生質(zhì)體中的傳代能力較差(數(shù)據(jù)未列出）。但對本生煙進行土壤接種之后，載體復(fù)制并系統(tǒng)性移動，植物表現(xiàn)出系統(tǒng)性癥狀(維管清除繼而壞死），ELISA(數(shù)據(jù)未列出）和⑶S分析也證實了這一點。本生煙植物中的GUS活性在新老葉中持續(xù)產(chǎn)生，直至植物死亡（圖.7C)。與CTV33-Δ13-BY-⑶S-61類似，p23與3'NTR之間的位點能夠良好地容納較長基因，但上游基因的sgRNA水平有不同的效應(yīng)（圖5B與圖6B)〇[0104]使用濃縮CTV33-23-GUS-60接種阿雷檬植物，ELISA(數(shù)據(jù)未列出）和GUS基因活性分析（圖6C)證實植物已被感染。此外，GUS的活性和westernblots免疫印跡分析提示柑橘接種后1.3年仍有⑶S基因（圖6C與圖19)。[0105]實施例3:產(chǎn)生外源性多肽而不產(chǎn)生外源性次基因組mRNA[0106]內(nèi)部核糖體進入位點法（IRES)[0107]煙草燭紋病毒(TEV)IRES[0108]TEV的5'NTR介導(dǎo)病毒mRNA的非帽依賴性轉(zhuǎn)錄。關(guān)于TEV5'NTR的研究證實在一個雙順反子mRNA的內(nèi)部0RF啟動轉(zhuǎn)錄（Gallie，2001;NiepelandGallie，1999)。TEV5'NTR(1^82-144，基因庫登記號00986288)被插入？2301^之后的一個〇^微小復(fù)制子（在ntsl9020-19021之間），其后為GFP0RF(CTVp333R-23-ITEV-GFP)(圖7A)以研究雙順反子次基因組mRNA是否可應(yīng)用于該病毒。雖然諾瑟雜交(northernblot)分析顯示轉(zhuǎn)然后的本生煙原生質(zhì)體中微小復(fù)制子復(fù)制并產(chǎn)生大量的雙順反子mRNA(圖7C)，但未觀察到GFP熒光，提示雙順反子mRNA中第2個0RF無轉(zhuǎn)錄。研究也檢測了本生煙原生質(zhì)體和本生煙植物的全長CTV中5'NTRTEVIRES結(jié)構(gòu)。載體CTV33-23-ITEV-GFP-41能夠從原生質(zhì)體向下一代原生質(zhì)體有效傳代（圖7B)，提示病毒體有良好的復(fù)制和行程，但未觀察到熒光原生質(zhì)體，提示該IRES在CTV中效果不佳(數(shù)據(jù)未列出）。該載體感染本生煙植物并系統(tǒng)地移動，植物表現(xiàn)出系統(tǒng)性癥狀，即維管清空繼而壞死，ELISA也證實了這一點(數(shù)據(jù)未列出），但紫外線(UV)光下未觀察到GFP熒光(數(shù)據(jù)未列出）。[0109]活性核糖體互補序列(ARB)IRES[0110]從宿主和病毒1^財分析（基因工程產(chǎn)物3141?(：-1(861^8)11^5(4吐6作611〇￥6七al.，2004))得到IRES相同序列插入信息，在CTV中檢測其活性。該IRES在CTV微小復(fù)制子(CTVp333R-23-I3XARC-GFP)和Δp33CTV9R(CTV33-23-I3XARC-GFP-43)的p230RF(ntsl9020-19021)后融合，如上文所述（圖7A)。但感染原生質(zhì)體和植物之后，未觀察到GFP熒光，盡管二者中病毒復(fù)制良好(圖7B和C)。[0111]多肽融合[0112]p23是CTV中表達水平最高的基因，其多功能性蛋白對柑橘的感染至關(guān)重要。P23是一個沉默抑制子，通過由帶正電荷氨基酸殘基和氨基酸50-86之間的鋅指域組成的一個RNA結(jié)合域控制感染細胞中正反RNA比值(Lopezetal.，2000;Satyanarayanaetal.，2002b;Luetal.，2004)。為構(gòu)建基因融合，選擇TEV的HC-Pro或NIa蛋白酶基序與p23的C末端(ntsl9017-19018之間）融合（圖ShHC-Pro的蛋白酶識別序列與NIa在p23于蛋白酶之間和蛋白酶與GFP之間重復(fù)，分別構(gòu)建出載體CTV33-23-HC-GFP-72與CTV33-23-NIa-GFP-73(圖8)。若為HC-Pro，p23的蛋白酶基序的加工應(yīng)使得p23的C末端多出7個氨基酸;若為NIa，應(yīng)多出6個氨基酸。GFP蛋白從HC-Pro和NIa上剪切下來之后應(yīng)分別多出2個或1個氨基酸。轉(zhuǎn)換HC-Pro與NIa之間的識別序列構(gòu)建載體CTV33-23-HC0-GFP-74與CTV33-23-NIa0-GFP-75，作為不能剪切的對照（圖8)。在CTV二元載體中構(gòu)建所有多肽融合載體以感染植物，因原生質(zhì)體中p23融合不影響復(fù)制和傳代的活性(Tatineni與Dawson，結(jié)果未發(fā)表）。在本生煙浸潤煙葉中，所有載體的熒光程度彼此相等，與P23之后的空GFP載體也類似（圖9A)。此外，浸潤煙葉的westernblots免疫印跡分析提示多肽融合產(chǎn)生了幾乎完美的報告基因加工（圖10)AFP蛋白并未局限在核上（如與p23融合時），非由蛋白酶加工釋放報告基因。對植物進行土壤接種之后，只有攜帶蛋白酶及其同源加工位點的載體能夠系統(tǒng)性地移動到上部非接種煙葉。上部非接種煙葉的熒光較弱，弱于攜帶GFP、受各自控制子控制的表達載體CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40與CTV33-23-B-GFP-42(圖9B)。此外，觀察下表面的熒光比觀察葉片下表面容易（圖9C)。柑橘接種CTV33-23-HC-GFP-72之后，一株植物為陽性，但其ELISA結(jié)果相對地低于其他植物(數(shù)據(jù)未列出）。未檢測報告基因的活性。[0113]實施例4:在CTV載體中產(chǎn)生超過一個其他外源基因[0114]使用單一控制子元件表達多個蛋白[0115]為利用多肽法在CTV載體相同控制子元件的驅(qū)動下表達多基因，構(gòu)建含有GFP/蛋白酶(Pro)/GUS的融合多肽。在不同的載體中使用兩種不同的蛋白酶基序，HC-Pro與NIa，其各自的蛋白水解基序和識別序列將GFP0RF與⑶S0RF分隔開（圖14A與3-16)(Carrington與Dougherty，1988;Carringtonetal.,1989)。理論上，如果使用NIa作為融合時的蛋白酶基序，6個額外氨基酸與N末端蛋白（GFP)在C-末端耦合，而只有一個額外氨基酸添加到GUS的N-末端。類似地，雖然HC-Pro是融合多肽中的蛋白酶，在GFP的C末端增加7個額外的氨基酸，在GUS的N末端增加2個額外的氨基酸。融合基因的大小在3127與3480nts之間。[0116]替換pl3基因[0117]如上文所述兩個融合GFP/Pro/GUS替換土壤接種二元載體CTV的pl3位點，受BYSVCP-CE的控制（如為HC-Pro蛋白酶基序，受CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77的控制，如為NIa蛋白酶基序，受CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的控制）（圖11A)。構(gòu)建的載體經(jīng)土壤接種法進入本生煙，以監(jiān)測系統(tǒng)性感染植物及產(chǎn)生GUS和GFP的能力。根據(jù)各自的分析觀察到兩種基因均有產(chǎn)生（圖11B)Westernblots免疫印跡分析提示多肽融合后GFP蛋白的有效加工（圖10)。本生煙中病毒擴增并傳播形成高滴度，表現(xiàn)為上葉面癥狀(圖11B)，ELISA也證實了這一點。然而，GFP熒光水平低于只表達GFP的載體CTV33-Δ13-BY-GFP-57、CTV33-Δ13-G-GFP-65、CTV33-Δ13-B-GFP-66，進入非接種葉片的播散速率也慢于這些載體(數(shù)據(jù)未列出）。在本生煙植物中，重疊熒光和GUS酶活性分析顯示注射后7個月載體仍保持穩(wěn)定（圖12)〇[0118]在p23與3'NTR之間插入[0119]為嘗試提高GFP與GUS的表達水平，將融合多肽移動到更靠近3'NTR的位點。含HC-Pro蛋白酶的BYSV、GLRaV-2或BYVCP-CE構(gòu)建的融合基因被插入p23與3'NTR之間，形成CTV33-23-BY-GFP-HC-⑶5-51、0'￥33-23?卩卩-!1(：-61]5-53與(：1'￥33-23-8￥-6卩？-!1(：-61]5-55，如果結(jié)構(gòu)中蛋白酶為NIa，則分別稱為CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54和CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-56(圖13)。本生煙植物經(jīng)土壤接種后，所有構(gòu)建體擴增，GFP熒光（圖14A)與GUS活性（圖14A)證實構(gòu)建體播散進入上部非接種葉片。與CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77和CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78構(gòu)建體相似的時，熒光重疊加GUS酶活性分析提示注射后7個月融合仍具有穩(wěn)定性。然而，注射了構(gòu)建體CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51的阿雷檬植物僅有弱熒光，幾乎無GUS活性（圖14B)和高ELISA值。[0120]實施例5:使用多啟動子同時表達外源基因[0121]CTV中的雙分子熒光互補(BiFC)。為了研究插入兩個CP-CE控制的不同0RF，使用了BiFC系統(tǒng)，該系統(tǒng)僅當兩個蛋白在同一細胞中蓄積才能夠產(chǎn)生可見的熒光。該系統(tǒng)的開發(fā)是使用bjun與EYFP的N末端融合(A.A.1-154)(稱為bJunN)和bFos0RF與EYFP的C末端融合(Α·Α·155-238)(稱為bFosC)(Huetal.，2002)。[0122]兩種蛋白均被轉(zhuǎn)運至核，直接相互作用使得EYFP蛋白獲得野生型的這點特性，一經(jīng)藍光照射活化后釋放熒光（刺激波長為525nm，釋放波長為575nm)(Huetal.，2002)。向CTVp230RF的3'微小復(fù)制子中引入BiFC的一個或兩個成分(在nts#19020-19021之間，基因庫登記號AY170468)，稱為CTVp333R-23-BYbJunN、CTVp333R-23-GbFosC與CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC(圖15A)。諾瑟雜交(Northernblot)分析顯示所有三種構(gòu)建體均能成功地轉(zhuǎn)染本生煙原生質(zhì)體(圖15B)。兩種轉(zhuǎn)錄因子在植物細胞中相互作用，核熒光觀察到只有在感染了CTVp333R-23-BYbJunN-GBFosC的原生質(zhì)體中才會出現(xiàn)熒光（圖15C)。應(yīng)注意到兩個插入基因的大小約等同于GUSORF。[0123]研究者也將基因分別引入p23之后的AP33CTV9R，構(gòu)建載體CTV33-23-BYbJunN-97與CTV33-23-GbFosC-98作為BiFC實驗的對照，僅產(chǎn)生一種成分（圖16B)。兩種構(gòu)建體核均無熒光。[0124]多個外源基因在同一部位同時表達[0125]替換P13。向Δp33CTV9R中引入兩種基因（Satyanarayanaetal·，1999，2000，2003;Tatinenietal.,2008)替換pl3基因（替換17292-17581之間刪除的核苷酸），構(gòu)建CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76(圖16A)。用CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76的RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體后觀察到核熒光(數(shù)據(jù)未列出）。類似地，本生煙植物浸潤過全長CTV33-A13-BYbJunN-GbFosC-76的葉片釋放核熒光（圖16B)。相反，浸潤了構(gòu)建體CTV33-23-BYbJunN-97和CTV33-23-GbF〇sC-98的葉片無仍和核熒光（數(shù)據(jù)未列出）。監(jiān)測浸潤了CTV33-A13-BYbJunN-GbFosC-76的本生煙莖韌皮部和葉脈絡(luò)，觀察到在浸潤后7軸維管組織仍有熒光，提示該構(gòu)建體能夠系統(tǒng)性感染本生煙上部葉片（圖16B)。[0126]在P23與3'NTR之間插入。下一步是評估兩個基因放置于更靠近3'末端時的表達情況。將BiFC系統(tǒng)的兩個基因插入p23之后的CTVAp33(在nts#19020-19021之間），構(gòu)建CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59(圖3-17A)。構(gòu)建體CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59完成RNA轉(zhuǎn)染后，感染的原生質(zhì)體熒光顯微鏡圖片顯示核熒光。但很難將新的構(gòu)建體從一批原生質(zhì)體傳遞給下一批，這種情況與在同一位點插入GUS和GFP/Pro/GUS融合基因的情況相似。本生煙土壤接種全長CTV中的CTV33-23-BYbJun-GbF〇sC-59之后，浸潤部位觀察到熒光。系統(tǒng)性癥狀與本生煙感染CTV后的癥狀相符，但顯著延遲發(fā)生。但監(jiān)測上部非浸潤葉片和莖韌皮部組織觀察到葉片土壤浸潤后7周，維管組織仍有核熒光，證實了載體的系統(tǒng)性感染（圖17C)。這些結(jié)果徑ELISA核實，表明在p23和3'NTR之間能夠插入兩個外源基因而不影響CTV系統(tǒng)性侵襲植物的能力。與兩種基因替換P13構(gòu)建的CTV33-A13-BYbJunN-GbFosC-76相似的是，構(gòu)建體CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59在上部維管組織中擴增的時間框也有延遲。系統(tǒng)性莖韌皮部組織的核熒光顯示CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76感染細胞多于CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59感染細胞（圖16B與圖17C)。感染細胞數(shù)量上的查體提示CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76轉(zhuǎn)移進入本生煙的能力強于CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59。[0127]實施例6:多個外源基因在不同部位同時表達[0128]為了在兩個不同部位表達多個外源基因，研究者選擇替換P13基因并在其后插入第2個基因。通過用BYSVCP-CE驅(qū)動的bJunN0RF替換pl3基因并在p230RF與3'NTR之間插入GLRaV-2CP-CE控制的bFosC0RF構(gòu)建CTV33-A13-BYbJunN-23-GbFosC-67(圖17A)<XTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC_67轉(zhuǎn)染進入原生質(zhì)體，諾瑟雜交(Northernblot)分析證實了病毒的復(fù)制（圖17B)。然而p23mRNA的蓄積顯著減少。將CTV33-A13-BYbJunN-23-GbFosC-67經(jīng)過土壤接種法接種進入本生煙。葉片浸潤后感染的細胞顯示出核熒光（圖17C)，但感染細胞的數(shù)量顯著低于構(gòu)建體CTV33-A13-BYbJunN-GbFosC-76與CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59。感染后的原生質(zhì)體顯示成功形成具有生物學(xué)活性的蛋白體。然而，本生煙中未實現(xiàn)系統(tǒng)性感染，莖和上部非接種葉片無核熒光，ELISA進一步證實了這一點。[0129]為了進一步研究同時表達不同位點的多個基因，構(gòu)建CTV33-A13-BYGUS-23-GGFP-71使得GUS0RF受BYSVCP-CE的控制并替換pl3基因（ntsl7292-17582)，GFP0RF受GLRaV-2CP-CE的控制，被插入p23與3'NTR之間（ntsl9020-19021)(圖18A)XTV33-Δpl3-BYGUS-23-GGFP-71的RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染本生煙原生質(zhì)體，諾瑟雜交(Northernblot)分析提示構(gòu)建體在原生質(zhì)體中有效復(fù)制（圖18B)。本生煙植物的葉片浸潤構(gòu)建體CTV33-Δp13-BYGUS-23-GGFP-71之后，紫外線(UV)光下課件熒光和GUS活性測定均顯示病毒復(fù)制(數(shù)據(jù)未列出）。土壤接種的植物開始表現(xiàn)出GUS活性，浸潤后6周上部非接種葉片仍有熒光（圖3-18C)。上部葉片的系統(tǒng)性感染略慢于僅含有GFP的構(gòu)建體。此外，本生煙維管系統(tǒng)感染CTV之后出現(xiàn)維管清空繼而壞死，發(fā)生時間晚于單基因載體。紫外線(UV)光下觀察到的熒光水平似乎略低于單基因構(gòu)建體。但感染了受自身CT控制的CTV33-Δp13BYGUS-23GGFP-71構(gòu)建體的GFP熒光比融合構(gòu)建體（CTV33-23-BY-GFP-HC-⑶S-51、CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53、CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54、CTV33-A13-BYGFP-HC-GUS-77和CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78)顯著。兩種基因的活性持續(xù)到本生煙植物死亡。類似地，在柑橘中，兩種基因的表達也超過構(gòu)建體CTV33-A13-BYGFP-NIa-GUS-78和CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51中的相同基因。[0130]實施例7:在柑橘中不同構(gòu)建體的外源基因表達水平[0131]很難直接比較柑橘中不同載體的外源基因表達水平，因存在感染時間、組織年齡、插入外源基因盒對病毒復(fù)制的影響等混雜因素。但柑橘中存在的蛋白是最好的表達水平測量方法。因此使用westernblots免疫印跡分析比較柑橘中不同的GFP與⑶S構(gòu)建體相對于看家基因CP蛋白的表達水平，以測定復(fù)制水平。使用GFP抗體和CP抗體的westernblots免疫印跡分析提示基因組越靠近3'端表達水平越高的趨勢，插入的基因遠離3'端時表達水平下降，但在P13和p20之間插入基因為例外情況（圖19A)。相反，柑橘中的GUS表達提示替換P13后表達水平高于在p23之后插入(圖19B)。[0132]實施例8:多個基因載體[0133]質(zhì)粒的構(gòu)建：[0134]通過向CTV基因組的不同位點引入不同的基因盒組合構(gòu)建三個和四個基因的載體。在PCAMBIA1380背景下在CTV9RAp33構(gòu)建三個載體（CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79、CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81與CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82)。在PCAMBIA1380背景下通過修飾CTV9R、用番茄褪綠病毒p220RF替換潮霉素0RF構(gòu)建其余三個三基因載體（CTV-BASL-BYPTA-CP7-119、CTV-BASL-BYP10-CP7-131、CTV-BASL-BYPTA-CP10-?20和CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117)和一個四基因載體（CTVΔ13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118)。為了便于擴增全長CTV9R中p330RF的PstI限制位點，需消化全長CTV9R，使用重疊延伸PCR(引物1749與1750聯(lián)合引物C-1436與C-253)引入沉默突變，再用Xmal和Pmel消化重疊PCR產(chǎn)物與CTV9R。多數(shù)基因盒通過重疊延伸PCR使用表1中所列引物成功地進入需插入位點。但CPm和CP記憶之間的綠色熒光蛋白周期3未能插入。通過用Pmel、PstI對9-47RGFP質(zhì)粒和pCAMBIAl380中點突變的CTV9R進行限制性消化和將GFPC3基因盒插入位點。[0135]同時表達三個和四個外源性基因[0136]成功地在本生煙和柑橘中表達受1個和2個不同控制子元件控制的2個基因之后，我們開始構(gòu)建載體表達3個和4個不同控制子元件分別控制的3個和4個外源基因。不同組合中所用的報告基因為綠色熒光蛋白（周期3GFP，GFPC3)、紅色熒光蛋白（標簽紅色熒光蛋白，RFP)、使用bFos和bjun哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子的雙分子熒光互補(Huetal.，2002)、來自大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因和番茄花葉病毒(TMV)衣殼蛋白基因（CP)。類似地，在不同組合中構(gòu)建三基因載體表達來自中國鱟和野豬的兩個抗微生物肽(AMP)，即大蒜凝集素(ASL)與半夏凝集素(PTA)。在CTV基因組的2個或3個位點表達三基因載體。[0137]同時表達三個不同位點的三個外源基因：[0138]構(gòu)建6個載體表達來自3個不同位點的3個外源基因。構(gòu)建載體表達來自CTV9RAP33或全長CTV9R的基因。[0139]構(gòu)建載體表達來自CTV9RΔP33中三個不同位點的三個基因[0140]通過向CTV9RAP33中插入三個外源基因盒構(gòu)建兩個表達載體CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79(圖26)和CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82(圖28)。CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79表達GFP(在CPm與CP之間插入）、⑶S(在pl3與p20之間插入)和TMV衣殼蛋白（在p23與3'UTR之間插入）、分別受BYV、BYSV和GLRaV-2的CP-CE控制的三個0RF<XTV33-A13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82表達GFP0RF(在CPm與CP之間插入）、bJunN0RF(替換p13)和bFOsC(在p23與3'UTR之間插入），分別受BYV、BYSV和GLRaV-2的CP-CE控制。這兩個載體聯(lián)合沉默抑制子浸潤本生煙葉，并使用Gowdaetal.，2005創(chuàng)造的方法接種柑橘。本生煙葉浸潤后5天切割葉片、研磨后用超過70%蔗糖片梯度分離病毒體，似乎這些植物不太可能有系統(tǒng)性感染，故丟棄。手持UV下浸潤葉片的熒光顯示在CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79與CTV33-A13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82中均有GFP蛋白表達，提示構(gòu)建的載體能夠在本生煙葉中復(fù)制。從浸潤CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79與CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82的本生煙葉的葉尖制備電鏡標本，結(jié)果顯示形成病毒體，即成功接種柑橘幼苗的首要條件。進一步地，僅對于CTV33-BGFP-BY⑶S-GTMVCP-79，發(fā)現(xiàn)形成桿狀結(jié)構(gòu)，成為TMV假病毒體，是TMV-顆蛋白表達的特征。[0141]構(gòu)建載體表達CTV9R中三個不同部位的三個基因[0142]構(gòu)建四個載體表達來自CTV基因組三個不同部位的三個外源基因。選擇的三個部位分別是在CPm與CP之間插入、在pl3與p20之間插入和在p23與3'UTR之間插入。為便于擴增進入全長CTV，通過引入沉默點突變和重疊延伸PCR消除p330RF中的PstI位點。使用兩個AMP、ASL和PTA的不同組合構(gòu)建四個載體中的三個，SPCTV-BASL-BYPTA-CP7-119、CTV-BASL-BYP10-CP7-131和CTV-BASL-BYPTA-CP10-120。第四個表達載體CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117的構(gòu)建是插入受BYV、BYSV和CTV重復(fù)CP-CE控制的GFP、RFP和TMVCP。所有這些載體均浸潤本生煙以監(jiān)測系統(tǒng)性感染的發(fā)生。CTV-BASL-BYPTA-CP7-119能夠有效地浸潤本生煙植物。浸潤載體CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117的植物全部葉片在手持UV下課件熒光。發(fā)現(xiàn)有突出的系統(tǒng)性感染之后，使用蔗糖梯度片濃縮CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117病毒體，以便接種柑橘，與載體CTV-BASL-BYPTA-CP7-119操作過程相似。[0143]同時表達來自兩個不同部位的三個外源基因：[0144]構(gòu)建兩個載體表達來自CTV基因組中兩個不同部位的三個外源基因：在CTV9RAP33中構(gòu)建一個表達載體CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81，在全長CTV9R中構(gòu)建另一個載體CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129〇[0145]構(gòu)建載體表達來自CTV9RAP33中兩個不同位點的三個基因：[0146]修飾CTV9RAp33,在CPm與CP之間插入單一基因盒(GFP0RF，受BYVCP-CE的控制）、在p23與3'UTR之間插入一個雙基因盒(bFosCORF和其后的bJunNORF，分別受GLRaV-2與BYSVCP-CE的控制）構(gòu)建CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81(圖27)。將4中不同的沉默抑制子與CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81的1:1混合液浸潤本生煙葉。葉尖電鏡照片顯示形成病毒體，與〇^33-86卩？-8￥61]5-6了]\^^-79、(：1'￥33-八13-86卩？-8￥1^111^-6匕卩〇8(：-82相似。此外，浸潤的葉片在手持UV光下發(fā)現(xiàn)強熒光。使用浸潤葉片在70%蔗糖片上濃縮病毒體，以便感染柑橘幼苗。[0147]構(gòu)建載體表達CTV9R中兩個不同位點的三個基因：[0148]向CTV9R中插入一個雙基因盒（bFos0RF與其后的bJunN0RF，分別受GLRaV-2與BYSVCP-CE的控制）替換pl3,在p23于3'UTR之間插入一個基因盒(TMVCP0RF，受雙重CP-CE的控制），構(gòu)建表達載體CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129(圖21)。該載體浸潤本生煙葉。在系統(tǒng)地感染本生煙葉之后，將濃縮病毒體使之能夠接種柑橘類植物。[0149]同時表達三個不同位點的四個外源基因：[0150]為構(gòu)建四基因載體，我們使用了CTV基因組中三個不同位點的四基因盒。在CPm與CP之間插入RFP0RF(受BYVCP-CE的控制），用兩個BiFC成分bFosC和bJunN替換pl3基因，(分別受GLRaV-2和BYSV的控制），在p23之后插入TMV0RF(受CTV雙重CP-CE的控制）。用該四基因載體CTVA13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118浸潤本生煙葉以系統(tǒng)地感染植物。在系統(tǒng)地感染本生煙葉之后，將使用蔗糖梯度和蔗糖片濃縮病毒體使之能夠接種柑橘類植物。[0151]與實施例1-8相關(guān)的討論[0152]本研究發(fā)現(xiàn)CTV構(gòu)建體極易在基因組3'部分的不同位點插入外源序列。我們構(gòu)建并分析了大量可能的載體構(gòu)建體，通過添加次基因組RNA、雙順反子mRNA或?qū)θ诤系鞍椎牡鞍酌高M行加工來表達外源基因。其中多數(shù)構(gòu)建體可作為載體。此外，本文介紹的CTV構(gòu)建體能夠同時表達大量的多個外源蛋白或肽段。[0153]總目的是開發(fā)天然CTV宿主柑橘中的高表達、穩(wěn)定的載體。因此對12種能夠中度至顯著傳播并表達外源蛋白的不同構(gòu)建體感染的本生煙中病毒體進行濃縮，以接種柑橘。接種后6-60周阿雷檬能否感染陽性取決于病毒中插入體的長度和從本生煙葉中濃縮用于接種的病毒體數(shù)量。多數(shù)構(gòu)建體感染柑橘后產(chǎn)生中等水平的報告基因。[0154]使用多種方法表達來自CTV的外源基因。第一種方法是"添加基因"，包括添加或復(fù)制控制子元件，和增加0RF，產(chǎn)生次基因組RNA。"添加基因"方法最初應(yīng)用于在TMV中通過復(fù)制CP次基因組啟動子控制外源基因（Dawsonetal.，1989;Donsonetal.，1991;Shivprasadetal.,1999)。該方法的一個優(yōu)點在于能夠準確表達蛋白，在N末端和(或)C末端不增加可能影響生物學(xué)活性的氨基酸，表達水平相對較高。但該方法也存在一些必須注意的局限性?？刂谱釉?fù)制產(chǎn)生同源性重組，引起目標基因的丟失（Chapmanetal.，1992;Dawsonetal.,1989)。盡管這使得TMV插入體不穩(wěn)定，似乎基本不影響CTV的穩(wěn)定性(Folimonovetal.,2007)。使用相關(guān)病毒的異源性控制子元件有助于穩(wěn)定TMV的插入。然而，病毒復(fù)制酶復(fù)合體對異源性控制子元件的識別通常具有差異性(Folimonovetal.，2007;Shivprasadetal·，1999)。這一點可用于調(diào)控目標基因的表達水平（Shivprasadetal.，1999)。一個重要的考慮因素是病毒不同次基因組RNA之間存在競爭。對于TMV，外源基因與衣殼蛋白基因和移動基因競爭。似乎這三種RNA匯總的次基因組RNA產(chǎn)量具有一個最大水平。導(dǎo)致一種表達量增高的操作將引起其他RNA表達量下降。一個解決辦法是減少衣殼蛋白的表達，以優(yōu)化外源基因和移動基因的表達（Shivprasadetal·，1999;Girdishivellietal.，2000)。然而，CTV次基因組mRNA似乎競爭力較弱（Folimonovetal.，2007;Ayll0netal·，2003)〇[0155]現(xiàn)有技術(shù)建立了一種在柑橘樹中有效、穩(wěn)定的CTV載體，能夠表達CP與CPm之間的外源基因。該外源基因位于3'端的第6位點（Folimonovetal.，2007)。外源基因位點的選擇是隨機的。研究者繼續(xù)進行載體設(shè)計，以嘗試定義對CTV基因組操作的范圍以產(chǎn)生外源蛋白或肽段。該病毒通過sgmRNA表達3'端的10個基因（Hilfetal.，1995)<XTV基因表達的一個原則是靠近3'端的基因轉(zhuǎn)錄量大于內(nèi)部基因。例如，天然位點在3'端第10位點的p33基因轉(zhuǎn)錄量相對偏低，但移至靠近3'端之后轉(zhuǎn)錄量極高（Satyanarayanaetal.，1999)。因此，越靠近3'端位點，外源基因的表達量越高于第1個載體中隨機選擇的位點6(Fo1imonovetal.，2007)。然而，根據(jù)其他病毒的分析結(jié)果，病毒基因組內(nèi)只有某些位點能夠耐受外源基因的插入。例如，對于TMV或苜?；ㄈ~病毒，CP與3'NTR之間的位點不能耐受基因插入(Dawsonetal·，1989;LehtoandDawson,1990;Sanchez-Navarroetal·，2001)<XTV中替換pl3、在pl3與p20之間插入和p23與3'NTR之間插入的幾乎所有構(gòu)建體均有活性。相反，發(fā)現(xiàn)該病毒不能耐受的插入點是在P20與p23之間?？赡艿脑蚴沁@種插入干擾了其他相鄰基因的轉(zhuǎn)錄。[0156]另一種在病毒載體中表達外源基因的方法包括框內(nèi)融合目標基因的0RF與病毒基因0RF的N末端或C末端?？赏ㄟ^加工蛋白酶和兩個蛋白之間的位點釋放兩種蛋白（Doljaetal·,1997;Gopinathetal·,2000)。該方法最初應(yīng)用于Potyvirus屬煙草蝕刻病毒(Doljaetal.，1992)。多蛋白融合方法的主要優(yōu)點在于外源蛋白與病毒蛋白的表達比為1:1。主要局限性在于兩種蛋白的N和(或)C末端會添加多余的氨基酸，可能影響蛋白的生物學(xué)活性。[0157]構(gòu)建了一系列載體，利用Potyvirus屬HC-Pro或NIa蛋白酶能夠?qū)Χ嗟鞍走M行轉(zhuǎn)錄后加工釋放游離的GFP、蛋白酶和p23蛋白。這些載體能夠系統(tǒng)地感染本生煙。這些構(gòu)建體的系統(tǒng)運動慢于僅含有一個外源基因GFP0RF的表達載體。系統(tǒng)性運動緩慢和GFP的系統(tǒng)表達水平較低的部分原因可能是P23C末端多于的氨基酸降低了RNA沉默抑制活性，或擴增病毒RNA的能力，或蛋白酶的加工延緩了其活性。雖然這些構(gòu)建體未產(chǎn)生最大量的外源性蛋白，但這些活性載體仍表達了大量GFP。[0158]識別CTV基因組中能容納外源性基因插入的位點之后，發(fā)明人設(shè)計新的方法構(gòu)建病毒載體以表達多個基因。第一個方法需使用單一的控制子元件驅(qū)動多肽基因的轉(zhuǎn)錄。融合基因中包括GFP/Pro/GUS，大小為3127nts-3480nts。其他方法利用兩個外源性CE同時產(chǎn)生兩個外源性sgRNA。該方法能夠在一個位點或兩個不同位點靈活地插入兩個串聯(lián)基因。兩種方法均有效。[0159]整株植物中異源性蛋白的表達通常伴隨著轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展，需將外源性DNA插入質(zhì)?；蚝嘶蚪M中。質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因僅在少數(shù)一年生作物中成功實現(xiàn)。核轉(zhuǎn)基因所需時間和成功率因不同作物而異。某些植物不易轉(zhuǎn)基因和后續(xù)的再生處理。該方法存在一些缺點，特別是對于多年生作物而言。例如柑橘幼苗期時間較長，再生后需評估種植特征的時間和有商業(yè)應(yīng)用的時間均需延長。另一個主要的缺點是轉(zhuǎn)基因局限于下一代植物。[0160]發(fā)明人現(xiàn)在開發(fā)了多種不同的CTV載體，各有不同特點可在具體環(huán)境下提高效率。例如研究者使用"添加基因"載體能夠促進CTV中小基因在p23基因3'端的表達，盡可能實現(xiàn)最大化表達。中等大小的基因在pi3區(qū)域的表達效率更尚。較大的基因很可能最好在CP于CPm之間插入，較少地干擾病毒次基因組RNA，從而更好地侵襲植物。為了表達小蛋白、肽段或RNA以致目標RNA沉默，病毒可以容納3個或3個不同的基因。可選擇不同的外源性sgRNA和蛋白酶加工組合。盡管可從其他病毒產(chǎn)生兩種外源性蛋白，CTV因其穩(wěn)定性仍有大量應(yīng)用。原代載體持續(xù)產(chǎn)生GFP可達8年。[0161]使用基于CTV的表達載體從開發(fā)至今已經(jīng)經(jīng)過很多演化。該載體最初是作為改善柑橘生長的實驗室工具。該載體被設(shè)計用于表達可能轉(zhuǎn)化柑橘的基因。異源性基因在柑橘中的效果，特別是對成熟組織或果實的效果可在直接轉(zhuǎn)化結(jié)果出現(xiàn)之前通過病毒年獲得，但柑橘產(chǎn)業(yè)的條件和需求已經(jīng)被新出現(xiàn)的細菌性疾病黃龍病(HLB)所影響。這種疾病快速傳播，具有顯著的破壞力，威脅著柑橘產(chǎn)業(yè)的存貨。最初CTV載體被用于識別有抗HLB細菌活性的抗微生物肽，以便轉(zhuǎn)入柑橘體內(nèi)。但該疾病播散速度過快，轉(zhuǎn)基因植物不能夠及時拯救柑橘產(chǎn)業(yè)。因CTV載體具有顯著的穩(wěn)定性，該載體目前被用于保護柑橘樹和治療病株，直至出現(xiàn)抗感染的轉(zhuǎn)基因植物。CTV載體在對抗柑橘侵襲性疾病領(lǐng)域是一個有效的工具，這僅是病毒載體可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的一個案例。CTV載體等極穩(wěn)定載體對多年生植物，特別是樹木的應(yīng)用具有良好的前景。很多樹木能夠存活100年甚至更久。在樹木的生命周期中，科技在不斷進步，疾病和蟲害壓力也在不斷變化。為通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法改善樹木，需要將目前田地中所有樹木清除、重新終止。而使用病毒載體可向現(xiàn)有樹木中添加新的基因。[0162]參考文獻[0163]Ahlquist,P.,French,R.,Janda,M.,Loesch-Fries,L.S.,1984.MulticomponentRNAplantvirusinfectionderivedfromclonedviralcDNA.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA8,7066-7070.[0164]Akbergenov,R.,Zhanybekova,S.,Kryldakov,R.V.,Zhigailov,A.,Polimbetova,N.S.,Hohn,T.,Iskakov,B-K.,2004.ARC-1,asequenceelementcomplementarytoaninternal18SrRNAsegment,enhancestranslationefficiencyinplantswhenpresentintheleaderorintercistronicregionofmRNAs.NucleicAcidsRes.32,239-247.[0165]Allison,R.F.,Dougherty,ff.G.,Parks,T.D.,Willis,L.,Johnston,R.E.,Kelly,M.,[0166]Armstrong,F.B.,1985.Biochemicalanalysisofthecapsidproteingeneandcapsidproteinoftobaccoetchvirus:N-terminalaminoacidsarelocatedonthevirion'ssurface.J.Virol.147,309-316.[0167]Andrade,M.,Sato,M.,Uyeda,I.,2007.TworesistancemodestoCloveryellowveinvirusinpeacharacterizedbyagreenfluorescentprotein-taggedvirus.Phytopathology97,544-550.[0168]ΑγΙΙ?η,Μ.Α.,Gowda,S.,Satyanarayana,T.,Karasev,A.V.,Adkins,S.,Mawassi,M.,Guerri,J.,Moreno,P.,Dawson,ff.0.,2003.EffectsofmodificationofthetranscriptioninitiationsitecontextoncitrustristezavirussubgenomicRNAsynthesis.J.Virol.77,9232-9243.[0169]Balvay，L.，SotoRifo，R.，Ricci，Ε·Ρ·，Decimo，D.，0hlmann，T·，2009.StructuralandfunctionaldiversityofviralIRESes.Biochim.Biophys.Actal789,542-557.[0170]Bau1combe，D·C·，Chapman，S·，SantaCruz,S.,1995.Jellyfishgreenfluorescentproteinasare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物，其中所述植物為樹木。15.如權(quán)利要求13所述的植物，其中所述植物為柑橘樹。16.-種感染樹木來表達異源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒載體轉(zhuǎn)染樹木的至少一個細胞，所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含至少一個基因盒，所述基因盒包含編碼異源性多肽的多核苷酸，所述CTV病毒載體被構(gòu)建成所述基因盒被插入CTVp13基因位點。17.-個CTV病毒載體被構(gòu)建成包含一個基因盒，所述基因盒包含編碼異源性多肽的多核苷酸和與之相連的IRES序列。18.如權(quán)利要求17所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒與pl3、p20或p23基因融合。19.一種植物包含至少一個被權(quán)利要求17所述CTV病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞。20.-種感染樹木來表達異源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒載體轉(zhuǎn)染樹木的至少一個細胞，所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含至少一個基因盒，所述基因盒包含編碼異源性多肽的多核苷酸和與之相連的IRES序列。21.-個CTV病毒載體被構(gòu)建成包含一個基因盒，所述基因盒包含編碼第一異源性多肽的多核苷酸序列、剪切位點兩端加工過的蛋白酶、和第二異源性多肽的多核苷酸序列。22.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述蛋白酶位于所述第一異源性多肽和第二異源性多肽之間。22.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒進一步包括一個次基因組mRNA控制子元件，位于編碼第一異源性多肽的多核苷酸上游。23.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述多核苷酸包括編碼異源性多肽的序列。24.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述多核苷酸進一步編碼外源性蛋白序列和蛋白酶，并且蛋白酶識別位點在第一和第二異源性多肽序列之間。25.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒被插入來替換一個內(nèi)源性基因。26.如權(quán)利要求25所述的CTV病毒載體，其中所述內(nèi)源性基因為pl3。27.如權(quán)利要求21所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒位于CTV基因組的pl3-p20、p20-p23或p23-3'NTR區(qū)域。28.-種植物包含至少一個被權(quán)利要求21所述CTV病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞。29.-個CTV病毒載體被構(gòu)建成包含一個基因盒，所述基因盒包含編碼一個異源性多肽的多核苷酸序列和一個剪切位點兩端與病毒蛋白相同閱讀框融合的蛋白酶。30.如權(quán)利要求29所述的CTV病毒載體，其中所述蛋白酶位于所述病毒蛋白和所述異源性多肽之間。31.如權(quán)利要求29所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒與一個內(nèi)源性CTV基因融合使內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄和所述多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄同時發(fā)生。32.如權(quán)利要求31所述的CTV病毒載體，其中所述內(nèi)源性基因為pl3、p20或p23。33.-種感染樹木來表達異源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒載體轉(zhuǎn)染樹木的至少一個細胞，所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含至少一個基因盒，所述基因盒包含編碼一個第一異源性多肽和一個第二異源性多肽的多核苷酸序列。34.-個CTV病毒載體被構(gòu)建成包含第一基因盒和第二基因盒，其中第一基因盒包含編碼第一異源性多肽的多核苷酸序列和所述第一異源性序列上游的第一控制子元件;第二基因盒包含編碼第二異源性多肽的多核苷酸序列和所述第二異源性序列上游的第二控制子元件。35.如權(quán)利要求34所述的CTV病毒載體，其中所述第一和第二基因盒依序位于所述CTV病毒載體的相同部位。36.如權(quán)利要求34所述的CTV病毒載體，其中所述第一和第二基因盒位于所述CTV病毒載體的兩個分離的位點。37.如權(quán)利要求35所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒位于CTV病毒基因組的pl3-p20、p20-p23或p23-3'NTR區(qū)域。38.如權(quán)利要求36所述的CTV病毒載體，其中所述基因盒位于CTV病毒基因組的pl3-p20、p20-p23或p23-3'NTR區(qū)域。39.如權(quán)利要求36所述的CTV病毒載體，其中所述一個或兩個基因盒被插入來替換一個內(nèi)源性基因，并且所述第二基因盒的位點與第一基因盒的位點分離。40.如權(quán)利要求39所述的CTV病毒載體，其中所述內(nèi)源性基因為pl3。41.一種植物包含至少一個被權(quán)利要求34所述CTV病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞。42.-種感染樹木來表達異源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒載體轉(zhuǎn)染樹木的至少一個細胞，所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含第一基因盒和第二基因盒，其中第一基因盒包含編碼第一異源性多肽的多核苷酸序列和所述第一異源性序列上游的第一控制子元件；第二基因盒包含編碼第二異源性多肽的多核苷酸序列和所述第二異源性序列上游的第二控制子元件。43.如權(quán)利要求1所述的載體，其中所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含位于一個或多個位點的多個基因盒。44.如權(quán)利要求43所述的載體，其中所述CTV病毒載體包含至少兩個基因盒位于一個位點和至少一個基因盒位于一個不同位點。45.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述CTV病毒載體被構(gòu)建成包含位于一個或多個位點的多個基因盒。46.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述CTV病毒載體包含至少兩個基因盒位于一個位點和至少一個基因盒位于一個不同位點。47.如權(quán)利要求34所述的載體，其進一步包括一個第三基因盒，所述第三基因盒包含編碼第三異源性多肽的多核苷酸序列和所述第三異源性序列上游的第三控制子元件。48.如權(quán)利要求47所述的載體，其進一步包括一個第四基因盒，所述第四基因盒包含編碼第四異源性多肽的多核苷酸序列和所述第四異源性序列上游的第四控制子元件。49.如權(quán)利要求47所述的載體，其中所述第三基因盒在所述CTV載體上的位點與第一和第二基因盒相同或不同。50.如權(quán)利要求48所述的載體，其中所述第三和第四基因盒在所述CTV病毒載體上同一位點按序排列。51.如權(quán)利要求48所述的CTV病毒載體，其中所述第三和第四基因盒位于所述CTV病毒載體上兩個分離的位點?！疚臋n編號】C12N15/83GK105939599SQ201280056898【公開日】2016年9月14日【申請日】2012年9月21日【發(fā)明人】威廉·歐·多森,斯維特拉娜·弗里莫諾娃,卓阿·埃爾默塔【申請人】佛羅里達大學(xué)研究基金會有限公司