一種提高烏鱧三倍體育成率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高烏鱧三倍體育成率的方法，包括如下步驟：他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備、對烏鱧母本進(jìn)行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料、冷休克+靜水壓處理、雌激素抑制劑溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制劑溶液中常溫浸泡、取魚苗投喂氯米芬幼體料、取雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式獲得三倍體。通過此方法，可獲得100%的烏鱧三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要的是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無污染。
【專利說明】
一種提高烏鱧三倍體育成率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及烏鱧的多倍體繁育方法，具體涉及一種提高烏鱧三倍體育成率的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏鱧俗稱黑魚，生性兇猛，繁殖力強(qiáng)，胃口奇大，體色呈灰黑色，生長速度快。三倍 體烏鱧的不育特征，使其在抗逆性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技 術(shù)中，不育三倍體烏鱧是通過四倍體與二倍體倍間雜交獲得，但要獲得98%以上的三倍體烏 鱧，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體魚系。
[0003] 在魚類遺傳育種中，通常利用冷/熱休克，或通過雜交等方法抑制受精卵的第一次 有絲分裂或直接異源染色體加倍，制備出同源或異源四倍體魚，其中冷休克一般是與靜水 壓處理一起，難以獲得較高純度的四倍體系，而熱休克的方式雖然易于操作，同樣，難以獲 得純度高的四倍體系;而雜交的方法雖然純度高，但成功率低、周期長。此外，上述這些方法 制備的四倍體魚，有些可育、有些又不可育，同時(shí)也可能存在基因混雜現(xiàn)象（異源四倍體）， 容易造成生物危險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定的提高烏鱧三 倍體育成率的方法。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種提高烏鱧三倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏鱧人工飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為15~20g/kg飼料，待用； (2) 投喂:在烏鱧母本產(chǎn)卵前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對烏鱧母本進(jìn)行投喂他莫 昔分喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g烏體母本投喂15~20g，下午6:00每100g烏體母本 投喂10~15g;至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄烏鱧放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精 卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為-1~I. (TC的冷水中，靜水壓壓力為180~300Kg/cm2,持續(xù)時(shí)間 為2~3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為60~120mg/l，睪酮 的濃度為20~80mg/l; (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加10~15g氯米芬， 每次投喂量為每萬尾20~40g加有氯米芬的幼體料，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而 獲得雄性烏鱧四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明給母本飼喂他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的雙重 作用的同時(shí)，將受精卵第一次卵裂時(shí)間推延3_5min，并提高了所有受精卵第一次卵裂的同 步度(可達(dá)99%)，為染色體加倍和提高其四倍體率提供了時(shí)間保障和奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ);2、在 受精卵一次卵裂采用冷休克與較低的靜水壓(低于常用的350kg/cm 2)，以及較短的處理時(shí) 間（低于5min)，不僅有效降低了因?yàn)槔湫菘藭r(shí)間過長、壓力過高對受精卵的破壞程度，提高 受精卵的成活率，而且降低了操作難度和加壓成本;3、雌激素抑制劑溶液浸泡以及投喂氯 米芬幼體料，有效強(qiáng)化與保證雄性轉(zhuǎn)化率;4、用純系的雄性四倍體與原有的雌性二倍體回 交，有效保證了三倍體的純度。因而通過此方法，可獲得100%的烏鱧三倍體純系，提高了三 倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要的是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生 態(tài)環(huán)境無污染。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0008] 實(shí)施例一 提高烏鱧三倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏鱧人工飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為15g/kg飼料，待用； (2) 投喂:在烏鱧母本產(chǎn)卵前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對烏鱧母本進(jìn)行投喂他莫昔芬 喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g烏體母本投喂20g，下午6:00每100g烏體母本投喂15g; 至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄烏鱧放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為(TC的冷水中，靜水壓壓力為260Kg/cm 2,持續(xù)時(shí)間為3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為60mg/l，睪酮的濃度為 20mg/l； (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加15g，每次投喂量 為每萬尾40g，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而獲得雄性烏鱧四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0009] 實(shí)施例二 提高烏鱧三倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1)他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏鱧人工飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為20g/kg飼料，待用； (2) 投喂:在烏鱧母本產(chǎn)卵前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對烏鱧母本進(jìn)行投喂他莫昔芬 喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g烏體母本投喂20g，下午6:00每100g烏體母本投喂IOg; 至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄烏鱧放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為(TC的冷水中，靜水壓壓力為300Kg/cm2,持續(xù)時(shí)間為3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為l〇〇mg/l，睪酮的濃度為 60mg/l； (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡l〇s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加10g，每次投喂量 為每萬尾20g，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而獲得雄性烏鱧四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0010]上述兩個(gè)實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計(jì)。
[0011]附：烏鱧三倍體育成結(jié)果統(tǒng)計(jì)
注：上述結(jié)果是在烏鱧母本產(chǎn)卵前10天投喂他莫昔芬，靜水壓處理3分鐘、常溫浸泡 l〇s、每萬尾投喂氯米芬〇.2g所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高烏鱧三倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏鱧人工飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為15~20g/kg飼料，待用； (2) 投喂：在烏鱧母本產(chǎn)卵前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對烏鱧母本進(jìn)行投喂他莫 昔分喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g烏體母本投喂15~20g，下午6:00每100g烏體母本 投喂10~15g;至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄烏鱧放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精 卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時(shí)，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為-1~I. (TC的冷水中，靜水壓壓力為180~300Kg/cm2,持續(xù)時(shí)間 為2~3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為60~120mg/l，睪酮 的濃度為20~80mg/l; (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加 10~15g氯米芬， 每次投喂量為每萬尾20~40g加有氯米芬的幼體料，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而 獲得雄性烏鱧四倍體純系； (7) 三倍體的獲得:取步驟(6)的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
【文檔編號】A01K67/027GK105941332SQ201610497626
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 謝中國, 王芙蓉
【申請人】湖南文理學(xué)院