一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，屬于生物技術(shù)育種技術(shù)領(lǐng)域。該具體包括如下步驟：親本材料的播種；花期雜交授粉；考種；組織培養(yǎng)獲得雜種苗；無菌苗馴化；雜種形態(tài)學鑒定；雜種的細胞學鑒定方法。本發(fā)明根據(jù)蘿卜和蕓薹屬遠緣雜交，受精前障礙較嚴重，而授粉后障礙較輕的特點，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定濃度甘氨酸到母本柱頭上的方法，來改善屬間雜交的親和性，授粉后，采取的是自然結(jié)莢，借助組織培養(yǎng)技術(shù)，進行種粒無菌培養(yǎng)的方法，獲得了雜種苗并對其進行了形態(tài)學和細胞學的鑒定，確定是真實的屬間三倍體雜種。
【專利說明】
一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，屬于生物技術(shù)育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘿卜是十字花科植物中蕓薹屬(Brassica)的近緣屬，自上個世紀20年代以來，通過 人工雜交、組織培養(yǎng)和體細胞融合等技術(shù)，成功合成了蘿h甘藍、蘿h白菜兩個雙二倍體新 物種并被命名為新的物種，以及一系列的附加系。由于遠緣雜交的生殖隔離、種間雜種的不 親和性、雜種敗育以及雜種不育等共性問題，為了獲得有性雜交的雜種，人們采用了多種技 術(shù)和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱頭、化學藥物處理等，但這些技術(shù)和方法對蕓薹屬與蘿 卜的遠緣雜交，效果不大。房相佑在研究蘿卜與蕓苔野生種屬間雜交時發(fā)現(xiàn):蘿卜與蕓苔種雜 交時，蕓苔種的花粉能較好地萌發(fā)，但是花粉管伸長受到很大妨礙，只有少數(shù)花粉管到達胚 珠，受精后障礙相對較輕，母體內(nèi)雜種胚很多能發(fā)育成熟。在授粉前，使用不同的濃度激素 處理蘿卜的柱頭，增加蕪菁花粉在蘿卜柱頭上的伸長，完成受精作用，對于其雜交成功的角果 采用組織培養(yǎng)的技術(shù)手段，獲得雜種后代。這些新型材料，一方面，可作為新型蔬菜和飼料 作物，另一方面，蘿卜中有利的性狀導(dǎo)入到蕓薹屬植物中，創(chuàng)造出特異的遺傳研究材料，用于 細胞學和分子學研究。再一方面，作為橋梁，可以顯著提高蕓薹屬和蘿卜屬的雜交親和性。
[0003] 梅時勇等公開的發(fā)明專利授權(quán)公告號為CN 102210259 B，發(fā)明名稱為:一種蘿卜與 蕪菁屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法，該方法采用了花期重復(fù)授粉以及對授粉后莢果內(nèi)種 胚進行離體胚培養(yǎng)的方法，獲得了一定的成苗率，但未對雜種的真實性進行鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是:提出一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是:一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種 的方法，具體包括如下步驟：
[0006] (1)親本材料的播種:為使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播種蘿卜材料，11月 份播種蕪菁材料；
[0007] (2)花期雜交授粉:次年3-4月份，以蘿卜為母本，以蕪菁為父本，采用人工去雄、蕾 期采用化學藥劑涂抹柱頭的方式進行授粉雜交；
[0008] (3)考種:6月中旬，種莢成熟后，陸續(xù)采收、脫莢，統(tǒng)計收獲種子數(shù)量和編號；
[0009] (4)組織培養(yǎng)獲得雜種苗:9月中旬，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對收獲的種子，進行發(fā)芽、 生長；
[0010] (5)無菌苗馴化;待無菌苗生長至一定大小，根系較壯后，于馴化前一天，揭開瓶蓋 進行練苗，移栽至盛裝滅菌營養(yǎng)土的小缽中，遮陽網(wǎng)遮蓋，進行幼苗生長，一周后，移栽入塑 料大棚中，進行常規(guī)管理；
[0011] (6)雜種形態(tài)學鑒定:采用形態(tài)學的方法，對雜種苗進行鑒定，利用米尺、直尺以及 游標卡尺，分別統(tǒng)計其株高、葉形、葉片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊長、 雌蕊長，花粉情況，每次測量重復(fù)3次；
[0012] (7)雜種的細胞學鑒定方法:取花蕾，利用細胞學方法，進行染色體鑒定。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟1中親本材料的播種方式為穴播，株距為30cm，大小行距為60 X 80cm;每穴播種2~3粒種子，出苗后，待植株長至5~10cm，進行間苗，每穴保留一株;常規(guī)田 間管理。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟2中的花期雜交授粉具體為：
[0015] (1)首先對母本花序進行整理，去除已經(jīng)開放的花以及花序中間特別小的花蕾，保 留花序外圍，未開放的大花蕾，進行剝蕾、去雄；
[0016] (2)使用質(zhì)量濃度為100mg/L的Gly對授粉前母本柱頭進行滴浸；
[0017] (3)取父本植株上，新開放的新鮮花粉，涂抹柱頭，授粉后套袋，并掛牌標記雜交組 合、授粉時間。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟4中的組織培養(yǎng)獲得雜種苗的具體步驟為：
[0019] (1)種子首先進行70%乙醇處理lmin;
[0020] (2)6%次氯酸鈉溶液處理15min;
[0021] (3)無菌水沖洗4~5次；
[0022] (4)無菌濾紙吸干種子上殘存水分；
[0023] (5)接種于1 /2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10~15粒種子；
[0024] (6)放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:室溫25°C，光照時間為16h/d，光 照強度為20001UX條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗。
[0025] 優(yōu)選的，所述步驟7中的雜種的細胞學鑒定方法的具體步驟為：
[0026] (1)取花序中間小花蕾，用改良卡諾固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3進行固定，一 天后更換新的固定液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0027] (2)制片，從花序上挑取直徑為0.5~1mm的小花蕾，解剖鏡下剝出花藥，轉(zhuǎn)移至 70 %乙醇中，后吸出花藥，蒸餾水沖洗后，保留花藥；
[0028] (3)使用4 %的纖維素酶RS和4 %的果膠酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0029] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在顯微鏡下觀察，并記錄染色體數(shù)。
[0030] 有益效果：
[0031 ]本發(fā)明根據(jù)蕓薹屬和蘿卜遠緣雜交，受精前障礙較嚴重，而授粉后障礙較輕的特 點，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定濃度甘氨酸到母本柱頭上的方法，來改善屬間雜交 的親和性，而授粉后，采取的是自然結(jié)莢，借助組織培養(yǎng)技術(shù)，進行種粒無菌培養(yǎng)的方法，獲 得了雜種苗并對其進行了形態(tài)學和細胞學的鑒定，確定是真實的屬間三倍體雜種。
[0032]本發(fā)明采用人工去雄的方式進行蕾期雜交授粉，人工授粉中采用甘氨酸（Gly: 100mg/L)溶液涂抹柱頭的方法，促進了受精及子房和胚的發(fā)育，對改善屬間雜交的親和性， 克服蘿卜與蕪菁雜交的授粉前障礙有較好效果。收獲的種子采用組織培養(yǎng)的方式進行無菌 培養(yǎng)。獲得了蘿卜(2n = 18)和蕪菁(2n = 20)的異緣三倍體的屬間雜種(染色體數(shù)2n = 28)，本 發(fā)明一方面創(chuàng)造出了新型遺傳材料，有助于探明物種間的種屬進化關(guān)系;培育異附加系，在 促進物種之間的基因漸滲和分子細胞遺傳研究有著重要的作用；另一方面，培育的種間雜 種，作為橋梁物種，有助于增加蘿卜屬和蕓薹屬的雜交親和性，同時有助于轉(zhuǎn)移蘿卜屬中的優(yōu) 異性狀到蕓薹屬作物中，豐富作物的育種基礎(chǔ)。在特異新品種的培育方面，具有較高的實用 價值。
【附圖說明】
[0033]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的作進一步說明。
[0034]圖1是蘿卜-蕪菁親本及雜種形態(tài)圖（從左至右，依次為：14R9、蘿卜-蕪菁雜種、13W9) [0035]圖2是蘿卜-蕪菁親本及雜種花形態(tài)圖（從左至右，依次為：14R9、蘿卜-蕪菁雜種、 13W9)
[0036]圖3是蘿卜-蕪菁屬間雜種的染色體圖
【具體實施方式】 [0037] 實施例1
[0038] -種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，具體包括如下步驟：
[0039] 1、親本材料的播種:為使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播種蘿卜材料，11月份 播種蕪菁材料;播種方式為穴播，株距為30cm，大小行距為60 X 80cm;每穴播種2~3粒種子， 出苗后，待植株長至5~10cm，進行間苗，每穴保留一株;常規(guī)田間管理。
[0040] 2、花期雜交授粉:次年3-4月份，以蘿卜為母本，以蕪菁為父本，采用人工去雄、蕾期 采用化學藥劑涂抹柱頭的方式進行授粉雜交;具體為：
[0041] (1)首先對母本花序進行整理，去除已經(jīng)開放的花以及花序中間特別小的花蕾，保 留花序外圍，未開放的大花蕾，進行剝蕾、去雄；
[0042] (2)使用質(zhì)量濃度為100mg/L的Gly對授粉前母本柱頭進行滴浸；
[0043] (3)取父本植株上，新開放的新鮮花粉，涂抹柱頭，授粉后套袋，并掛牌標記雜交組 合、授粉時間。
[0044] 3、考種:6月中旬，種莢成熟后，陸續(xù)采收、脫莢，統(tǒng)計收獲種子數(shù)量和編號；
[0045] 4、組織培養(yǎng)獲得雜種苗:9月中旬，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對收獲的種子，進行發(fā)芽、生 長;具體步驟為：
[0046] (1)種子首先進行70%乙醇處理lmin;
[0047] (2)6%次氯酸鈉溶液處理15min;
[0048] (3)無菌水沖洗4~5次；
[0049] (4)無菌濾紙吸干種子上殘存水分；
[0050] (5)接種于1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10~15粒種子。
[0051 ] (6)放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:室溫25°C，光照時間為16h/d，光 照強度為20001UX條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗；
[0052] 5、無菌苗馴化;待無菌苗生長至一定大小，根系較壯后，于馴化前一天，揭開瓶蓋 進行練苗，移栽至盛裝滅菌營養(yǎng)土的小缽中，遮陽網(wǎng)遮蓋，進行幼苗生長，一周后，移栽入塑 料大棚中，進行常規(guī)管理；
[0053] 6、雜種形態(tài)學鑒定:采用形態(tài)學的方法，對雜種苗進行鑒定，利用米尺、直尺以及 游標卡尺，分別統(tǒng)計其株高(cm)、葉形、葉片大小(長X寬，cm)、花色、花蕾大小(長X直徑， mm)、花萼大?。ㄩLX寬，mm)、花瓣大小(mm)、雄蕊長(mm)、雌蕊長(mm)，花粉情況，每次測量 重復(fù)3次；
[0054] 7、雜種的細胞學鑒定方法:取花蕾，利用細胞學方法，進行染色體鑒定。具體步驟 為：
[0055] (1)取花序中間小花蕾，用改良卡諾固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3進行固定，一 天后更換新的固定液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0056] (2)制片，從花序上挑取直徑為0.5~1mm的小花蕾，解剖鏡下剝出花藥，轉(zhuǎn)移至 70 %乙醇中，后吸出花藥，蒸餾水沖洗后，保留花藥；
[0057] (3)使用4 %的纖維素酶RS和4 %的果膠酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0058] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在顯微鏡下觀察，并記錄染色體數(shù)。
[0059] 圖1，母本蘿卜分枝性較弱，葉片寬大;雜種分枝性較母本弱，葉片較少且大;父本蕪 菁，分枝性強，葉片較小;結(jié)合表2的表型數(shù)據(jù)，葉形、葉片大小、花色，雜種處于偏親表現(xiàn);花 蕾大小，雜種表現(xiàn)介于雙親之間；而株高、花萼大小、花瓣大小、雄蕊長、雌蕊長，雜種表現(xiàn)出 超親優(yōu)勢;雜種微粉，是雜種不育的典型表現(xiàn)；
[0060] 圖2,母本蘿卜14R9的花色為白色，邊緣淺粉，花型蜻蜓狀，對稱花夾角大;蘿卜-蕪菁 雜種同母本蘿卜花色相似為白色，花型與父本相似，為蝴蝶狀，對稱花夾角較??；父本蕪菁 13W9，花色為黃色，花型為蝴蝶狀，對稱花夾角較小；
[0061] 圖3,染色體條數(shù)，共計為28條，證明我們獲得了蘿卜（2n=18)和蕪菁(n=10)的異 緣三倍體的屬間雜種(染色體數(shù)2n = 28);
[0062] 表1蘿卜-蕪菁屬間雜種的獲得
[0063]
[0064]表2雜種的形態(tài)學鑒定
[0065]
[0066] 實施例2
[0067] 實施例2的一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，具體步驟同實施例1的創(chuàng)制蘿卜和 蕪菁屬間雜種的方法，不同之處在于：
[0068] 所述步驟1中親本材料的播種方式為穴播，每穴播種2~3粒種子，出苗后，待植株 長至一定大小，進行間苗，每穴保留一株;常規(guī)田間管理。
[0069] 所述步驟2中的花期雜交授粉具體為：
[0070] (1)首先對母本花序進行整理，對合適大小的花蕾，進行剝蕾、去雄；
[0071] (2)使用一定質(zhì)量濃度的Gly對授粉前母本柱頭進行滴浸；
[0072] (3)取父本植株上，新開放的新鮮花粉，涂抹柱頭，授粉后套袋，并掛牌標記雜交組 合、授粉時間。
[0073] 所述步驟4中的組織培養(yǎng)獲得雜種苗的具體步驟為：
[0074] (1)種子首先進行70 %乙醇預(yù)處理；
[0075] (2)消毒處理；
[0076] (3)無菌水沖洗4~5次；
[0077] (4)無菌濾紙吸干種子上殘存水分；
[0078] (5)接種于1 /2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10~15粒種子；
[0079 ] (6)放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，獲得無菌苗。
[0080] 所述步驟7中的雜種的細胞學鑒定方法的具體步驟為：
[0081] (1)取花序中間小花蕾，卡諾固定液進行固定，一天后更換新的固定液，于4°C冰箱 保存?zhèn)溆茫?br>[0082] (2)制片，從花序上挑取直徑為0.5~1mm的小花蕾，解剖鏡下剝出花藥，轉(zhuǎn)移至 70 %乙醇中，后吸出花藥，蒸餾水沖洗后，保留花藥；
[0083] (3)使用混合溶液進行酶解；
[0084] (4)水洗、固定，制片，顯微鏡下統(tǒng)計染色體數(shù)并拍照。
[0085]本發(fā)明的不局限于上述實施例所述的具體技術(shù)方案，凡采用等同替換形成的技術(shù) 方案均為本發(fā)明要求的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，具體包括如下步驟： (1) 親本材料的播種:為使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播種蘿卜材料，11月份播 種憲菁材料； (2) 花期雜交授粉:次年3-4月份，以蘿卜為母本，以蕪菁為父本，采用人工去雄、蕾期采 用化學藥劑涂抹柱頭的方式進行授粉雜交； (3) 考種:6月中旬，種莢成熟后，陸續(xù)采收、脫莢，統(tǒng)計收獲種子數(shù)量和編號； (4) 組織培養(yǎng)獲得雜種苗:9月中旬，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對收獲的種子，進行發(fā)芽、生長； (5) 無菌苗馴化;待無菌苗生長至一定大小，根系較壯后，于馴化前一天，揭開瓶蓋進行 練苗，移栽至盛裝滅菌營養(yǎng)土的小缽中，遮陽網(wǎng)遮蓋，進行幼苗生長，一周后，移栽入塑料大 棚中，進行常規(guī)管理； (6) 雜種形態(tài)學鑒定:采用形態(tài)學的方法，對雜種苗進行鑒定，利用米尺、直尺以及游標 卡尺，分別統(tǒng)計其株高、葉形、葉片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊長、雌蕊 長，花粉情況，每次測量重復(fù)3次； (7) 雜種的細胞學鑒定方法:取花蕾，利用細胞學方法，進行染色體鑒定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，其特征在于:所述步驟1中親本 材料的播種方式為穴播，株距為30cm，大小行距為60 X 80cm;每穴播種2~3粒種子，出苗后， 待植株長至5~10cm，進行間苗，每穴保留一株;常規(guī)田間管理。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，其特征在于:所述步驟2中的花 期雜交授粉具體為： (1) 首先對母本花序進行整理，去除已經(jīng)開放的花以及花序中間特別小的花蕾，保留花 序外圍，未開放的大花蕾，進行剝蕾、去雄； (2) 使用質(zhì)量濃度為100mg/L的Gly對授粉前母本柱頭進行滴浸； (3) 取父本植株上，新開放的新鮮花粉，涂抹柱頭，授粉后套袋，并掛牌標記雜交組合、 授粉時間。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，其特征在于:所述步驟4中的組 織培養(yǎng)獲得雜種苗的具體步驟為： (1) 種子首先進行70 %乙醇處理lmin; (2) 6%次氯酸鈉溶液處理1511^11; (3) 無菌水沖洗4~5次； (4) 無菌濾紙吸干種子上殘存水分； (5) 接種于1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10~15粒種子； (6) 放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:室溫25°C，光照時間為16h/d，光照強 度為20001UX條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)制蘿卜和蕪菁屬間雜種的方法，其特征在于:所述步驟7中的雜 種的細胞學鑒定方法的具體步驟為： (1) 取花序中間小花蕾，用改良卡諾固定液，乙醇:氯仿：乙酸= 5:2:3進行固定，一天后 更換新的固定液，于4 °C冰箱保存?zhèn)溆茫? (2) 制片，從花序上挑取直徑為0.5~1mm的小花蕾，解剖鏡下剝出花藥，轉(zhuǎn)移至70 %乙 醇中，后吸出花藥，蒸餾水沖洗后，保留花藥； (3) 使用4%的纖維素酶RS和4%的果膠酶Y-23混合溶液，37°C酶解2h lOmin; (4) 水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在顯微鏡下觀察，并記錄染色體數(shù)。
【文檔編號】A01H4/00GK105993912SQ201610339065
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】婁麗娜, 蘇小俊, 婁群峰, 許園園
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學院