一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，該脫毒方法詳細步驟包括：（1）配制香水百合花藥誘導培養(yǎng)基；（2）接種花藥的選材；（3）花藥消毒與接種；（4）花藥誘導培養(yǎng)；（5）胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng)；（6）香水百合鱗莖的煉苗與移栽；（7）香水百合單倍體植株的剔除。本發(fā)明的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法通過香水百合花藥培養(yǎng)獲得了香水百合花粉植株，進而剔除群體中摻雜的單倍體植株獲得香水百合二倍體植株，進一步進行百合病毒檢測發(fā)現(xiàn)，該脫毒方法幾乎達到100%脫毒，大大提高了百合種質，獲得了產(chǎn)量和品質得到極大提升的百合脫毒植株。
【專利說明】
_種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及園藝學領域，尤其涉及一種通過花藥培養(yǎng)途徑高效脫除百合病毒的香 水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法。
【背景技術】
[0002] 百合spp.)是百合科(Zi7iaceae)百合屬(Zi7i腫)多年生球根花丼，其花 大、花色豐富、花形優(yōu)美、寓意純潔而深受人們喜愛，是當今世界上重要的切花品種之一。西 方人以百合為圣潔象征，在公元約1000年前以色列國王所羅門的寺廟柱頂就是用百合花作 裝飾。百合花的花名是為了紀念圣母瑪利亞，自古以來圣母就被基督教視為清純的象征，因 此它的花語就是純潔。目前全世界約有100多種百合品種，我國栽培約有60多種。百合切花 是目前世界上發(fā)展最快的花卉之一。
[0003] 香水百合是百合中的一種，別名卡薩布蘭卡，天上百合，原產(chǎn)地為喜馬拉雅山區(qū)、 澳洲等各個地區(qū)。香水百合是百合中的女王，花語為"偉大純潔的愛"，送的是心儀的女子， 香水百合發(fā)展?jié)摿薮?，市場前景廣闊。
[0004] 百合以有性方式(種子繁殖)和無性方式進行繁殖，商業(yè)上主要以扦插繁殖和分球 繁殖等無性繁殖為主，長期的無性繁殖將會使體內逐漸積累大量病毒致使植物發(fā)生病毒 病，并導致種性退化，百合也不例外。病毒病經(jīng)常對百合生產(chǎn)造成嚴重危害。自Stewart (1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原19種，其中發(fā)生普遍、危害嚴 重的病毒有4種，即百合無病癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、百合X病毒(LVX)和郁金 香頂裂病毒等4種病毒危害。近年來，隨著百合引種數(shù)量的增加、種植面積的擴大以及不規(guī) 范的種球自繁，病毒病已開始在我國各百合種植區(qū)發(fā)生流行，一般發(fā)病率為40%_50%，二代 種球的帶毒率在90%以上。病毒病對百合的危害表現(xiàn)主要有:植株嚴重矮化，脈明，花葉，畸 形，壞死斑，鱗莖變小，產(chǎn)量下降，種質明顯退化，開花少且小，有的甚至盲花，嚴重時整株枯 死，嚴重制約了我國百合的產(chǎn)量和質量。
[0005] 百合在中國鮮切花中屬于高端花卉，年銷量不斷攀升，這使得百合脫毒技術的研 究成為百合產(chǎn)量和品質發(fā)展的重要手段，如何減少和消除病毒病，生產(chǎn)優(yōu)質無毒種苗，是百 合種球商品化生產(chǎn)面臨的一個重要問題。目前，百合病毒病已成為僅次于真菌病害的主要 病害，由于病毒復制與植物代謝密切相關，而且有些病毒的抗逆性很強，一直沒有有效的防 治措施，因此，獲得無病毒苗成為生產(chǎn)高品質百合的關鍵。對百合脫毒研究最早的是 Phi lhps (1962年），利用百合莖尖培養(yǎng)脫毒苗，試驗獲得成功后，又有許多外國學者也成功 獲得莖尖脫毒苗。1966年Mori和Hamaya通過莖尖培養(yǎng)獲得了百合無病毒植株。目前，生產(chǎn) 上主要是通過熱處理、組培莖尖脫毒和化學處理等方法進行脫毒。然而，目前的百合脫毒方 法并不完善，各種脫毒方法均有其不足之處。熱處理是利用病毒和植物對溫度敏感性的差 異不同，利用高溫對植物進行處理，高溫使病毒鈍化，在植物體內很難繁殖，部分植物細胞 耐高溫加速細胞分裂和繁殖，從而獲得無病毒的新生植物組織部分，再進一步繁殖得到無 病毒苗，然而熱處理不能脫除所有病毒，且影響百合存活率;莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植 物體內分布不均勾，在根尖和莖尖病毒含量很少或不含病毒，因此，米用莖尖1?體培養(yǎng)的方 法可以脫除病毒，其缺點是植物的存活率很低;化學處理法是將抗病毒藥劑注射進植物體 內或者加入培養(yǎng)基中，以達到除去病毒的目的，一般要與莖尖組織培養(yǎng)相結合應用，可一定 程度的提高莖尖脫毒效率和存活率。
[0006] 花藥離體培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，來改變花藥內花 粉粒的發(fā)育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，形成愈傷組織，由愈傷組織再 分化成植株的一種技術，花藥培養(yǎng)主要用途為培育單倍體植株，然而，由于小孢子基本不攜 帶病毒，通過花藥培養(yǎng)培育的植株幾乎能達到完全脫毒的目的，因此，若將離體的百合花藥 培育成單倍體植株，進而選擇百合的單倍體植株加倍的正常植株來育苗，可以較好的達到 百合脫毒的目的。
[0007] 目前，在百合脫毒技術研究中，還是以熱處理和莖尖組織培養(yǎng)技術研究和利用的 比較多，百合花藥培養(yǎng)脫毒法研究和利用的較少，但在一些園藝作物上已見報道。主要原因 還是在于現(xiàn)有的百合花藥培養(yǎng)效率較低，遠遠達不到生產(chǎn)的要求。培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)的物 質基礎，直接關系到培養(yǎng)物的生長與分化，培養(yǎng)基組分是影響花培效率的一個很重要的因 素。培養(yǎng)基各組分的合適用量，以及它們之間一定的組合關系，可導致花培效率的大幅度提 高。繼續(xù)篩選和優(yōu)化基本培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基選用的針對性，是提高花藥培養(yǎng)力的有效措 施;大量的研究發(fā)現(xiàn)一些附加物可以顯著提高花藥培養(yǎng)力，發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化組合花藥培養(yǎng)附加 物質，可進一步提高花藥培養(yǎng)力。
[0008] 通過大量香水百合花藥培養(yǎng)的摸索和實踐，我們進一步優(yōu)化了基本培養(yǎng)基配方， 并且不斷嘗試加入一些提高花藥誘導力的添加物并組合其種類搭配及濃度，摸索出了一種 高效率地誘導香水百合花藥誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，達到了通過香水百合花藥培養(yǎng)進行脫 毒的產(chǎn)業(yè)化應用效率。我們的研究結果對于香水百合的脫毒技術的進步具有較大的實用價 值。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供了一種通過香水百合花藥培養(yǎng)途 徑高效脫除百合病毒的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案解決的： 一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:該花藥培養(yǎng)脫毒方法的詳細步驟如 下： (1)配制香水百合花藥誘導培養(yǎng)基 香水百合花藥誘導培養(yǎng)基按每升蒸餾水中由以下物質配制而成： 大量元素：KN〇3 2500~2700mg/L，NH4N〇3 1600~1800mg/L，KH2P〇4 440~480mg/L， MgS〇4.7H2〇 350~390mg/L，CaCl2.2H2〇 820~860mg/L; 微量元素：MnS〇4.4H20 20~25mg/L，ZnS〇4.7H20 8.0~9.0mg/L，H3B03 6.0~6.5mg/L， KI0.8~0.85mg/L，CuS04.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H20 0.02~0.03mg/L，NaMo04.2H20 0 · 2~0·3mg/L; 鐵鹽：恥240了厶.2!12〇35~4〇11^/1，卩65〇4.7!12〇25~3〇11^/1; 有機成分：肌醇90~110mg/L，維生素 B1 0.09~0.11mg/L，維生素 B6 0.45~0.55mg/ 1^，煙酸0.45~0.5511^/1^，甘氛酸1.8~2.211^/1^，絲氛酸0.75~0.8511^/1^; 激素 :2,4-D 3.2~3.6mg/L，KT 2.0~2.4mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.0~6.5g/L; 活性添加劑:椰乳14~16g/L，甘露醇20~24g/L，水解蛋白0.8~1.0g/L，活性炭0.35 ~0·45g/L; 碳源：鹿糖55~65g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時，預先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機成分、活性添加劑，定容，加熱至60-80°C，然后加入碳源、凝固劑和 激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調節(jié)pH為5.8-6.0，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固； (2 )接種花藥的選材 在香水百合正?，F(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，用冰壺帶回實驗室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基進行花藥誘導培養(yǎng)，50-65d后誘導出花藥胚性愈傷； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導成功的胚性愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上，光照條件下分化培養(yǎng) 25-40天至小芽長至0.6cm以上，將高于0.6cm的小芽切下，轉接入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)， 2-3個月后即可得到直徑0.8-2.0cm的百合小鱗莖； (6) 香水百合鱗莖的煉苗與移栽 將香水百合小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取出，清 洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內，定期噴施百合壯苗營養(yǎng)液來壯苗； (7) 香水百合單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得香水百合植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍體植 株。
[0011]所述步驟(1)的香水百合花藥誘導培養(yǎng)基的最佳配方為： 按每升蒸餾水中由以下物質配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N〇3 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 0.1mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素:2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:鹿糖60g/L。
[0012] 所述步驟(2)中的篩選百合花蕾的標準為:按照花蕾長度為22~28_、花蕾內花藥 中的小孢子大都處于單核期的標準選擇花蕾。
[0013] 所述步驟(4)中花藥誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為:溫度控制為24°c-27°c，濕度控 制為65%-80%，黑暗條件。
[0014] 所述步驟(5)中分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS+6 · 5%蔗糖+0 · 8mg/L2，4-D+0 · 25mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/ 10h 暗。
[0015] 所述步驟（5)中繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6 · 0%蔗糖+0 · 6mg/L6-BA + 0.15mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周 期為14h光/10h暗。
[0016] 所述步驟(6)中百合壯苗營養(yǎng)液的配方為:1?2?〇4〇.38/1，0&3〇4〇.18/1，1^3〇4· 7H20 0.1g/L，ZnS〇4_7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4_7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4_4H20 0.5mg/L，H3B〇3 0.2mg/L;將以上個成分定量充分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液； 所述的百合壯苗營養(yǎng)液的用法為:百合鱗莖移栽時澆一次，以后每7-10天澆一次，每次 用量為50-80ml/株百合。
[0017] 所述步驟(7)中香水百合單倍體植株的剔除在生產(chǎn)上的標準可以簡化為:移栽后 的香水百合生長到現(xiàn)蕾期時，根據(jù)植株高度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
[0018] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術有如下優(yōu)點： 本發(fā)明通過優(yōu)化香水百合花藥培養(yǎng)途徑的培養(yǎng)基配方，摸索出了一種高效率地誘導香 水百合花藥誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基，使得香水百合的花培效率達到了通過香水百合花藥培養(yǎng)進 行脫毒生產(chǎn)脫毒植株的產(chǎn)業(yè)化應用要求。
[0019] 由于百合花藥中的花粉基本不攜帶病毒，通過花藥培養(yǎng)培育的花粉植株幾乎能達 到完全脫毒的目的，我們將花粉植株進行百合病毒檢測也發(fā)現(xiàn)，該脫毒方法幾乎達到100% 脫毒，大大提高了百合種質，獲得了產(chǎn)量和品質均得到極大提升的百合脫毒植株。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施案例對本發(fā)明作進一步說明，而非限制本發(fā)明。
[0021] 實施例1 2012年7月，選擇大田栽培的香水百合品種白精靈和元帥的花藥分別進行花培誘導脫 毒，其詳細步驟如下： (1)配制香水百合花藥誘導培養(yǎng)基 按每升蒸餾水中由以下物質配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N03 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 O.lmg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素:2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:蔗糖60g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時，預先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機成分、活性添加劑，定容，加熱至70°C左右，然后加入碳源、植物凝 膠和激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調節(jié)pH為5.9，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固即得； (2 )接種花藥的選材 在白精靈和元帥正常現(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，按照花蕾長度為22~28mm、花蕾內花藥 中的小孢子大都處于單核期的標準選擇花蕾，分別用冰壺帶回實驗室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導培養(yǎng) 將接種白精靈和元帥花藥后的培養(yǎng)基分別進行花藥誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)室環(huán)境控制為:溫 度24°C_27°C，濕度65%-80%，黑暗條件;花藥誘導培養(yǎng)50-65d后，白精靈和元帥均誘導出幼 嫩黃白、松散狀的花藥胚性愈傷，統(tǒng)計白精靈和元帥愈傷組織誘導率，分別達到了25.3%和 18.7%； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導成功的白精靈和元帥的胚性愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上(分化培 養(yǎng)基配方為:MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA)，光照條件下(培養(yǎng)條件控制為： 溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800LX，光周期為14h光/10h暗）分化培養(yǎng)25-40 天至小芽長至0.6cm以上，此時統(tǒng)計愈傷組織分化率，白精靈和元帥愈傷組織分化率分別為 87.6%和78.9%;將高于0.6cm的小芽切下，轉接入繼代培養(yǎng)基上(繼代培養(yǎng)基配方為：1/2MS+ 6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA)繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度 65%-80%，光照為1200-1800LX，光周期為14h光/10h暗），2-3個月后得到直徑0.8-2.0cm的 百合小鱗莖； (6) 鱗莖的煉苗與移栽 將白精靈和元帥小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取 出，清洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內，噴施百合壯苗營養(yǎng)液壯苗（百合壯苗營養(yǎng)液 的配方為：KH2PO4 0.3g/L，CaS〇4 0.1g/L，MgS〇4.7H20 0.1g/L，ZnS〇4.7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4· 7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4.4H2〇 0.5mg/L，H3B03 0.2mg/L;將以上個成分定量充 分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液），百合壯苗營養(yǎng)液的施用用法為：百合鱗莖移栽時澆一次， 以后每7-10天饒一次，每次用量為50-80ml/株百合； (7)單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得白精靈和元帥植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍 體植株;統(tǒng)計白精靈和元帥單倍體植株的比例，分別為22.7%和26.5%，且白精靈和元帥單倍 體植株在各自的花培群體中均表現(xiàn)為最矮，生長至現(xiàn)蕾期時差異尤為明顯，因此，在生產(chǎn)上 剔除百合單倍體植株的標準可以簡化為:移栽后的香水百合生長到現(xiàn)蕾期時，根據(jù)植株高 度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
[0022] 實施例2 2013年4月，采用目前常用的莖尖分生組織培養(yǎng)結合熱處理和莖尖培養(yǎng)結合病毒唑化 學處理的兩種常規(guī)百合脫毒方法對百合品種白精靈和元帥進行脫毒處理，分別獲得白精靈 和元帥脫毒苗，將實施例1采用本發(fā)明的技術路線獲得的白精靈和元帥脫毒苗冷凍株，一起 檢測侵染百合的3種主要病毒:黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無癥病毒(LSV)和百合斑駁病毒 (LMoV)，比較本發(fā)明的技術路線與常規(guī)脫毒方法對百合常見病毒的脫毒效果差異。鑒定方 法采用多重RT-PCR技術(參照陳進等《百合三種主要病毒的RT-PCR檢測及脫毒技術研究》）， 三種脫毒方法對白精靈和元帥三種病毒的脫毒效果如表1。
[0023] 由表1可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法基本可以達到完全脫毒 的效果，相比目前常規(guī)的百合脫毒方法，脫毒效果有了極大的進步，而且百合花藥培養(yǎng)操作 技術較常規(guī)莖尖培養(yǎng)操作技術要求低，更便于產(chǎn)業(yè)化實施。因此，本發(fā)明對香水百合的脫毒 需求具有巨大的進步和極大的產(chǎn)業(yè)化價值。
[0024] 上述實例只是為說明本發(fā)明的技術構思以及技術特點，并不能以此限制本發(fā)明的 保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實質所做的等效變換或修飾，都應該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍 之內。
【主權項】
1. 一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:該花藥培養(yǎng)脫毒方法的詳細步驟 如下： (1) 配制香水百合花藥誘導培養(yǎng)基 香水百合花藥誘導培養(yǎng)基按每升蒸餾水中由以下物質配制而成： 大量元素：KN〇3 2500~2700mg/L，NH4N〇3 1600~1800mg/L，KH2P〇4 440~480mg/L， MgS〇4.7H2〇 350~390mg/L，CaCl2.2H2〇 820~860mg/L; 微量元素：]?115〇4.4!12〇20~2511^/1，2115〇4.7!12〇8.0~9.〇11^/1，!138〇3 6.0~6.511^/1， KI0.8~0.85mg/L，CuS04.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H20 0.02~0.03mg/L，NaMo04.2H20 0 · 2~0·3mg/L; 鐵鹽：恥240了厶.2!12〇35~4〇11^/1，卩65〇4.7!12〇25~3〇11^/1; 有機成分：肌醇90~110mg/L，維生素 B1 0.09~0.11mg/L，維生素 B6 0.45~0.55mg/ 1^，煙酸0.45~0.5511^/1^，甘氛酸1.8~2.211^/1^，絲氛酸0.75~0.8511^/1^; 激素：2,4-D 3.2~3.6mg/L，KT 2.0~2.4mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.0~6.5g/L; 活性添加劑:椰乳14~16g/L，甘露醇20~24g/L，水解蛋白0 · 8~1 · Og/L，活性炭0 · 35 ~0·45g/L; 碳源：鹿糖55~65g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時，預先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機成分、活性添加劑，定容，加熱至60-80°C，然后加入碳源、凝固劑和 激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調節(jié)pH為5.8-6.0，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固； (2) 接種花藥的選材 在香水百合正?，F(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，用冰壺帶回實驗室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基進行花藥誘導培養(yǎng)，50-65d后誘導出花藥胚性愈傷； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導成功的胚性愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上，光照條件下分化培養(yǎng) 25-40天至小芽長至0.6cm以上，將高于0.6cm的小芽切下，轉接入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)， 2-3個月后即可得到直徑0.8-2.0cm的百合小鱗莖； (6) 香水百合鱗莖的煉苗與移栽 將香水百合小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取出，清 洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內，定期噴施百合壯苗營養(yǎng)液來壯苗； (7) 香水百合單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得香水百合植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍體植 株。2. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟（1)的 香水百合花藥誘導培養(yǎng)基的最佳配方為： 按每升蒸餾水中由以下物質配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N03 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 O.lmg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素：2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:鹿糖60g/L。3. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(2)中 的篩選百合花蕾的標準為:按照花蕾長度為22~28mm、花蕾內花藥中的小孢子大都處于單 核期的標準選擇花蕾。4. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(4)中 花藥誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為:溫度控制為24°C_27°C，濕度控制為65%-80%，黑暗條件。5. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(5)中 分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為： 溫度25 °C -28 °C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/1 Oh暗。6. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(5)中 繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制 為:溫度25 °C -28 °C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/1 Oh暗。7. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(6)中 百合壯苗營養(yǎng)液的配方為:KH2P〇4 0.3g/L，CaS〇4 0.1g/L，MgS(V7H20 0.1g/L，ZnS(V7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4.4H2〇 0.5mg/L，H3B03 0.2mg/L;將以 上個成分定量充分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液； 所述的百合壯苗營養(yǎng)液的用法為:百合鱗莖移栽時澆一次，以后每7-10天澆一次，每次 用量為50-80ml/株百合。8. 根據(jù)權利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(7)中 香水百合單倍體植株的剔除在生產(chǎn)上的標準可以簡化為:移栽后的香水百合生長到現(xiàn)蕾期 時，根據(jù)植株高度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
【文檔編號】A01H4/00GK105993948SQ201610354390
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】王紀芝, 宋曉燕
【申請人】王紀芝