一種黃花倒水蓮離體快繁育苗方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了涉及一種黃花倒水蓮離體快繁育苗方法。其以黃花倒水蓮嫩莖為外植體，經(jīng)消毒后，接種于MS+6?BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的啟動(dòng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，繼而將不定芽接種在附加不同種類(lèi)及濃度外源激素的增殖及生根培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)，并將生根試管苗移栽于煉苗基質(zhì)煉苗。本發(fā)明建立的黃花倒水蓮離體快繁體系，取材方便，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，為實(shí)現(xiàn)黃花倒水蓮優(yōu)良種質(zhì)的快速繁殖以及解決其野生資源匱乏而在生產(chǎn)上供不應(yīng)求的現(xiàn)狀提供方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種黃花倒水蓮離體快繁育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及黃花倒水蓮離體快繁技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及黃花倒水蓮離體快繁育苗 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃花倒水蓮/aDaz Hemsl.)別名黃花參、黃花吊水蓮、觀音串、黃花大 遠(yuǎn)志等，屬遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(PoJ/g'aJa)植物[1 ]。主要分布于我國(guó)的福建、湖 南、廣西等地[2-4]。是一種較為珍稀的中藥材，全草入藥，性味甘、微苦，平。有補(bǔ)益氣血，健 脾利濕，活血調(diào)經(jīng)之功能。是瑤、苗、壯等少數(shù)民族常用的民間藥物[5]。黃花倒水蓮作為一 種珍貴的藥材，隨著藥材市場(chǎng)對(duì)其需求不斷增加，一再出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，一些地區(qū)甚至 出現(xiàn)緊缺的狀況。野生資源不斷被挖掘利用，已難以滿足目前的市場(chǎng)需求。黃花倒水蓮以種 子繁殖較多，但繁殖能力弱[6]。因此要開(kāi)發(fā)及利用好黃花倒水蓮這一重要資源，就必須解 決其快繁問(wèn)題。而組織培養(yǎng)技術(shù)是在短期內(nèi)迅速擴(kuò)大種苗數(shù)量的最有效方法。有關(guān)黃花倒 水蓮的離體快繁研究，僅見(jiàn)國(guó)內(nèi)有相關(guān)報(bào)道[7-9]，但在穩(wěn)定性及可重復(fù)性方面有一定的局 限性。因此，建立穩(wěn)定性好，重復(fù)性高的黃花倒水蓮離體快繁技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)黃花倒水蓮優(yōu) 良種質(zhì)的快速繁殖，對(duì)解決其野生資源匱乏而在生產(chǎn)上供不應(yīng)求的現(xiàn)狀具有重要意義。
[0003] 在現(xiàn)有技術(shù)中，申請(qǐng)?zhí)枮?01210147606.9,名稱(chēng)為一種黃花倒水蓮的組織培養(yǎng)繁 殖方法已經(jīng)公開(kāi)了一種黃花倒水蓮的組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟： (1) 外植體采集及消毒:取黃花倒水蓮當(dāng)年生帶腋芽幼嫩莖段作為外植體，用洗潔精浸 泡處理10 min，用軟毛刷輕輕刷洗莖段表面，流水沖洗30 min，置于超凈工作臺(tái)上，剪成帶 1-2個(gè)節(jié)間的莖段，用質(zhì)量濃度為0.1%的ΚΜη04浸泡處理5min，無(wú)菌水沖洗2遍，體積濃度 為75%的乙醇浸泡處理20 s，再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞浸泡處理10 min，無(wú)菌水沖洗6 遍，獲得無(wú)菌材料； (2) 不定芽的誘導(dǎo):將上述無(wú)菌材料接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度25±1 °C，光 照時(shí)間11 h/d，光照強(qiáng)度3000 LX的條件下誘導(dǎo)黃花倒水蓮不定芽，誘導(dǎo)培養(yǎng)30天； (3) 不定芽增殖培養(yǎng):將誘導(dǎo)出的黃花倒水蓮不定芽轉(zhuǎn)接至不定芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行 不定芽的增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25±1 °C，光照時(shí)間11 h/d，光照強(qiáng)度3000 LX，增殖 培養(yǎng)25天； (4) 不定芽生根培養(yǎng):將增殖培養(yǎng)的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培 養(yǎng)條件為:溫度25±1 °C，光照時(shí)間11 h/d，光照強(qiáng)度3000 LX，生根培養(yǎng)25天即可獲得組 培苗； (5) 煉苗及移栽:待組培苗80%長(zhǎng)出根原基時(shí)將其移至大棚進(jìn)行煉苗，7天后將瓶苗輕 輕夾出，洗凈根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量濃度為0.1%的代森猛鋅浸泡處理2~3 min，陰干，待植 株枝干上的水分陰干好后，移栽入事先已用質(zhì)量濃度為0.1%的高錳酸鉀消毒的移栽基質(zhì) 中，保持環(huán)境溫度25±1 °C，噴霧保濕，使空氣濕度保持在85-95%，覆蓋遮陰率70%的遮陽(yáng) 網(wǎng)，每7天噴灑一次廣譜殺菌劑，30天后長(zhǎng)出新根時(shí)澆一次兩倍MS大量元素溶液。
[0004] 該專(zhuān)利通過(guò)取以當(dāng)年生幼嫩帶腋芽(未萌發(fā))莖段作為外植體，經(jīng)消毒獲得無(wú)菌材 料后，通過(guò)誘導(dǎo)不定芽，再經(jīng)不定芽的增殖、生根從而獲得組培苗，組培苗經(jīng)過(guò)馴化獲得栽 培苗，從外植體的誘導(dǎo)到獲得存活的黃花倒水蓮栽培苗只需110天，大大加快黃花倒水蓮 的繁殖速度。該發(fā)明中黃花倒水蓮不定芽的誘導(dǎo)率為95.1，同時(shí)不定芽每月的增殖系數(shù)為 6.12，生根率為95.67%，移栽成活率可達(dá)92.6%，因此，可以在短期內(nèi)提供大量的黃花倒水蓮 栽培苗，決解目前黃花倒水蓮野生資源有限、導(dǎo)致資源嚴(yán)重短缺等問(wèn)題，同時(shí)為其優(yōu)質(zhì)苗木 的規(guī)?；a(chǎn)乃至資源培育與利用奠定基礎(chǔ)。但是，該發(fā)明在穩(wěn)定性及可重復(fù)性方面有一 定的局限性。因此，建立穩(wěn)定性好，重復(fù)性高的黃花倒水蓮離體快繁技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)黃花倒 水蓮優(yōu)良種質(zhì)的快速繁殖，對(duì)解決其野生資源匱乏而在生產(chǎn)上供不應(yīng)求的現(xiàn)狀具有重要意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其 目的在于用75%酒精消毒10s，0.1%升汞消毒15min獲得了較好的消毒效果，污染率低至 3.15% ;適宜黃花倒水蓮增殖的培養(yǎng)基為1^+6-8八2.〇11^/1+財(cái)八0.1〇11^/1，增殖系數(shù)為 5.50;在1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3mg/L+0.3g/L活性炭的生根培養(yǎng)基中，其生根率可 達(dá)96%;黃花倒水蓮試管苗煉苗的最佳基質(zhì)為紅壤:腐殖土:珍珠巖=1:1:1，成活率為94.5%， 成功建立了黃花倒水蓮離體快繁技術(shù)體系。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，包括如下步驟： 步驟一，材料獲取:當(dāng)年生帶有嫩莖的黃花倒水蓮枝條； 步驟二，材料預(yù)處理:外植體在洗潔精水中漂洗3-5 min，然后用流水沖洗25-35 min， 在清洗過(guò)程中同時(shí)對(duì)過(guò)長(zhǎng)或過(guò)大的枝條進(jìn)行修剪，方便后續(xù)的消毒工作； 步驟三，外植體消毒:取步驟二中預(yù)處理的黃花水蓮枝條，用75%酒精消毒10-30S，再用 〇. 1%的升汞消毒時(shí)間為10_20min; 步驟四，誘導(dǎo)腋芽:將步驟三中經(jīng)消毒后的材料切成長(zhǎng)約2cm帶1-2個(gè)葉腋的莖段，豎直 插于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g/L蔗糖，5.0g//L瓊脂，pH 5.7，外植體培養(yǎng)12-18d，葉腋處可誘導(dǎo)出腋芽，在30d后即可長(zhǎng)至2-3cm高； 步驟五，增殖培養(yǎng):截取上述步驟四中誘導(dǎo)出的腋芽接種于增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培 養(yǎng)，20-25d培養(yǎng)一代； 步驟六，生根培養(yǎng):選取步驟五中獲得的健壯試管苗，切取頂端長(zhǎng)2cm接入生根培養(yǎng)基 中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20d后試管苗可生根； 步驟七，煉苗移栽:將步驟六中生根良好，生長(zhǎng)健壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí) 驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3的開(kāi)度，煉苗2d，最后將瓶蓋完全揭開(kāi)， 煉苗Id后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì)中，并用小拱棚覆蓋;煉苗過(guò)程中，要保證基質(zhì) 足夠的水分，并采取遮光措施;25d后即可成活；以上步驟四、五和六接種工作均在超凈工 作臺(tái)中操作，試管苗的培養(yǎng)均在組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，其培養(yǎng)條件為:在溫度25°C，光照強(qiáng)度 1200-1500LX，光照周期12h/d的條件下進(jìn)行的。
[0007] 進(jìn)一步地，步驟七煉苗移栽：以紅壤、腐殖土及珍珠巖為原料，將生根良好，生長(zhǎng)健 壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3的 開(kāi)度，煉苗2d;最后將瓶蓋完全揭開(kāi)，煉苗1 d后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì)中，并用小 拱棚覆蓋。
[0008] 進(jìn)一步地，步驟七中采用紅壤土、珍珠巖與腐殖土配合制得練苗移植基質(zhì)。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟七煉苗移栽中的煉苗基質(zhì)為紅壤:腐殖土 :珍珠巖=1 : 1: 1或腐殖 土:珍珠巖=1:1或全腐殖土中的一種。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟一中75%酒精消毒時(shí)間為1 Os，0.1%升汞為15min，外植體的消毒效 果較佳。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟五的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟六所述的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L +0.2 g/L活性炭。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：以黃花倒水蓮嫩莖為外植體，經(jīng)不同方法 消毒后，接種于MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)腋芽發(fā)生，繼而將腋芽 接種在附加不同種類(lèi)及濃度外源激素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)增殖和生根情況，篩選適宜 的黃花倒水蓮增殖及生根培養(yǎng)基;然后將生根試管苗移栽于不同的基質(zhì)中，依據(jù)成活率，確 定其最佳煉苗基質(zhì)。用75%酒精消毒10s，0.1%升汞消毒15min獲得了較好的消毒效果，污染 率低至3.15%;適宜黃花倒水蓮增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L，增殖系數(shù) 為5.50;在1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3mg/L+0.3g/L活性炭的生根培養(yǎng)基中，其生根率 可達(dá)96%;黃花倒水蓮試管苗煉苗的最佳基質(zhì)為紅壤：腐殖土 ：珍珠巖=1:1:1，成活率為 94.5%。本發(fā)明中，從外植體的誘導(dǎo)到獲得成活的黃花倒水蓮幼苗只需100-105d，且在生根 后一般管理即可，無(wú)需用兩倍MS大量元素溶液進(jìn)行澆灌。這樣大大加快了黃花倒水蓮的繁 殖速度，且該方法穩(wěn)定性及重復(fù)性均高。因此，可以在短期內(nèi)提供大量的黃花倒水蓮栽培 苗，決解目前黃花倒水蓮野生資源有限、導(dǎo)致資源嚴(yán)重短缺等問(wèn)題，可以滿足其工廠化生 產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為黃花倒水蓮腋芽誘導(dǎo)階段的一個(gè)實(shí)施例的照片； 圖2為黃花倒水蓮增殖培養(yǎng)階段的一個(gè)實(shí)施例的照片； 圖3為黃花倒水蓮生根培養(yǎng)階段的一個(gè)實(shí)施例的照片； 圖4為黃花倒水蓮移栽煉苗階段的一個(gè)實(shí)施例的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，該實(shí)施 例僅用于解釋本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成限定。
[0016]實(shí)施例以黃花倒水蓮離體快繁體系建立所需步驟以及具體參數(shù)為對(duì)象，進(jìn)行如 下試驗(yàn) 1材料與方法 1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為當(dāng)年生帶有嫩莖的枝條，取自福建三明市清流縣。
[0017] 1.2試驗(yàn)方法 1.2.1材料預(yù)處理 外植體在洗潔精水中漂洗3~5 min，然后用流水沖洗30 min。在清洗過(guò)程中對(duì)過(guò)長(zhǎng)或過(guò) 大的枝條進(jìn)行修剪，方便后續(xù)的消毒工作。
[0018] 1.2.2外植體消毒及腋芽誘導(dǎo) 取上述預(yù)處理的材料，用75%酒精和0.1%的升汞進(jìn)行消毒，設(shè)置不同的消毒時(shí)間以確定 適宜黃花倒水蓮的消毒方案(表1)。材料經(jīng)消毒后切成長(zhǎng)約2cm帶1-2個(gè)葉腋的莖段，豎直插 于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g//L蔗糖，5.0g/U京脂，pH 5.7 (下同）。試驗(yàn)共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理20瓶，每處理放置外植體4段。莖段葉腋處誘導(dǎo)出的不 定芽，則用作增殖培養(yǎng)的材料。如圖1所示為黃花倒水蓮腋芽誘導(dǎo)階段的一個(gè)實(shí)施例的照 片。
[0019] 表1黃花倒水蓮?fù)庵搀w消毒方案
1.2.3增殖培養(yǎng) 截取1.2.2中誘導(dǎo)出的腋芽，約1 cm長(zhǎng)，分別以MS和WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用相同激素種 類(lèi)及濃度配比設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行黃花倒水蓮增殖培養(yǎng)基的篩選。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。試驗(yàn)共計(jì)18 個(gè)處理及1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理20瓶，每處理放置材料4段。圖2為黃花倒水蓮增殖培養(yǎng)階段的 一個(gè)實(shí)施例的照片。
[0020] 表2黃花倒水蓮增殖培養(yǎng)基方案

1.2.4生根培養(yǎng) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)IBA、NAA兩種激素不同濃度與不同量的活性炭配比，添加到1/2MS培養(yǎng)基中 (表3)。選取經(jīng)增殖培養(yǎng)的健壯試管苗，切取頂端長(zhǎng)約2cm接入培養(yǎng)基中。試驗(yàn)共計(jì)9個(gè)處理 及1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理20瓶，每處理放置材料4段。如圖3所示為黃花倒水蓮生根培養(yǎng)階段的 一個(gè)實(shí)施例的照片。
[0021] 表3黃花倒水蓮生根培養(yǎng)基方案
1.2.5煉苗移栽 以紅壤、腐殖土和珍珠巖為原料，配置6種不同的基質(zhì)，其配比設(shè)計(jì)如表4。將生根良好， 生長(zhǎng)健壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭 開(kāi)1/3的開(kāi)度，煉苗2d，最后將瓶蓋完全揭開(kāi)，煉苗Id后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì) 中，并用小拱棚覆蓋。煉苗過(guò)程中，要保證基質(zhì)足夠的水分，并采取一定的遮光措施。如圖4 所示為黃花倒水蓮移栽煉苗階段的一個(gè)實(shí)施例的照片。
[QQ22] 表4黃花倒水蓮移栽基質(zhì)方案_
1.2.6培養(yǎng)條件
上述室內(nèi)培養(yǎng)，均是在溫度25°C，光照強(qiáng)度1200Lx，光照周期12h/d的條件下進(jìn)行的。 [0023] 1.3數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0024]結(jié)果與分析 2.1外植體消毒 黃花倒水蓮經(jīng)不同消毒處理后，結(jié)果如表5,在12種處理中，污染率最高的是處理1，污 染率為45.71%，污染率最低的是處理8,污染率為2.47%。消毒時(shí)間處理7、8、9和10之間無(wú)顯 著差異，污染率均較低(分別為3.15%、2.47%、2.66%及3.52%)。說(shuō)明，在這4種消毒條件下，均 可獲得良好的消毒效果。但處理7中，外植體生長(zhǎng)情況較處理8、9和10均要好。因此認(rèn)為，處 理7(75%酒精10s，0.1%升汞15min)為黃花倒水蓮?fù)庵搀w消毒的最理想方法。初代培養(yǎng)12-18d左右，葉腋處可誘導(dǎo)出不定芽，在30d后即可長(zhǎng)至2_3cm高。
[0025] 表5不同消毒處理效果比較
注:表中同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<〇.05)，下同。
[0026] 2.2增殖培養(yǎng) 在不同的增殖培養(yǎng)基中，黃花倒水蓮腋芽的增殖效果如表6,未添加激素的對(duì)照中增殖 系數(shù)最低，分別為2.08和1.89,說(shuō)明外源激素的加入可以明顯提高黃花倒水蓮的增殖系數(shù)。 在添加了外源激素的處理中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中處理4的增殖系數(shù)最高為5.50,且與其他 各處理均有顯著差異。處理11的增殖系數(shù)最低為2.29;以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中處理6的增殖 系數(shù)最高為4.13,且與其他各處理均有顯著差異。處理10的增殖系數(shù)最低為1.39。因此，黃 花倒水蓮不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。
[0027] 表6不同培養(yǎng)基對(duì)黃花倒水蓮不定芽增殖的影響
2.4生根培養(yǎng) 不同的生根培養(yǎng)條件下黃花倒水蓮的生根效果不同（如表7)。生根率最低處理為未添 加任何激素的對(duì)照組CK，為21.0%，其余1-9處理實(shí)驗(yàn)中的生根率均在50.0%以上，說(shuō)明外源 激素的加入有利于黃花倒水蓮生根。生根率最高為處理4,達(dá)96.0%，且生根條數(shù)和根長(zhǎng)也在 所有處理中最高。綜合分析認(rèn)為，處理4(1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活 性炭)為黃花倒水蓮的最佳生根培養(yǎng)基。
[0028]表7不同培養(yǎng)基對(duì)黃花倒水蓮生根的影響
2.5煉苗移栽 由表8可知，不同的移栽基質(zhì)對(duì)黃花倒水蓮的生根率有顯著差異，成活率最低的是處理 1，成活率僅為66.7%，在處理6的基質(zhì)中，黃花倒水蓮試管苗的成活率最高(為95.2%)，且與 處理4和5之間差異不顯著(分別為94.5%和94.9%)，所以，這3個(gè)處理的基質(zhì)均適宜黃花倒水 蓮的移栽煉苗。但從管理和基質(zhì)成本來(lái)看，添加一定比例的紅壤有助于提尚基質(zhì)的保水性， 減少補(bǔ)水次數(shù)，還可以降低基質(zhì)的成本。因此，實(shí)際生產(chǎn)栽培過(guò)程中建議使用處理4紅壤:腐 殖土:珍珠巖=1:1:1基質(zhì)配比，成活率達(dá)94.5%。
[0029]表8不同基質(zhì)對(duì)黃花倒水蓮煉苗的影響
3討論 試驗(yàn)結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基適合黃花倒水蓮?fù)庵搀w腋芽誘導(dǎo)，羅萬(wàn)業(yè)等[8]，李翠蘭等[9] 在建立黃花倒水蓮離體快繁技術(shù)體系時(shí)，也選用了同樣的培養(yǎng)基。而劉秀芳等[7]則以1/ 2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加與本試驗(yàn)相同的激素種類(lèi)和配比，對(duì)黃花倒水蓮莖段進(jìn)行誘導(dǎo)培 養(yǎng)，也取得了較理想的效果。MS是一種元素間平衡較好，緩沖能力強(qiáng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]，1/ 2MS只是將大量元素減半。在腋芽誘導(dǎo)初期，外植體內(nèi)本身貯存著一定量的能量及營(yíng)養(yǎng)，甚 至這些能量及營(yíng)養(yǎng)足夠或超出誘導(dǎo)腋芽之所需，因此，此類(lèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)的選擇對(duì)腋芽的誘導(dǎo) 影響并不大。另外，培養(yǎng)時(shí)的條件及取材的基因型不同也會(huì)有一定的影響。
[0030] 增殖培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的增高，不論是以MS還是經(jīng)WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培 養(yǎng)方案中，不定芽的增殖系數(shù)均呈上升趨勢(shì)。但以1.5 mg/L時(shí)最為適宜，超過(guò)則增殖系數(shù)開(kāi) 始下降，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。這與劉秀芳等[7]的研究結(jié)果以及在對(duì)同屬植物晉產(chǎn)遠(yuǎn)志進(jìn)行 增殖試驗(yàn)時(shí)獲得的結(jié)果相一致[11]。一般情下，TDZ的作用強(qiáng)度要大于6-BA。而試驗(yàn)結(jié)果表 明，在兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加〇. 01、〇.03、0.05 mg/L的TDZ，其增殖效果顯著不如6-BA的效 果。這可能與所添加的TDZ的濃度較低有關(guān)。
[0031] 在生根培養(yǎng)時(shí)，添加合理濃度范圍的生長(zhǎng)素有利用黃花倒水蓮芽苗的生根。但是 不論任何一種激素配比的培養(yǎng)基，均會(huì)產(chǎn)生一定量的愈傷組織。而且這種情況會(huì)隨著生長(zhǎng) 素濃度的提高而加劇。試驗(yàn)過(guò)程中，往往在高生根率的同時(shí)伴隨著較多愈傷組織的產(chǎn)生。花 黃倒水蓮生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在生根培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，能較好地抑制愈 傷組織的形成，在后期煉苗時(shí)，其根不易斷開(kāi)，有利于提高移栽煉苗時(shí)的成活率。這與李翠 蘭等[9]的研究結(jié)果相一致。
[0032]已有報(bào)道認(rèn)為，泥炭土:黃泥土:珍珠巖=2:1:1是較適合黃花倒水蓮的煉苗基質(zhì)， 移栽成活率可達(dá)92.6%[ 7 ]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅壤:腐殖土:珍珠巖=1:1:1、腐殖土:珍珠巖= 1:1、全腐殖土三種基質(zhì)組合的成活率均高于94%。然而，在全紅壤的基質(zhì)中，移栽數(shù)天后，苗 木根部變黑并逐漸腐爛，最終大量死亡。推測(cè)是基質(zhì)透氣性太差，導(dǎo)致根部無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒 精，繼而造成根部毒害。較多研究表明，試管苗移栽成活率與基質(zhì)本身的保水、保肥、透氣性 和自身穩(wěn)定性密切相關(guān)。因此，要求煉苗基質(zhì)要疏松透氣，并具有一定的持水力[12-15]。
[0033]本發(fā)明的實(shí)施例公布的是較佳的實(shí)施例，但并不局限于此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，極易根據(jù)上述實(shí)施例，領(lǐng)會(huì)本發(fā)明的精神，并做出不同的引申和變化，但只要不脫離本 發(fā)明的精神，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0034] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，材料獲取:當(dāng)年生帶有嫩莖的黃花倒水蓮枝條； 步驟二，材料預(yù)處理:外植體在洗潔精水中漂洗3-5 min，然后用流水沖洗25-35 min， 在清洗過(guò)程中同時(shí)對(duì)過(guò)長(zhǎng)或過(guò)大的枝條進(jìn)行修剪，方便后續(xù)的消毒工作； 步驟三，外植體消毒:取步驟二中預(yù)處理的黃花水蓮枝條，用75%酒精消毒10-30S，再用 〇. 1%的升汞消毒時(shí)間為10_20min; 步驟四，誘導(dǎo)腋芽:將步驟三中經(jīng)消毒后的材料切成長(zhǎng)約2cm帶1-2個(gè)葉腋的莖段，豎直 插于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g/L蔗糖，5.0g//L瓊脂，pH 5.7，外植體培養(yǎng)12-18d，葉腋處可誘導(dǎo)出腋芽，在30d后即可長(zhǎng)至2-3cm高； 步驟五，增殖培養(yǎng):截取上述步驟四中誘導(dǎo)出的腋芽接種于增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培 養(yǎng)，20-25d培養(yǎng)一代； 步驟六，生根培養(yǎng):選取步驟五中獲得的健壯試管苗，切取頂端長(zhǎng)2cm接入生根培養(yǎng)基 中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20d后試管苗可生根； 步驟七，煉苗移栽:將步驟六中生根良好，生長(zhǎng)健壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí) 驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3的開(kāi)度，煉苗2d，最后將瓶蓋完全揭開(kāi)， 煉苗Id后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì)中，并用小拱棚覆蓋;煉苗過(guò)程中，要保證基質(zhì) 足夠的水分，并采取遮光措施;25d后即可成活； 以上步驟四、五和六接種工作均在超凈工作臺(tái)中操作，試管苗的培養(yǎng)均在組織培養(yǎng)室 內(nèi)進(jìn)行，其培養(yǎng)條件為:在溫度25°C，光照強(qiáng)度1200-1500LX，光照周期12h/d的條件下進(jìn)行 的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，步驟七煉苗移 栽：以紅壤或腐殖土為原料，將生根良好，生長(zhǎng)健壯的試管苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室 或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗5d，然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3的開(kāi)度，煉苗2d;最后將瓶蓋完全揭開(kāi)，煉苗 Id后，將組培苗從組培瓶中移栽至基質(zhì)中，并用小拱棚覆蓋。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，步驟七中采用珍 珠巖與紅壤土，或者珍珠巖與腐殖土配合制得練苗移植基質(zhì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，步驟七煉 苗移栽中的煉苗基質(zhì)為紅壤:腐殖土:珍珠巖=1:1:1或腐殖土:珍珠巖=1:1或全腐殖土中的 一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，所述步驟一中 75%酒精消毒時(shí)間為1 Os，0.1%升汞為15min，外植體的消毒效果較佳。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，步驟五所述的增 殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花倒水蓮離體快繁育苗方法，其特征在于，步驟六所述的生 根培養(yǎng)基配方為 1/2MS+IBA (hi mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活性炭。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105993955SQ201610377608
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】辛培堯, 辛亞龍, 唐軍榮, 李斌, 費(fèi)希同, 何承忠, 韓國(guó)偉
【申請(qǐng)人】西南林業(yè)大學(xué)