銀魚三倍體高效育成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銀魚三倍體高效育成方法，包括如下步驟：他莫昔芬抑制劑配備、他莫昔芬注射液的配制、注射處理母本、冷休克+靜水壓處理、雌激素抑制劑溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制劑溶液中，獲得銀魚雄性四倍體純系、取雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。采用本發(fā)明的方法，可獲得100%的銀魚三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無污染。
【專利說明】
銀魚三倍體高效育成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及銀魚的多倍體繁育方法，具體涉及銀魚三倍體高效育成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀魚，體長略圓，細嫩透明，色澤如銀，生活周期短，生殖力和定居能力強，其營養(yǎng) 價值高，是我國重要的經(jīng)濟魚類之一。三倍體銀魚的不育特征，使其在生長速度、抗逆性、抗 病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，不育三倍體銀魚是通過四倍體 魚與二倍體魚倍間雜交獲得，但要獲得98%以上的三倍體魚，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純 度極高的四倍體魚系。
[0003] 在魚類遺傳育種中，通常利用冷/熱休克，或通過雜交等方法抑制受精卵的第一次 有絲分裂或直接異源染色體加倍，制備出同源或異源四倍體魚，其中冷休克一般是與靜水 壓處理一起，難以獲得較高純度的四倍體系，而熱休克的方式雖然易于操作，同樣，難以獲 得純度高的四倍體系;而雜交的方法雖然純度高，但成功率低、周期長。此外，上述這些方法 制備的四倍體魚，有些可育、有些又不可育，同時也可能存在基因混雜現(xiàn)象（異源四倍體）， 容易造成生物危險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高受精率和孵化率、且 方法穩(wěn)定、種群純度高達100%的銀魚三倍體高效育成方法。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 銀魚三倍體高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到200~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用，催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-10 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為50~200yg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注 射液 50_200yg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~l.〇°C的冷水 中，靜水壓壓力為250~340Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為100~250mg/l，睪 酮的濃度為40~100mg/l; (6)取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，受精卵 與雌激素抑制劑溶液的用量按重量計比為1:3,常溫浸泡10~30s，然后取出放于孵化器中 正常孵化;從而獲得銀魚雄性四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA復制和促雄性的 雙重作用的同時，推延了受精卵第一次卵裂的時間（3-5min)和提高了同步程度(高達99%)， 為染色體加倍和提高其四倍體率提供了時間保障和奠定了堅實基礎(chǔ);2、在受精卵一次卵裂 采用冷休克與較低的靜水壓(低于常用的350kg/cm 2)，以及較短的處理時間（低于5min)，不 僅有效降低了因為冷休克時間過長、壓力過高對受精卵的破壞程度，提高受精卵的成活率， 而且降低了操作難度與加壓成本;3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強化與保證雄性轉(zhuǎn)化 率;4、用純系的雄性四倍體與原有的雌性二倍體回交，有效保證了三倍體的純度。因而通過 此方法，可獲得100%的銀魚三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選 種的麻煩，更主要是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無污染。
【具體實施方式】
[0007] 現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。
[0008] 實施例一 銀魚三倍體高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到200ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度約為〇.4mg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為150yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為〇°C的冷水中，靜水 壓壓力為280Kg/cm 2,持續(xù)時間為3min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為200mg/l，睪酮的濃度為 80mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得銀魚雄性四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0009] 實施例二 銀魚三倍體高效育成方法，包括如下步驟： (1)他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度為〇. lmg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為200yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1°C的冷水中，靜水 壓壓力為310Kg/cm 2,持續(xù)時間為3min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為250mg/l，睪酮的濃度為 100mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡l〇s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得銀魚雄性四倍體純系； (7 )三倍體的獲得:取步驟(6 )的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
[0010]上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計。
[0011]附:銀魚三倍體育成結(jié)果統(tǒng)計表
注:上述結(jié)果是在注射液中他莫昔芬濃度為O.lmg/ml的條件下常溫浸泡10S，靜水壓處 理3min所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項】
1.銀魚三倍體高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到200~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用，催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-10 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為50~200yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~l.〇°C的冷水 中，靜水壓壓力為250~340Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為100~250mg/l，睪 酮的濃度為40~100mg/l; (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，受精卵 與雌激素抑制劑溶液的用量按重量計比為1:3,常溫浸泡10~30s，然后取出放于孵化器中 正常孵化;從而獲得銀魚雄性四倍體純系； (7) 三倍體的獲得:取步驟(6)的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回 交的方式，獲得1 〇〇%三倍體。
【文檔編號】A01K67/027GK106035235SQ201610500180
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 羅玉雙, 石彭靈
【申請人】湖南文理學院