用于提高作物產(chǎn)量和防蟲害的真菌內(nèi)生菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了作物和至少一種真菌內(nèi)生菌的合成組合，其中作物是該內(nèi)生菌的宿主植物。還提供了用于產(chǎn)生所述合成組合的方法和組合物。內(nèi)生菌繁殖并且增強(qiáng)了作物的農(nóng)藝學(xué)特征。還描述了用內(nèi)生菌接種宿主植物的方法，用于繁殖宿主?內(nèi)生菌組合的方法，以及用于檢測宿主植物內(nèi)內(nèi)生菌或其代謝產(chǎn)物的存在的方法。
【專利說明】
用于提高作物產(chǎn)量和防蟲害的真菌內(nèi)生菌
[0001 ] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求均在2013年11月6日提交的美國臨時專利申請No . 61/900，929和61/ 900,935的優(yōu)先權(quán)，將其全部按引用并入本文中。
[0003] 序列表的引入
[0004] 隨同本文一起電子提交了序列表并按引用并入本文中，所述序列表包含在 Microsoft Windows操作系統(tǒng)中測量的33千字節(jié)并且在2014年11月6日生成的名為 TAMC027W0_ST25 · txt 的文件中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及用于提高產(chǎn)量和/或用于防蟲害的農(nóng)作物真菌內(nèi)生菌。
【背景技術(shù)】
[0006] 真菌內(nèi)生菌是定殖在植物組織內(nèi)部且不引起明顯損害或疾病的真菌。特定的真菌 內(nèi)生菌，如菌根，在各種不同的宿主植物組織內(nèi)存活，常常定殖在宿主的葉、莖、花或根的細(xì) 胞間隙中。共生的內(nèi)生菌-宿主關(guān)系可以給宿主植物提供幾種健康度益處，如營養(yǎng)的增強(qiáng) 和/或提高的耐旱性。根定殖菌根依賴于來自植物的光合成碳水化合物存活，并且作為回 報，其幫助水和礦物質(zhì)的增溶并吸收至宿主中，這可以導(dǎo)致促進(jìn)種子發(fā)芽和植物生長。另 外，真菌內(nèi)生菌與宿主植物的關(guān)聯(lián)可以提供對各種生物和非生物脅迫的耐受性。據(jù)認(rèn)為通 過內(nèi)生菌-宿主關(guān)聯(lián)的多個有益特性獲得了宿主生長、健康度促進(jìn)和保護(hù)。例如，植物內(nèi)生 生物體可以產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)物質(zhì)來誘使生物質(zhì)產(chǎn)生和生物堿或其他代謝產(chǎn)物。另外，真菌內(nèi) 生菌可以直接抑制或?qū)怪虏∥⑸?，保護(hù)植物免受可能的致病菌的傷害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一個方面中，本發(fā)明提供了用于改善農(nóng)業(yè)植物性狀的方法，包括將所述植物的 農(nóng)業(yè)種子接觸包含至少一個物種的純化兼性真菌內(nèi)生菌的制劑，其中該內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對 植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)，并且其中內(nèi)生菌以與農(nóng)業(yè)環(huán)境中種植的參照 種子相比有效調(diào)節(jié)對于從種子生長的農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌的定殖頻率，并且對種子或從 種子生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于制劑中。
[0008] 在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于對農(nóng)業(yè)植物提供益處的方法，包括用包含純 化的兼性真菌內(nèi)生菌和農(nóng)業(yè)上可接受載體的組合物處理所述植物、所述植物的種子或所述 植物或種子的根圍，其中該內(nèi)生菌能夠?qū)崿F(xiàn)以下至少一種:減少害蟲繁殖、殺滅害蟲和阻止 害蟲，并且其中內(nèi)生菌以對種子或從種子產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)植物有效地提供益處的量存在于組合 物中。
[0009] 在再另一個方面中，本發(fā)明提供了用于對農(nóng)業(yè)植物提供益處的方法，包括獲得農(nóng) 業(yè)植物種子和純化的兼性真菌內(nèi)生菌的合成組合，其中該內(nèi)生菌能夠?qū)崿F(xiàn)以下至少一種： 減少害蟲繁殖、殺滅害蟲和阻止害蟲，并且其中內(nèi)生菌以對種子或從種子產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)植物 有效地提供益處的量存在于合成組合中。
[0010] 在另一個實施方案中，提供了生產(chǎn)具有非天然存在的內(nèi)生菌比例的植物的方法， 其中所述方法包括將植物的農(nóng)業(yè)種子接觸包含至少一個物種的兼性真菌內(nèi)生菌的制劑，其 中該內(nèi)生菌以與農(nóng)業(yè)環(huán)境中種植的參照種子相比有效調(diào)節(jié)對于從種子生長的農(nóng)業(yè)植物天 然的內(nèi)生菌的定殖頻率的量存在于制劑中，其中具有非天然存在的內(nèi)生菌比例的植物與具 有天然存在的比例的植物相比具有改善的性狀。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能夠 產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。
[0011] 在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于改變植物中的系統(tǒng)防御途徑的方法，包括將 所述植物的農(nóng)業(yè)種子接觸包含至少一個物種的純化兼性真菌內(nèi)生菌的制劑，其中該內(nèi)生菌 能夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)，并且其中內(nèi)生菌以有效調(diào)節(jié)從植 物種子生長的農(nóng)業(yè)植物內(nèi)至少一種植物激素的水平以及對種子或從種子生長的農(nóng)業(yè)植物 提供益處的量存在于合成組合中。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物有 益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。
[0012] 在其他實施方案中，本發(fā)明提供了與農(nóng)業(yè)環(huán)境中種植的參照種子相比調(diào)節(jié)對于從 種子生長的農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌的定殖頻率的方法，包括將農(nóng)業(yè)植物的種子接觸包含至 少一個物種的兼性真菌內(nèi)生菌的制劑，并且其中內(nèi)生菌以有效調(diào)節(jié)天然內(nèi)生菌的定殖頻率 以及對種子或從種子生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于制劑中。在特定的方面中，天然 內(nèi)生菌是鏈格孢屬(Alternaria)的。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物 有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。
[0013] 在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于改變植物中的系統(tǒng)防御途徑的方法，包括將 所述植物的農(nóng)業(yè)種子接觸包含至少一個物種的純化兼性真菌內(nèi)生菌的制劑，并且其中該內(nèi) 生菌以有效調(diào)節(jié)從植物種子生長的農(nóng)業(yè)植物內(nèi)至少一種植物激素的水平以及對種子或從 種子生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于合成組合中。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生 菌能夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。
[0014] 在再另一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有包含鏈格孢屬的內(nèi)生菌的真菌內(nèi)生菌 網(wǎng)絡(luò)的植物的方法，包括(a)將農(nóng)業(yè)植物的種子接觸包含至少一個非鏈格孢屬物種的兼性 真菌內(nèi)生菌的制劑，其中該內(nèi)生菌以對種子或從種子生長的農(nóng)業(yè)植物有效地提供益處的量 存在于制劑中，并且其中從種子生長的植物包含鏈格孢屬的內(nèi)生菌。在進(jìn)一步的方面中，兼 性真菌內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。
[0015] 本文中還提供了農(nóng)業(yè)植物種子和包含至少一個物種的純化的昆蟲病原性真菌內(nèi) 生菌的組合物的合成組合，其中該內(nèi)生菌能夠（1)定殖于從植物種子生長的農(nóng)業(yè)植物中，和 (2)從農(nóng)業(yè)植物實現(xiàn)以下至少一種:減少害蟲繁殖、殺滅害蟲和阻止害蟲;其中內(nèi)生菌不是 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)種，并且其中內(nèi)生菌以在種子或植物生長于農(nóng)業(yè)環(huán)境中 時對種子或從種子產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)植物有效地提供除了增強(qiáng)的生物脅迫抗性以外的益處的量 存在于合成組合中。
[0016] 在再另一個方面中，本發(fā)明提供了農(nóng)業(yè)植物種子和包含至少一個物種的純化兼性 真菌內(nèi)生菌的組合物的合成組合，其中該內(nèi)生菌以有效調(diào)節(jié)從植物種子生長的農(nóng)業(yè)植物內(nèi) 至少一種植物激素的水平以及對種子或從種子生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于合成 組合中。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這 兩者的物質(zhì)。
[0017] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了農(nóng)業(yè)植物種子和包含至少一個物種的純化兼 性真菌內(nèi)生菌的組合物的合成組合，其中兼性真菌內(nèi)生菌以與農(nóng)業(yè)環(huán)境中種植的參照種子 相比有效調(diào)節(jié)對于從種子生長的農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌的定殖頻率以及對種子或從種子 生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于合成組合中。在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能 夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物質(zhì)。在特定的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌 以與農(nóng)業(yè)環(huán)境中種植的參照種子相比有效調(diào)節(jié)對于從種子生長的農(nóng)業(yè)植物天然的鏈格孢 屬的內(nèi)生菌的定殖頻率的量存在于合成組合中。
[0018] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，包含純化兼性真菌內(nèi)生菌 的組合物還包含農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
[0019] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，兼性真菌內(nèi)生菌可以是絲 狀真菌內(nèi)生菌。在其他實施方案中，兼性內(nèi)生菌可以是形成孢子的。在進(jìn)一步的其他實施方 案中，兼性內(nèi)生菌可以是有隔膜真菌內(nèi)生菌。在再其他實施方案中，兼性真菌內(nèi)生菌可以是 暗色有隔膜真菌內(nèi)生菌。在一些實施方案中，兼性內(nèi)生菌可以是昆蟲病原體。在一些實施方 案中，兼性真菌內(nèi)生菌可以屬于子囊菌門(Ascomycota)或擔(dān)子菌門（Basidiomycota)。在進(jìn) 一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌可以屬于盤菌亞門（Pezizomycot ina)、傘菌亞門 (八831'：[(301117(3(^;!_1^)或黑粉菌亞門（1]8七;!_138；!_11〇1117(3(^;!_1^)。在再另一個方面中，兼性真菌內(nèi) 生菌可以屬于類殼菌綱（Sordariomycetes )、座囊菌綱（Dothideomycetes )、傘菌綱 (八8&1'；!_(30111706七68)、黑粉菌綱（1]8七；!_138；!_110111706七68)或散囊菌綱化111'(^；!_0111706七68)。在再另 一個方面中，兼性真菌內(nèi)生菌可以屬于肉座菌目（Hypocreales)、格孢腔菌目 (Pleosporales)、煤食菌目（Capnodiales)、類殼菌目（Sordariales)、多孔菌目 (Polyporales)、間座殼菌目（Diaporthales)、黑粉菌目（Ustilaginales)、炭角菌目 (Xylariales)、圓盤菌目（Orbiliales)、假毛球殼目（1'1'；[(31108卩11&61^&168)或散囊菌目 (Eurotiales)0
[0020] 在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌可以是來自表1的種，即：交互枝頂孢 (Acremonium al ternatum)、互隔鏈格抱（A1 ternaria al ternata)、蕓苔鏈格抱 (Alternaria brassicae)、密實鏈格抱（Alternaria compacta)、香石竹鏈格抱 (Alternaria dianthi)、長柄鏈格抱（Alternaria longipes)、蘋果鏈格抱（Alternaria mali)、芝麻鏈格孢(Alternaria sesami)、前鏈格孢(Alternaria solani)、鏈格孢屬、極細(xì) 鏈格抱(Alternaria tenuissima)、子囊菌門（Ascomycota sp.)、穆狀平臍懦抱(Bipolaris spicifera)、變灰尾抱(Cercospora canescens)、辣椒尾抱(Cercospora capsici)、菊池尾 抱（Cercospora kikuchii)、百日草尾抱（Cercospora zinnia)、球毛殼菌（Chaetomium globosum)、Chaetomium p i lul if erum、毛殼菌屬（Chaetomium sp·)、芽枝狀枝抱 (Cladospor ium cladosporioides)、枝抱屬（Cladosporium sp·)、夏抱生枝抱 (Cladosporium uredinicola)、方定抱腔菌屬（Cochliobolus sp)、Phanerochaete crassa、 Phoma americana、Phoma subherbarum、楓香擬莖點霉（Phomopsis liquidambari)、擬莖點 霉屬(Phomopsis sp ·)、格抱腔菌屬(Pleospora sp ·)、格抱腔菌科(Pleosporaceae sp ·)、 多孔菌目、Preussia africana、光黑殼屬（Preussia sp.)、Pseudozyma sp·、圓核腔菌 (Pyrenophora teres)、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici)、Coniolariella gamsii、 油桐盾殼酶（Coniothyrium aleuritis)、盾殼霉屬（Coniothyrium sp.)、多主棒抱霉 (Corynespora cassiicola)、間座殼屬（Diaporthe sp ·)、蕉抱殼屬（Diatrype sp·)、 Drechslerella dactyloides、Embellisia indefessa、黑附球菌（Epicoccum nigrum)、附 球菌屬（Epicoccum sp ·)、卩彖狀明臍菌（Exserohilum rostratum)、厚抱鏡刀菌（Fusarium chlamydosporum)、鏡刀菌屬（Fusarium sp ·)、Gibellulopsis nigrescens、Gnomoniopsis sp.、Lewia infectoria、咖啡球腔菌（Mycosphaerella coffeicola)、球腔菌科 (Mycosphaerel laceae sp ·)、稻黑抱菌（Nigrospora oryzae)、黑抱菌屬（Nigrospora sp·)、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica)、擬青霉屬（Paecilomyces sp·)、桔青霉 (Penicillium citrinum)、Retroconis sp ·、根盤菌屬（Rhizopycnis sp ·)、Schizothecium inaequale、殼多抱屬（Stagonospora sp. )、Stemphylium lancipes、Thielavia hyrcaniae、梭抱殼屬（Thielavia sp·)、Ulocladium chartarum、輪枝抱屬（Verticillium sp.)、球孢白僵菌、寄生曲霉、錯蟻輪枝菌（Lecanicillium lecanii)和淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)。
[0021] 在進(jìn)一步的方面中，兼性真菌內(nèi)生菌包含與SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:77任一個 中提供的核酸至少97%相同，例如，至少98%相同、至少99%相同、至少99.5%相同或100% 相同的核酸，例如，實施例16中所列的那些。
[0022] 在針對這些方法中的某些的另一個方面中，可以包括將接觸的種子包裝在容器中 的附加步驟。在特定方面中，包裝材料可以選自袋子、盒子、箱子、信封、紙盒或容器，并且可 以包含干燥劑。
[0023]在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，在群體水平測量對處理的 種子或從處理的種子生長的植物的益處，如與植物的參照群體比較的。在特定方面中，兼性 真菌內(nèi)生菌可以對作物提供益處，包括從用內(nèi)生菌處理的種子產(chǎn)生的多種農(nóng)業(yè)植物。在特 定方面中，本發(fā)明公開了通過種植上述種子的群體產(chǎn)生的基本上均一的植物群體。在一個 實施方案中，至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或更多植物在一個或多個組織中包 含有效量的一種或多種內(nèi)生菌。在另一個實施方案中，至少1〇%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、75%、至少80%、至少95%或更多植物包含基本上相似的微生物群體。
[0024] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，植物在農(nóng)業(yè)背景或環(huán)境中 生長，包括溫室。在一個實施方案中，農(nóng)業(yè)背景或環(huán)境包括至少100株植物。在另一個實施方 案中，群體占據(jù)至少約100平方英尺的空間，其中群體的至少約10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或超過90%包含有效量的微生物。在另一個實施方案中，群體 占據(jù)至少約100平方英尺的空間，其中群體的至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 %、80 %、90 %或超過90 %在繁殖組織中包含微生物。在再另一個實施方案中，群體占據(jù) 至少約100平方英尺的空間，其中群體的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%或超過90%包含至少100?1]、10(^?1]、1，00(^?1]、10,00(^?1]或更多本發(fā)明的兼性 真菌內(nèi)生菌。在再另一個實施方案中，群體占據(jù)至少約100平方英尺的空間，其中群體的至 少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或超過90%包含本發(fā)明的兼性真 菌內(nèi)生菌。
[0025] 在一個實施方案中，群體中的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或更多的種子含有布 置在種子表面上的一種或多種活的內(nèi)生菌。在特定的實施方案中，群體中的至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、 至少95%或更多的種子含有至少10CFU，例如，至少30CFU、至少100CFU、至少300CFU、至少1， 000CFU、至少3,000CFU、至少10,000CFU或更多涂覆到種子表面上的一種或多種內(nèi)生菌。
[0026]在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，對于農(nóng)業(yè)植物天然的并且 其定殖頻率或比例被改變的內(nèi)生菌可以屬于子囊菌門或擔(dān)子菌門。在再另一個方面中，農(nóng) 業(yè)植物天然的內(nèi)生菌可以是錘舌菌綱（Leotiomycetes)、座囊菌綱、散囊菌綱、酵母菌綱 (33(3(31131'01117〇6七68)、類殼菌綱、傘菌綱、微球黑粉菌綱(]\1；!_(31'〇13(^巧01117〇6七68)、銀耳綱 (Tremellomycetes)。在再另一個方面中，天然內(nèi)生菌可以屬于煤炱菌目、格孢腔菌目、刺盾 炱目（Chaetothyriales)、散囊菌目、酵母菌目（Saccharomycetales)、間座殼菌目、肉座菌 目、長喙殼菌目（Ophiostomatales)、糞殼菌目、假毛球殼目、炭角菌目、雞油菌目 (Cantharellales)、伏革菌目（Corticiales)、多孔菌目、紅燕目（Russulales)、鎖擲酵母目 (Sporidiobolales)或銀耳目（Tremellales)。在進(jìn)一步的方面中，天然內(nèi)生菌可以屬于新 球腔菌科（Davidiellaceae)、球腔菌科（Mycosphaerellaceae)、格抱腔菌科 (Pleosporaceae)、小雙腔菌科(Didymellaceae)、英抱腔菌科（Sporormiaceae)、刺盾食科 科(〇110111011130636)、蟲草菌科（(^0『(17(^。；^30636)、叢赤殼科（心(^1'130636)、肉座菌科 (Hypocreaceae) ^Plectosphaerel laceae > -^：P^^^f4(〇phi〇stomataceae) > (Chaetomiaceae)、毛球殼菌科（Lasiosphaeriaceae)、假毛球殼菌科 (1'1'；[(3]108口]1&61'1&06&6)、角擔(dān)菌科（〇6以七(^&81(11&06&6)、伏革菌科（〇01^；!_(^&06&6)、革菌 科(Coriolaceae)、隔抱伏革菌科(Peniophoraceae)、鎖擲酵母科(3口〇!^(1;!_〇13〇13〇636)或銀 耳科(Tremellaceae)。在進(jìn)一步的方面中，農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌可以是來自表2的物種， 艮P，枝孢屬、芽枝狀枝孢、新球腔菌屬(Davidiella sp.)、尾孢屬(Cercospora sp.)、甜菜生 尾孢(Cercospora beticola)、鏈格孢屬、互隔鏈格孢、柑橘鏈格孢(Alternaria citri)、極 細(xì)鏈格孢、旋孢腔菌屬、彎孢霉屬(Curvularia sp.)、明臍菌屬(Exserohilum sp.)、李維菌 屬（Lewia sp.)、Lewia infectoria、核腔菌屬（Pyrenophora sp·)、偃麥草核腔菌 (Pyrenophora tritici-repentis)、格抱腔菌屬、Phoma americana、Preussia africana、 青霉屬（Penicillium sp.)、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces sp .)、疏棉狀嗜熱絲孢菌 (Thermomyce s lanuginosus)、念珠菌屬（Candida sp.)、桔假絲酵母（Candida quercitrusa)、熱帶念珠菌（Candida tropical is) > Cyber lindnera sp ·、Cyber lindnera jadinii、克魯維酵母屬（Kluyveromyces sp .)、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)、Gnomoniops i s sp·、球抱白僵菌、蟲草屬（Cordyceps sp·)、球抱蟲草 (Cordyceps bassiana)、鏡刀菌屬、Gibellulopsis nigrescens、肉座菌屬（Hypocrea sp.)、哈茨木霉(Hypocrea lixii)、綠色木霉菌(Hypocrea virens)、木霉屬（Trichoderma sp ·)、Trichoderma tomentosum、輪枝抱屬、長口彖殼菌屬（Ophiostoma sp ·)、0phiostoma dendifundum、毛殼菌屬（Chaetomium sp.)、球毛殼菌、Thielavia hyrcaniae、戴氏霉屬 (Taifanglania sp ·)、Taifanglania inf lata、Schizothecium inaequale、黑抱菌屬、絲核 菌屬（Rhizoctonia sp.)、顯革菌屬（Phanerochaete sp)、檢菌屬（Trametes sp.)、毛檢孔 菌（Trametes hirsuta)、長絨毛檢菌（Trametes villosa)、紅酵母屬（Rhodotorula sp·)、 膠紅酉孝母（Rhodotorula mucilaginosa)、隱球菌屬（Cryptococcus sp)、Cryptococcus skinneri或銀耳屬（Tremella sp.)〇
[0027] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，通過兼性真菌內(nèi)生菌對農(nóng) 業(yè)植物提供的益處是選自以下的改善的農(nóng)藝特性:相對于參照植物增加的生物質(zhì)、增加的 分蘗、增大的根群、增加的開花、提高的產(chǎn)量、提高的水利用效率、產(chǎn)量損失的降低、改變的 植物高度、縮短的發(fā)芽時間、提高的秧苗高度、增加的根長度、提高的葉綠素水平、發(fā)育花的 保持、發(fā)育果的保持、改變的植物激素水平和增強(qiáng)的對環(huán)境脅迫的抗性。在一些方面中，提 供的益處是至少兩種植物激素的水平的改變。在一些方面中，環(huán)境脅迫選自干旱脅迫、冷脅 迫、熱脅迫、營養(yǎng)缺乏、鹽毒性、鋁毒性、食草動物的放牧、蟲害、線蟲侵染及真菌感染、細(xì)菌 感染和病毒感染。在一些方面中，對于源自種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是所述植物群體相對于 參照植物群體的產(chǎn)量提高約5 %、10 %、15 %、20 %、30 %、40 %或45 %。在其他方面中，對于 源自種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是所述植物群體相對于參照植物群體的產(chǎn)量損失的降低超過 40%、30%、20%、10%、5%或1%。在一些方面中，用兼性真菌內(nèi)生菌處理種子可以在從處 理的種子生長的植物中降低薊馬損害、降低盲蝽損害、提高遮棚溫度、提高干旱耐受性、增 加地上生物質(zhì)和增加地下生物質(zhì)。
[0028] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，兼性真菌內(nèi)生菌以有效獲 得從種子生長的農(nóng)業(yè)植物的葉、莖或根的至少50%定殖的量存在于合成組合中。
[0029] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，兼性真菌內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生 對害蟲有害的物質(zhì)。在特定的方面中，害蟲可以是線蟲和/或昆蟲，例如，根結(jié)線蟲、蚜蟲、草 盲蝽、椿象或其組合。
[0030] 在針對這些方法和合成組合中的某些的進(jìn)一步方面中，合成組合可以包含至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種兼性真菌內(nèi)生菌。在一個方面 中，本發(fā)明提供了棉花植物或種子和包括選自表1中那些的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種內(nèi)生菌的真菌內(nèi)生菌的合成組合，其中棉花或種子是 該內(nèi)生菌的宿主。
[0031] 在另一個方面中，提供包含真菌內(nèi)生菌和至少一種粘著劑的種子包衣，所述真菌 內(nèi)生菌包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種來自表1的 內(nèi)生菌;其中真菌內(nèi)生菌接觸粘著劑。在特定方面中，粘著劑可以包含例如海藻酸、卡拉膠、 糊精、葡聚糖、pelgel、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、聚乙烯醇或其組合。在特定 方面中，粘著劑可以具有 1:1-10、1:10-50、1:50-100、1:100-500、1:500-1000或 1:1000-5000的真菌內(nèi)生菌與粘著劑的重量比。種子包衣可以是固體或流體。在特定方面中，種子包 衣是粉末。在特定方面中，真菌內(nèi)生菌可以包含真菌孢子。在各個不同的方面中，種子包衣 可以包含約1、2、5、10、50、10 2、103、104、105、106、10 7、108或109或更多個集落形成單位/克或 孢子/克。
[0032] 在特定實施方案中，用于葉或土壤應(yīng)用的組合物可以包含真菌內(nèi)生菌和至少一種 載體、表面活性劑或稀釋劑，所述真菌內(nèi)生菌包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20種來自表1的內(nèi)生菌。在特定方面中，組合物可以包含約1、2、5、10、 50、10 2、103、104、105、106、10 7、108或109或更多個集落形成單位/克或孢子/克。在各個不同的 方面中，組合物可以包含例如水、去污劑、Triton X、殺蟲劑、殺真菌劑或其組合。在進(jìn)一步 的實施方案中，種子組合物包含植物種子和上述種子包衣。在特定方面中，植物種子包含棉 花種子、農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物的種子、雙子葉植物種子和/或單子葉植物種子。在特定方面中，種 子組合物可以抵抗包括昆蟲和/或線蟲的害蟲。
[0033] 在再另一個方面中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防害蟲侵襲或提高產(chǎn)量的方法，其可以 包括用本文中所述的包含內(nèi)生菌的組合物處理植物、植物種子或所述植物或種子的根圍。 在特定方面中，所述方法還可以包括鑒定需要內(nèi)生菌處理的植物或種子。害蟲可以包括例 如線蟲和/或昆蟲。在特定方面中，害蟲可以包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。
[0034] 在再另一個方面中，提供了用于預(yù)防害蟲侵襲的方法，包括獲得本文中所述的種 子并種植所述種子。該方法可以進(jìn)一步包括確認(rèn)預(yù)防害蟲侵襲的需要。在特定方面中，害蟲 可以包括例如線蟲和/或昆蟲;和/或害蟲可以包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。 [0035]在進(jìn)一步的實施方案中，一種用于處理害蟲侵襲的方法包括鑒定懷疑受害蟲侵染 的植物，將上述組合物施用于植物，由此產(chǎn)生內(nèi)生菌處理的植物。在特定方面中，害蟲可以 包括例如線蟲和/或昆蟲;和/或害蟲可以包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。
[0036] 在再另一個方面中，提供了一種生產(chǎn)抗害蟲種子的方法，包括提供包含至少1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種來自表1的內(nèi)生菌的真菌內(nèi)生菌 組合物，提供種子;并將種子與內(nèi)生菌組合物組合，由此產(chǎn)生抗害蟲種子。在特定方面中，該 方法提高了從種子發(fā)育的植物的內(nèi)生菌定殖百分比。
[0037] 在再另一個方面中，公開了提高作物產(chǎn)量或降低損失的方法，包括提供包含至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種來自表1的內(nèi)生菌的真菌內(nèi) 生菌組合物;并將內(nèi)生菌組合物施用于種子、植物或其部分，由此提高作物的產(chǎn)量。在特定 方面中，作物可以是棉花，并且產(chǎn)量提高可以為相對于未施用內(nèi)生菌組合物的作物的至少 約2 %、3%、5%、15%、20%或25%。在特定方面中，產(chǎn)量提高為相對于未使用內(nèi)生菌組合物 的作物的約2%-5%、3%-5%、5%-10%、10%-15%或高于約20%、30%或更多。在特定方 面中，作物是棉花，并且產(chǎn)量的提高包括降低的棉鈴損害。在特定方面中，損失的降低包括 由于昆蟲侵襲或干旱引起的損失的降低，并且降低相對于未施用內(nèi)生菌組合物的作物低于 50%、40%、30%、20%、10%、5% 或 5%。
[0038] 本文中還描述了包含植物或植物的部分(包括種子)并且進(jìn)一步包含以可檢測水 平(例如，通過PCR檢測其核酸的存在)存在的上述兼性真菌內(nèi)生菌的商業(yè)植物產(chǎn)品。在另一 個方面中，公開了一種生產(chǎn)商業(yè)植物產(chǎn)品的方法，包括從上述合成組合獲得植物或植物組 織，并且從其生產(chǎn)商業(yè)植物產(chǎn)品?？梢詮姆N子或從自種子生長的植物(或植物的部分)來生 產(chǎn)商業(yè)植物產(chǎn)品。也可以從這樣的植物或植物部分的后代來生產(chǎn)商業(yè)植物產(chǎn)品。商業(yè)植物 產(chǎn)品可以選自籽粒、面粉、淀粉、種子油、糖汁、粗粉、面粉、油、膜、包裝、營養(yǎng)產(chǎn)品、動物飼 料、魚伺料、谷物廣品、加工的人食品、糖或者醇和蛋白質(zhì)。
【附圖說明】
[0039]圖1:定殖效率證明了內(nèi)生菌可以在田間操作。描繪了在通過用不同孢子濃度的 (左)淡紫擬青霉或(右)球孢白僵菌處理的種子接種的田間條件下，棉花秧苗的平均+/-SE 內(nèi)生菌定殖效率。
[0040]圖2:在作為內(nèi)生菌存在于棉花中時，真菌內(nèi)生菌淡紫擬青霉負(fù)面地影響了根結(jié)線 蟲(南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita))的繁殖。在高線蟲接種水平（10,000個卵)下， 在用含有1〇6或1〇7個孢子/ml的溶液處理種子后，與未處理的對照種子相比，內(nèi)生菌降低了 植物中的卵產(chǎn)生。在田間接種水平(2000個卵）下，內(nèi)生菌的存在在兩個種子處理濃度下都 顯著降低了蟲癭和卵產(chǎn)生。
[0041]圖3:內(nèi)生菌球毛殼菌負(fù)面地影響了根結(jié)線蟲繁殖。棉花種子在0(未處理對照）、 106和108個孢子/ml的溶液中浸泡處理后，內(nèi)生菌球毛殼菌對根結(jié)線蟲蟲癭形成和卵產(chǎn)生的 負(fù)效應(yīng)。秧苗接種1000個線蟲卵于溫室中生長。60天后定量成功侵染秧苗的孵化線蟲的卵 產(chǎn)生。
[0042]圖4A，4B:真菌內(nèi)生菌對棉花姐蟲(棉姐(Aphis gossypii))繁殖的作用。圖4A證明 了棉花中球孢白僵菌的存在負(fù)面地影響了棉花蚜蟲的繁殖。圖4B證明了棉花中淡紫擬青霉 的存在負(fù)面地影響了棉花蚜蟲的繁殖。
[0043] 圖5:球毛殼菌對棉花蚜蟲的作用。棉花中的內(nèi)生菌球毛殼菌負(fù)面地影響了棉花蚜 蟲群體生長率，如通過14天后內(nèi)生菌定殖相對于對照植物降低的繁殖所證明的。棉花植物 從通過在〇(對照）、1〇 6(低)和1〇8(高)個孢子/ml的孢子溶液中浸泡處理的種子生長得到。
[0044] 圖6A，6B:真菌內(nèi)生菌球孢白僵菌和淡紫擬青霉對西部牧草盲蝽草盲蝽（Lygus hesperus)(盲蝽科(Miridae))的作用。圖6A證明了當(dāng)作為棉花中的內(nèi)生菌存在時，球孢白 僵菌和淡紫擬青霉負(fù)面地影響西部牧草盲蝽的宿主植物選擇。圖6B證明了當(dāng)作為棉花中的 內(nèi)生菌存在時，球孢白僵菌和淡紫擬青霉負(fù)面地影響了西部牧草盲蝽的宿主植物選擇行 為。
[0045] 圖7A，7B:真菌內(nèi)生菌球孢白僵菌和淡紫擬青霉對南方綠椿象（稻綠蝽(Nezara viridula)(蝽科(Pentatomidae))的作用。圖7A證明了當(dāng)作為棉花中的內(nèi)生菌存在時，球孢 白僵菌和淡紫擬青霉負(fù)面地影響了南方綠椿象的宿主植物選擇。圖7B證明了當(dāng)作為棉花中 的內(nèi)生菌存在時，球孢白僵菌和淡紫擬青霉負(fù)面地影響了南方綠椿象的宿主植物選擇行 為。
[0046] 圖8:在田間試驗過程中觀察到了棉鈴損害的降低。相對于對照植物，在將種子浸 泡在106和108孢子/ml濃度下的球孢白僵菌和淡紫擬青霉的孢子溶液中處理的植物中，昆蟲 相關(guān)的棉鈴損害水平較低。
[0047] 圖9:對田間棉花葉施用內(nèi)生昆蟲病原性真菌提高了植物性能。將多種典型的殺真 菌劑（甲霜靈、三唑醇、三氟敏、2-(thiocyanome-thylthio)苯并噻唑）和殺蟲劑(硫雙威、P比 蟲啉、陶斯松(〇11〇1'<^71^;1；'〇8))種子處理所處理的棉花（品種?11740132?)種子在田間條件 下種植并生長。在第5真葉階段給植物噴灑球孢白僵菌和煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus)的水溶液。包括鹿糖（1%*1:八〇1)作為真菌的附加營養(yǎng)源。在噴灑不含鹿糖 的球孢白僵菌和加蔗糖的煙色擬青霉的植物中觀察到了明顯更高的第一位棉鈴(發(fā)育果） 的保持。
[0048]圖10A，10B:田間條件下真菌內(nèi)生菌對棉花植物性能的正向作用。圖10A證明了處 理的植物相對未處理的植物中較高棉蕾保持的早季趨向。圖10B證明了在季節(jié)中較晚時間 內(nèi)生菌處理組中相對于對照保留了明顯更多的棉鈴。用所使用的兩個內(nèi)生菌種和所使用的 兩個種子處理濃度證明這一情況(重復(fù)測量AN0VA:時間，P〈0.001;時間*內(nèi)生菌，P = 0.045， 內(nèi)生菌，P = 〇.〇〇3)。
[0049] 圖11:田間條件下，真菌內(nèi)生菌對棉花產(chǎn)量的正向作用。數(shù)據(jù)證明了內(nèi)生菌處理在 處理的棉花植物中獲得了高25%的產(chǎn)量。
[0050] 圖12:在生長室秧苗分析下，真菌內(nèi)生菌對高粱(a)植物高度和(b)總的鮮生物量 的正向作用。所示數(shù)據(jù)是n=10獨立重復(fù)的平均植物高度(cm)和總的鮮生物量(g)。誤差條 表示±1標(biāo)準(zhǔn)誤差。所有三種真菌內(nèi)生菌相對于未處理對照提高了兩種性狀。
[0051 ]圖13:在用真菌內(nèi)生菌淡紫擬青霉(a，c)和球孢白僵菌(b，d)處理時，（a，b)莖和 (c，d)根中內(nèi)源性棉花內(nèi)生菌定殖的田間調(diào)節(jié)。所示數(shù)據(jù)是相對于未處理的對應(yīng)對照和植 物組織的定殖百分變化。
[0052] 圖14:針對15種兼性真菌內(nèi)生菌和兩個棉花栽培品種(Delta Pine(DP 0912B2RF) 和Phytogen(PHY 499WRF))的內(nèi)生菌處理植物和對照棉花植物之間產(chǎn)量的平均百分比差異 (η =旱地中的6個重復(fù)地塊，Col lege Station，TX)。在Delta Pine上，測試的15種兼性真菌 內(nèi)生菌中的11種，和在Phytogen上，15種中的14種顯示出相對于未處理棉花植物的產(chǎn)量提 尚。
[0053] 圖15:針對15種兼性真菌內(nèi)生菌和兩個棉花栽培品種(Delta Pine(DP 0912B2RF) 和Phytogen(PHY 499WRF))的內(nèi)生菌處理植物和對照棉花植物之間產(chǎn)量的總體平均百分比 差異(n =旱地中的6個重復(fù)地塊，College Station，TX)。條表示圍繞平均值的95%置信區(qū) 間。
[0054]圖16:內(nèi)生菌處理植物和對照棉花植物之間薊馬損害(A)和盲蝽損害(B)的平均百 分差異。在Delta Pine(DP 0912B2RF)栽培品種中針對15種兼性真菌內(nèi)生菌評價了薊馬損 害(n =旱地中的6個重復(fù)地塊，College Station，TX)。測試的15種兼性真菌內(nèi)生菌中12種 顯示出相對于未處理棉花植物的薊馬損害降低。在Phytogen(PHY 499WRF)栽培品種的棉花 植物中針對15種兼性真菌內(nèi)生菌評價了盲蝽損害（η =旱地中的6個重復(fù)地塊，C ο 11 e g e Station，TX)。測試的15種兼性真菌內(nèi)生菌中的6種顯示出與未處理棉花植物相比的盲蝽損 害的平均降低。
[0055]圖17:在(A)根長度和(B)地下重量的旱地試驗中，在6月測量的季中田間性狀。呈 現(xiàn)的數(shù)據(jù)是η = ι〇個獨立重復(fù)的平均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0056]圖18:在針對(藍(lán)條)De 1 ta Pine和(綠條)Phyton栽培品種的遮棚溫度（°C)的旱地 試驗中，在7月測量的季中田間性狀。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是相對于對照地塊的n=10個獨立重復(fù)的 塊對照平均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0057] 圖19:在針對(藍(lán)條)Delta Pine和（綠條)Phyton栽培品種的NDVI的旱地試驗中， 在8月測量的季中田間性狀。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是相對于對照地塊的n= 10個獨立重復(fù)的塊對照平 均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0058]圖20:在針對(藍(lán)條)Delta Pine和(綠條)Phyton栽培品種的第一位棉蕾保持的旱 地試驗中，在8月測量的季中田間性狀。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是相對于對照地塊的n=10個獨立重復(fù) 的塊對照平均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0059] 圖21:在針對(藍(lán)條)Delta Pine和(綠條)Phyton栽培品種的植物高度(cm)的旱地 試驗中，在8月測量的季中田間性狀。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是相對于對照地塊的n=10個獨立重復(fù)的 塊對照平均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0060] 圖22:在針對(藍(lán)條)Delta Pine和(綠條)Phyton栽培品種的植物高度(cm)的旱地 試驗中，在7月測量的季中田間性狀。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是相對于對照地塊的n=10個獨立重復(fù)的 塊對照平均，并且誤差條表示土一個標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0061]圖23:顯示了與未處理對照（左半圖）相比，用內(nèi)生菌處理的植物（右半圖）中提高 的生物量的照片。
[0062]圖24:顯示了針對從用真菌內(nèi)生菌處理的種子生長的植物和對照，干旱脅迫后以 天計的枯萎時間的表。
[0063]圖25:顯示了針對從用真菌內(nèi)生菌處理的種子生長的植物和對照，干旱脅迫后以 天計的死亡時間的表。
【具體實施方式】
[0064] 真菌內(nèi)生菌在自然界中普遍存在，實際上感染自然界和農(nóng)藝生態(tài)系統(tǒng)中的所有植 物。植物通常帶有在其組織中生活的多樣真菌，其作為可以提供針對各種生物和非生物應(yīng) 激原的保護(hù)的無癥狀內(nèi)生菌。本公開描述了可以是植物病原體、昆蟲和線蟲害蟲的病原體、 寄生蟲或拮抗劑的特定真菌內(nèi)生菌，由此對作物提供健康度和性能益處。共生內(nèi)生菌-宿主 關(guān)系可以對宿主植物提供幾種一般的健康和健康度益處，如營養(yǎng)的增強(qiáng)、提高的干旱耐受 性和/或潛在食草動物的化學(xué)防御及通常增強(qiáng)的生物量產(chǎn)生。根定殖的菌根依賴于來自植 物的光合碳水化合物存活，并且作為回報，幫助水和礦物質(zhì)的增溶并吸收至宿主中，這可以 導(dǎo)致種子發(fā)芽和植物生長的促進(jìn)。另外，真菌內(nèi)生菌與宿主植物的關(guān)聯(lián)常常提供針對病原 體的保護(hù)或?qū)Ω鞣N生物和非生物脅迫的耐受性，如昆蟲侵襲、放牧、水或營養(yǎng)缺乏、熱脅迫、 鹽或鋁毒性和極冷溫度。據(jù)認(rèn)為通過內(nèi)生菌-宿主關(guān)聯(lián)的多重有益特性獲得了宿主生長及 健康度促進(jìn)和保護(hù)。
[0065] 表1中提供的這些真菌內(nèi)生菌最初作為棉花的真菌內(nèi)生菌收集。這些真菌內(nèi)生菌 可以使用種子、土壤或葉施用來接種以在棉花內(nèi)生活，并通過提供對抗害蟲侵襲的保護(hù)作 用呈現(xiàn)令人驚訝的有益效果。害蟲可以是線蟲和/或昆蟲害蟲。此外，這些真菌內(nèi)生菌對棉 花產(chǎn)量具有出乎預(yù)料的有益效果。
[0066]描述了施用有益真菌以在作物內(nèi)確立內(nèi)寄生（endophytically)而提高植物性能 和產(chǎn)量，同時給予對抗昆蟲和線蟲害蟲的保護(hù)。在這一點上，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的限 制，如真菌在作為飽和的（inundative) 土壤或葉生物殺蟲劑施用暴露于環(huán)境后對UV光、干 燥或熱引起的降解的易感性。植物內(nèi)真菌的接種和內(nèi)寄生確立保護(hù)真菌免受UV光、干燥和 不利溫度的影響，同時在它們打算保護(hù)的特定植物組織中攜帶真菌。引入真菌以在植物內(nèi) 通過內(nèi)寄生生活不需要植物或微生物的遺傳修飾，并且真菌自身可以是用于自然產(chǎn)品的來 源。在各種不同的實施方案中，可以配制并施用真菌接種物，例如，在種植之前或期間在溝 施中作為種子的處理，或在植物發(fā)芽后作為葉面施用，并且在接種后，真菌內(nèi)生菌提供整季 的保護(hù)作用和較高的作物產(chǎn)量(大約高25% )。在特定實施方案中，產(chǎn)量的提高為相對于沒 有施用內(nèi)生菌組合物的作物的約5%、10%、15%、20%、30%、40%、45%、50%或高于50%。 在進(jìn)一步的實施方案中，產(chǎn)量的提高為損失降低的結(jié)果，包括由于昆蟲侵襲或干旱引起的 損失的降低，并且相對于沒有施用內(nèi)生菌組合物的作物，損失低于50%、40%、30%、20%、 10%、5%或5%。在特定實施方案中，作物是棉花并且損失的降低包括降低的棉鈴損害。 [0067]因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了宿主植物和允許宿主植物的改善農(nóng)藝學(xué)特性 的內(nèi)生菌的組合(也稱為"symbiotum"）。所述組合可以通過用本發(fā)明的真菌內(nèi)生菌菌株人 工接種、施用或以其他方式感染宿主植物或其種子(如棉花植物或其種子)或宿主植物組織 來獲得。因此，通過這樣的接種獲得的組合稱為"合成"組合（combination)、合成組合物 (composition)、合成種子包衣、合成抗害蟲種子組合物。真菌內(nèi)生菌可以存在于植物組織 (如根）內(nèi)的細(xì)胞間隙中。通過嫁接或其他接種方法，如用內(nèi)生菌菌絲或內(nèi)生菌孢子處理種 子、植物或其部分，植物或植物群體內(nèi)也可以發(fā)生真菌內(nèi)生菌的存在或真菌內(nèi)生菌也可以 在植物或植物群體內(nèi)維持。在特定實施方案中，在施用內(nèi)生菌之前，將植物、植物部分、根、 種子或葉滅菌以除去微生物。在特定的實施方案中，在添加本文中所述的內(nèi)生菌組合物之 前，將種子滅菌以除去天然的內(nèi)生菌。在特定方面中，種子發(fā)芽的能力不受滅菌影響。
[0068] 本發(fā)明還提供了用于檢測宿主植物內(nèi)本發(fā)明的真菌內(nèi)生菌存在的方法。例如，這 可以通過從潛在植物-內(nèi)生菌組合的組織分離總DNA，接著PCR，或可選地，Southern印跡、 western印跡或本領(lǐng)域已知的其他方法，來檢測與本發(fā)明的真菌內(nèi)生菌菌株的存在相關(guān)的 特定核酸或氨基酸序列存在來完成?；蛘?，可以利用生化方法，如ELISA、HPLC、TLC或真菌代 謝物分析，來測定作物組織的給定樣品中本發(fā)明的內(nèi)生菌菌株的存在。另外，用于鑒定的方 法可以包括顯微分析，如根染色，或培養(yǎng)方法，如出芽測試或本領(lǐng)域已知的其他方法 (Deshmukh等，2006)。在特定的實施方案中，可以用真菌特異性染料，如WGA-A1 exa 488，將 潛在的草本植物-內(nèi)生菌組合的根染色，并且通過顯微鏡分析來確定真菌根共生(fungal root associate)。
[0069] 在特定實施方案中，農(nóng)藝學(xué)質(zhì)量可以選自：增加的生物量、增加的分蘗、增大的根 群、提高的開花、提高的種子產(chǎn)量和增強(qiáng)的對生物和/或非生物脅迫的抗性，將這些品質(zhì)中 的每一種與在相同條件下生長且區(qū)別僅在于真菌內(nèi)生菌的存在或不存在的其他方面相同 的植物相比進(jìn)行分級。本發(fā)明的合成組合和方法可應(yīng)用于應(yīng)答實際或預(yù)期的脅迫。這樣的 脅迫可以包括，例如，干旱(缺水）、寒冷、熱脅迫、營養(yǎng)缺乏、鹽毒性、鋁毒性、食草動物的放 牧、蟲害、線蟲侵染及真菌感染、細(xì)菌感染和病毒感染等。
[0070] 在一個實施方案中，本公開提供了選自表1中那些的真菌內(nèi)生菌，其負(fù)面地影響以 地上葉為食的草食昆蟲(棉蚜蟲，棉蚜)和攻擊地下根的植物寄生線蟲(根結(jié)線蟲，南方根結(jié) 線蟲)繁殖。此外，在使用這些內(nèi)生菌處理種子的田間試驗中，相對于未定殖的對照植物，可 以在定殖植物中觀察到提高的植物性能和產(chǎn)量。例如，使用球毛殼菌作為溫室試驗中的內(nèi) 生菌，在棉花中證明了植物生長增強(qiáng)和提高的根結(jié)線蟲抗性。此外并且作為進(jìn)一步的非限 制說明性實例，使用球孢白僵菌作為棉花中的內(nèi)生菌，在溫室和田間試驗中證明了昆蟲(棉 蚜)繁殖的降低。淡紫擬青霉和球孢白僵菌的內(nèi)生菌存在也對攻擊棉花的發(fā)育花和果實的 關(guān)鍵刺吸式害蟲(豆莢草盲蝽(Lygus hesperus)和稻綠蝽)的宿主選擇行為具有負(fù)面作用。 此外，在使用球孢白僵菌作為棉花中的內(nèi)生菌的田間試驗中，證明了內(nèi)生菌定殖植物相對 于未定殖的對照植物的植物性能和較高產(chǎn)量的正向作用。
[0071] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法檢測植物之間的代謝組學(xué)差異。例如，基本上可以按 照Fiehn等（2000)Nature Biotechnol·，18，1157-1161或Roessner等（2001)Plant Cell， 13，11 -29中所述的來分析來自內(nèi)生菌共生的和參照農(nóng)業(yè)植物的生物樣品（完整組織、滲出 液、韌皮部汁液、木質(zhì)部汁液、根滲出液等）。這樣的代謝組學(xué)方法可以用于檢測激素水平、 營養(yǎng)素、次級代謝產(chǎn)物、根滲出液、韌皮部汁液含量、木質(zhì)部汁液含量、重金屬含量等的差 異。
[0072] 在另一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)想用多種內(nèi)生菌涂覆植物種子的方法，以及在種 子上和/或中包含多種內(nèi)生菌的種子組合物。根據(jù)這個實施方案的方法可以以與本文中用 于單一內(nèi)生菌涂覆的那些相似的方式來進(jìn)行。在一個實例中，可以在涂覆到種子上的單一 制備物中制備多種內(nèi)生菌。內(nèi)生菌可以來自共同來源（即，同一植物）?；蛘?，內(nèi)生菌可以來 自不同植物。
[0073] 在將多種內(nèi)生菌涂覆于種子上的情況中，任一種或全部內(nèi)生菌可能能夠賦予宿主 植物有益性狀。在一些情況中，所有內(nèi)生菌能夠賦予宿主植物有益性狀。每種內(nèi)生菌賦予的 性狀可以相同（例如，都改善宿主植物對特定生物脅迫的耐受性），或可以顯著不同（例如， 一種提高宿主植物對干旱的耐受性，而另一種提高磷酸鹽利用）。在其他情況中，賦予的性 狀可以是內(nèi)生菌之間相互作用的結(jié)果。
[0074]
[0075] 在本文中的描述和表格中，使用了多種術(shù)語。為了提供說明書和權(quán)利要求中的清 晰和一致的理解，提供了以下定義。除非另外指出，術(shù)語根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的常 規(guī)使用來理解。
[0076] 當(dāng)以單數(shù)提供術(shù)語時，發(fā)明人還考慮了通過該術(shù)語的復(fù)數(shù)描述的本發(fā)明的方面。 單數(shù)形式"一(a)"、"一個(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另外明確指出另外的 情況。例如，術(shù)語"一個細(xì)胞"包括一個或多個細(xì)胞，包括其混合物。
[0077] 術(shù)語"包含"用來表示組合物和方法包括所述要素，但不排除其他的。"基本上 由……組成"用于定義組合物和方法時，應(yīng)當(dāng)表示排除對組合物具有任何實質(zhì)重要性的其 他要素。因此，基本上由本文中限定的要素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的 微量污染物和農(nóng)業(yè)上可接受的載體。"由……組成"應(yīng)當(dāng)表示排除超過微量的其他成分的要 素和用于施用本發(fā)明組合物的實質(zhì)性方法步驟。由這些過渡術(shù)語中的每一個限定的實施方 案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0078] 生物學(xué)控制：如本文中使用的，術(shù)語"生物學(xué)控制（biological control)"及其縮 寫"生物控制(biocontrol)"定義為通過使用至少一種內(nèi)生菌對害蟲、病原體或者昆蟲或任 何其他不需要的生物體的控制。
[0079] "組合物"旨在表示活性劑和至少另一種化合物、載體或組合物、惰性(例如，可檢 測試劑或標(biāo)記或液體載體)或活性物質(zhì)(如殺蟲劑)的組合。
[0080] 如本文中使用的，"農(nóng)業(yè)種子"是用于農(nóng)業(yè)中生長植物的種子（"農(nóng)業(yè)植物"）。種子 可以是單子葉植物或雙子葉植物，并且為了農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)而種植，所述農(nóng)業(yè)產(chǎn)品例如籽 粒、食物、纖維等。如本文中使用的，農(nóng)業(yè)種子是為了種植準(zhǔn)備的種子，例如，在農(nóng)田中用于 生長。將農(nóng)業(yè)種子區(qū)別于商品種子在于農(nóng)業(yè)種子不是用于生產(chǎn)產(chǎn)品，例如，商業(yè)植物產(chǎn)品。
[0081] 如本文中使用的，"商業(yè)植物產(chǎn)品"是指由源自本發(fā)明的植物、種子、植物細(xì)胞或植 物部分的材料組成的任何組合物或產(chǎn)品。商業(yè)植物產(chǎn)品可以銷售給消費者并且可以是能夠 存活的或非存活的。非存活的商業(yè)產(chǎn)品包括但不限于非存活的種子和籽粒:加工的種子、種 子部分和植物部分;脫水植物組織、冷凍植物組織和加工的植物組織;加工為陸地和/或水 生動物食用的動物飼料的種子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、纖維以及用于人或 動物食用的任何其他食物；以及生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品。源自本發(fā)明植物的任何這樣的商品植 物產(chǎn)品可以含有至少可檢測量的特定和獨特的對應(yīng)于本文中所述內(nèi)生菌的DNA?？梢允褂?用于多核苷酸分子的任何標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，包括本文中公開的檢測方法。
[0082]如本文中使用的，短語"農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物"是指具有適應(yīng)于商業(yè)栽培的表型的基因 型或栽培品種。農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物包含的性狀可以包括生物量、碳水化合物和/或種子產(chǎn)量； 生物或非生物脅迫抗性，包括抗旱性、昆蟲抗性、真菌抗性、病毒抗性、細(xì)菌抗性、耐寒性和 耐鹽性;提高的直立性(standability)、增強(qiáng)的營養(yǎng)利用效率和降低的木質(zhì)素含量。
[0083]在特定實施方案中，棉花農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物包括，例如，已知的棉花品種AM 1550B2RF、NG 1511B2RF、NG 1511B2RF、FM 1845LLB2、FM 1944GLB2、FM 1740B2F、PHY 499WRF、PHY 375WRF、PHY 367WRF、PHY 339WRF、PHY 575WRF、DP 1252B2RF、DP 1050B2RF、DP 1137B2RF、DP 1048B2RF和/或DP 1137B2RF。
[0084] 如本文中使用的，短語"培養(yǎng)濾液"是指從接種了真菌菌株并使其生長的培養(yǎng)物獲 得的培養(yǎng)液或培養(yǎng)基。通常將培養(yǎng)基過濾以除去任何懸浮的細(xì)胞，留下營養(yǎng)素、激素或其他 化學(xué)物質(zhì)。
[0085] 如本文中使用的，術(shù)語"內(nèi)生菌"是指能夠在植物或植物組織內(nèi)生活的生物體。內(nèi) 生菌可以包含可以對其宿主植物的產(chǎn)量、生物量、抗性或健康度提高的真菌生物體。真菌內(nèi) 生菌可以占據(jù)植物組織(包括葉、莖、花和根)的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外間隙。
[0086] 短語"害蟲抗性"是指抑制或降低來自害蟲的攻擊。害蟲抗性提供高于植物已經(jīng)具 有的害蟲抗性的至少一些提高。
[0087] 如本文中使用的，術(shù)語"基因型"是指細(xì)胞或生物體的遺傳組成。
[0088] 如本文中使用的，術(shù)語"表型"是指細(xì)胞或生物體的可檢測特征，所述特征是基因 表達(dá)的直接或間接表現(xiàn)。
[0089] 如本文中使用的，短語"宿主植物"是指真菌內(nèi)生菌定殖的任何植物。在特定實施 方案中，宿主植物包括定殖植物的后代。
[0090]如本文中使用的，短語"提高的產(chǎn)量"是指生物量或種子重量、種子或果實大小、每 株植物的種子數(shù)量、每單位面積的種子數(shù)量、每英畝的蒲式耳數(shù)、每英畝的噸數(shù)、每公頃的 公斤數(shù)、碳水化合物產(chǎn)量或棉花產(chǎn)量的提高。這種提高的產(chǎn)量是相對于沒有接種內(nèi)生菌的 植物或作物。在特定實施方案中，產(chǎn)量提高是相對于其他常用的害蟲處理或解決生物或非 生物脅迫的其他方法。
[0091] 如本文中使用的，短語"生物量"是指一種植物組織、多種植物組織、整個植物或植 物群體在給定時間時的總質(zhì)量或重量(鮮重或干重），通常以重量/單位面積給出。該術(shù)語還 可以指群落中的所有植物或物種(群落生物量）。
[0092] 如本文中使用的，"粘著劑"是指增強(qiáng)孢子與種子表面結(jié)合的化合物。此類化合物 的非限制性實例是海藻酸、卡拉膠、糊精、葡聚糖、pelgel、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基 纖維素、聚乙烯醇或明膠。
[0093] 如本文中使用的，"農(nóng)業(yè)上可接受的"賦形劑或載體是適用于農(nóng)業(yè)中而沒有對植 物、環(huán)境或?qū)κ秤脧钠溲苌玫降霓r(nóng)業(yè)產(chǎn)品的人或動物的過度不良副作用且具有相稱的合 理收益/風(fēng)險比的賦形劑或載體。
[0094]如本文中使用的，術(shù)語"合成的"或短語"合成組合"是指包括作為或?qū)е滤拗髦参?和內(nèi)生菌的真菌內(nèi)生菌-宿主關(guān)系（也稱為"symbiotum"）的內(nèi)生菌的菌絲體和/或孢子的人 工組合。例如，可以通過用內(nèi)生菌人工接種、施用于或其他方式感染宿主植物、宿主植物種 子或宿主植物組織來獲得合成組合。此外，可以通過接種植物的土壤或生長培養(yǎng)基來獲得 宿主植物和內(nèi)生菌的組合。
[0095] 在一個實施方案中，本發(fā)明考慮了"分離的"微生物的用途。如本文中使用的，分離 的微生物是從其天然環(huán)境分離的微生物，且隨之推斷分離通過人工操作進(jìn)行。分離的微生 物是已經(jīng)從至少一些之前與其結(jié)合的組分(不管是在自然界或在實驗環(huán)境中）分離出來的 微生物。
[0096] 如本文中使用的，如果植物或一部分植物含有微生物，例如，在不存在任何與微生 物制備物的接觸的情況下，認(rèn)為微生物對于植物或一部分植物是"天然的"，并且稱為"天然 地"存在于植物或一部分植物中。
[0097] 本文中所述的一些方法允許植物種子被微生物定殖。如本文中使用的，當(dāng)微生物 可以與植物在植物環(huán)境中以共生或無害關(guān)系存在時，例如，存在于植物上和/或植物內(nèi)部 (包括種子)時，則稱微生物"定殖于"植物或種子。
[0098] 如本文中使用的，植物"群體"是指從覆蓋了本文中所述的內(nèi)生菌的種子生長的多 株植物，或是經(jīng)歷接種方法的植物或植物組的后代的多株植物。群體內(nèi)的植物通常是相同 的物種，并且通常還分享共同的遺傳起源。
[0099] 實施例
[0100] 實施例1:形成孢子懸浮液和種子的處理
[0101]植物和真菌內(nèi)生菌菌株的培養(yǎng)：特定實施方案中使用的棉花種子品種是品種 LA122(可獲自All-Tex Seed，Inc.，Levelland，TX 79336)。按照所述的，從棉花植物獲得淡 紫擬青霉和球毛殼菌（Ek-Ramos 等，2013，PL〇S ONE 8(6):e66049.doi:10.1371/ journal. pone. 0066049)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過進(jìn)行其中所述的程序獲得適用于進(jìn)行 本發(fā)明各種不同實施方案的內(nèi)生菌。簡而言之，將植物樣品在自來水中沖洗，并通過浸沒在 70%乙醇中5min，10%漂白溶液中3min并用高壓滅菌的蒸餾水沖洗兩次將表面滅菌。使用 高壓滅菌的紙巾將樣品吸干。隨機(jī)選擇五個單獨的表面滅菌的葉子、棉蕾和棉鈴(N=15個 總樣品）并壓印在新鮮馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和V8培養(yǎng)基上作為監(jiān)控表面滅菌效率的方 式。對于內(nèi)生菌分離，將葉子切成大約lcm 2的小段。棉蕾和棉鈴切成六片。除去任何存在的 纖維并切成六個較小的段。將葉段顛倒放置在PDA和V8培養(yǎng)板上，一式三份。每個平板含有3 個葉段，每個植物總共分析9段。對于在季中早期采收的棉蕾，將每個棉蕾的3片放置在Η)Α 和V8培養(yǎng)基上，與葉段相同。由于在植物內(nèi)的大小和位置的相似性，在季中晚期收集時，將 來自給定植物的棉蕾和棉鈴一起放置在含有兩個棉蕾片、兩個棉鈴片和兩個纖維段的皮氏 培養(yǎng)皿中。將抗生素青霉素6(100單位/1^)和鏈霉素（10(^/111〇(3丨8111 &，3七1^11丨8，10，1^) 加入培養(yǎng)基中以抑制細(xì)菌生長。所有平板在黑暗中在室溫下平均孵育兩周，直至檢測到從 植物組織生長出真菌內(nèi)生菌菌絲。
[0102]使用形態(tài)學(xué)和分子真菌內(nèi)生菌鑒定的包括性組合用于鑒定。一旦檢測到從植物材 料生長出真菌菌絲，取樣以獲得純的真菌分離物。對于通過PCR的鑒定，從每個分離的真菌 菌株的菌絲體按照氯仿:異戊醇24:1方案提取基因組DNA，并使用真菌特異性引物來擴(kuò)增核 核糖體DNA的ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔）區(qū)。該區(qū)域是用于真菌的主要條形碼標(biāo)志物，并包括ITS1和 ITS2區(qū)，其由5.8S核糖體基因分隔開。為了避免在PCR過程中引入偏差(分類偏差和錯配的 引入），已經(jīng)提出只擴(kuò)增ITS1區(qū)，因此將引物ITS1(5'TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3'）（SEQ ID N0:5)和ITS2(5'GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3'）（SEQ ID N0:6)用于擴(kuò)增并將分離 的真菌菌株每一個的~240bp ITS1區(qū)測序。將所得到的序列作為查詢序列與公眾可利用的 數(shù)據(jù)庫GenBank核苷酸、UNITE和PlutoF進(jìn)行比對。后兩個數(shù)據(jù)庫是專門匯編的并用于真菌 鑒定。表1提供了本發(fā)明中鑒定的并有用的內(nèi)生菌列表。所有這些內(nèi)生菌屬于子囊菌門，盤 菌亞門（除了Phanerochaete crassa，其屬于擔(dān)子菌門，傘菌亞門；以及Pseudozyma sp.，其 屬于擔(dān)子菌門，黑粉菌亞門）。表1顯示了分離的真菌菌株每一個的種/屬、科、目、亞綱、綱以 及對應(yīng)于~240bp ITS1區(qū)的SEQ DI NO(除了球孢白僵菌、寄生曲霉、蠟蚧輪枝菌和淡紫擬 青霉），其中所示的序列包括ITS1、ITS2、5.8S、18S和28S序列并且獲自UNITE數(shù)據(jù)庫， GenBank 編號分別為 JF837090、JX857815、FJ643076 和 EU553283。
[0103]表1:本發(fā)明中鑒定的并有用的內(nèi)生菌
[0106]
[0107] 表1.內(nèi)生菌列表
[0108] 交互枝頂孢、互隔鏈格孢、蕓苔鏈格孢、密實鏈格孢、香石竹鏈格孢、長柄鏈格孢、 蘋果鏈格孢、芝麻鏈格孢、茄鏈格孢、鏈格孢屬、極細(xì)鏈格孢、子囊菌門、穗狀平臍蠕孢、變灰 尾孢、辣椒尾孢、菊池尾孢、百日草尾孢、球毛殼菌、Chaetomium piluliferum、毛殼菌屬、芽 枝狀枝孢、枝孢屬、夏孢生枝孢、旋孢腔菌屬、Phanerochaete crassa，Phoma americana， Phoma subherbarum,楓香擬莖點霉、擬莖點霉屬、格孢腔菌屬、格孢腔菌科、多孔菌目、 Preussia africana、光黑殼屬、Pseudozyma sp.、圓核腔菌、辣椒炭疽菌、Coniolariella gamsi i，油桐盾殼霉、盾殼霉屬、多主棒孢霉、間座殼屬、蕉孢殼屬、Drechslerella dactyloides、Embellisia indefessa、黑附球菌、附球菌屬、卩彖狀明臍菌、厚孢鐮刀菌、鐮刀 菌屬、Gibellulopsis nigrescens、Gnomoniopsis sp.、Lewia infectoria、咖啡球腔菌、球 腔菌科、稻黑孢菌、黑孢菌屬、球孢黑孢霉、擬青霉屬、桔青霉、Retroconis sp.、根盤菌屬、 Schizothecium inaequale、殼多抱屬、Stemphylium lancipes、Thielavia hyrcaniae、梭 孢殼屬、Ulocladium chart arum、輪枝孢屬、球孢白僵菌、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)、錯蟻輪枝菌、淡紫擬青霉。
[0109] 從商業(yè)獲得的菌株(可從Botanigard獲得)培養(yǎng)球孢白僵菌。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)球孢白僵菌、淡紫擬青霉和球毛殼菌。通過將10ml無菌水加入真菌平板 中并用無菌解剖刀刮削而無瓊脂，從而制得每種真菌的孢子濃縮原液。然后利用粗濾布將 得到的菌絲體和獲得的孢子過濾至無菌燒杯中以濾掉菌絲體，由此形成原液。使用血球計 來測量和計算原液的孢子濃度。通過稀釋形成所需的濃度，并且將種子放入具有所需孢子 濃度的孢子懸浮液中。在各種不同的實施方案中，最終處理濃度可以為約1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、 106、10 7、108或109個孢子/ml，這可以通過在無菌水中或在合適的溶液或緩沖液中連續(xù)稀釋 來獲得。
[0110] 為了種子接種，在具有所需濃度的孢子懸浮液中浸泡之前，通過持續(xù)振蕩下將種 子浸沒在70 %乙醇中3分鐘，接著在2 %Na0Cl中孵育3分鐘，將種子表面滅菌;接著在無菌水 中洗滌三次。將第三次無菌水洗液放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上以證實表面滅 菌是有效的。然后將種子在含有孢子懸浮液的燒杯中浸泡24小時，所述孢子懸浮液具有兩 個不同的真菌濃度。對照組種子只用無菌水處理。球孢白僵菌的孢子濃度為零(對照）、1X 106(處理1)和1 X 109(處理2)，而對于淡紫擬青霉或球毛殼菌為零(對照）、1 X 106(處理1)和 1 X 107(處理2)。將這些燒杯在培養(yǎng)室中在32 °C下孵育24小時，直至第二天用于種植 (24hr) 〇
[0111] 將浸泡的種子在L22混合土壤(Borlaug Institute，Texas A&M)中種植。所有植物 在~28°C下在實驗室溫室中使用天然光照周期生長。植物沒有施肥，并且按照需要在所有 處理中一致地進(jìn)行灌溉。
[0112] 直接種子接種:在特定實施方案中，在用土壤覆蓋種子之前，可以在種植時用孢子 溶液（102-103、10 3-104、104-105、106-10 7或107-108個孢子/ml)直接接種單個種子和周圍的 土壤。
[0113] 在各種不同的實施方案中，可以使用適用于將生物制劑施用于種子或植物并且是 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何種子或植物處理。
[0114] 實施例2:作為干粉組合物來施用內(nèi)生菌孢子
[0115] 除了使用孢子溶液用于種子處理外，還可以作為干粉或使用粘著劑（如甲基纖維 素）來施用內(nèi)生菌或內(nèi)生菌孢子用于種子處理。在特定實施方案中，濃度可以為至少1〇 5、 106、107、108、109或更高的菌落形成單位或孢子/g干重。
[0116] 在特定實施方案中，內(nèi)生菌可以在發(fā)酵罐中的真菌培養(yǎng)基中生長?？梢允占?、干燥 和研磨內(nèi)生菌絲體片段或孢子。還可以將粘著劑(如羧甲基纖維素)加入研磨過的內(nèi)生菌材 料中。
[0117] 在特定實施方案中，內(nèi)生菌材料和粘著劑之間的重量比可以為1:10-50、1:50-100、1:100-500或1: 500-1000以獲得種子包衣或種子接種材料。這種種子接種材料可以施 用于種子。在各種不同的實施方案中，種子接種材料和種子之間的重量比可以為1:10-50、 1:50-100、1:100-500、1:500-1000或1:1000-5000。
[0118] 實施例3:土壤(犁溝中）內(nèi)生菌處理
[0119] 可以通過在種植過程中將內(nèi)生菌組合物施用于土壤和/或種子表面來進(jìn)行土壤澆 灌(犁溝中）應(yīng)用。在特定實施方案中，內(nèi)生菌組合物可以包括內(nèi)生菌懸浮液或內(nèi)生菌干粉 制劑。在各種不同的實施方案中，內(nèi)生菌可以包括菌絲體和/或孢子。在特定的實施方案中， 土壤澆灌應(yīng)用可以包括將內(nèi)生菌組合物直接施用于直接在每粒種子上的土壤表面。在特定 實施方案中，內(nèi)生菌組合物可以包括0.01-0.1、〇. 1-1或l-10ml內(nèi)生菌懸浮液，其可以是內(nèi) 生菌孢子懸浮液。
[0120] 土壤接種:在特定實施方案中，可以將種子種植于接過的土壤中。可以通過在真菌 生長培養(yǎng)基中繁殖內(nèi)生菌來獲得接種物。真菌生長培養(yǎng)基可以是馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)。在其他實施方案中，真菌生長培養(yǎng)基可以為小麥籽粒。在非限制性實例中，可以將 l〇〇g小麥籽粒洗滌并在無菌水中浸泡過夜?？梢耘懦鲞^量的水，將種子在紙巾上吸干，包裝 在500ml錐形燒瓶中，并在15psi下高壓滅菌lh。可以將一毫升真菌內(nèi)生菌孢子懸浮液（10 7 孢子/ml)接種至燒瓶中，并且培養(yǎng)物可以在25°C下孵育2周。為了避免結(jié)塊，可以將燒瓶強(qiáng) 烈振蕩以分開籽粒并破壞菌絲叢。在種植時，或以將大約5g接種物放入土壤中。在特定實施 方案中，接種物可以在種植種子的同時或1個月內(nèi)放入土壤中。在特定實施方案中，種子可 以包括滅菌的種子。
[0121] 實施例4:葉的內(nèi)生菌處理
[0122] 在第三真葉階段使用手持塑料噴霧器(1L)，通過給完全張開的葉面噴灑孢子懸浮 液(1〇8孢子/ml)至流出，經(jīng)葉面施用來給植物接種。在特定實施方案中，內(nèi)生菌孢子懸浮液 在水中制得。在特定實施方案中，給水補(bǔ)充去污劑。在特定的非限制性實例中，孢子懸浮液 含有0.02 % Triton X100作為去污劑。
[0123] 可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適方法來進(jìn)行葉的內(nèi)生菌處理。特別 地，可以使用噴霧器，通過給葉子直接噴灑內(nèi)生菌懸浮液來進(jìn)行葉的內(nèi)生菌處理，所述內(nèi)生 菌懸浮液可以是內(nèi)生菌孢子懸浮液。
[0124] 圖9證明了田間的棉花葉面施用昆蟲病原性真菌內(nèi)生菌的孢子提高了植物性能。 用各種典型的殺真菌劑（甲霜靈、三唑醇、三氟敏、2-(thiocyanome_thylthio)苯并噻唑）和 殺蟲劑(硫雙威、吡蟲啉、陶斯松)處理棉花（品種FM1740B2F)種子，并且在田間條件下種植 和生長處理種子。在第5真葉階段，給植物噴灑球孢白僵菌和煙色擬青霉的水溶液。包括蔗 糖（l%wt/ V〇l)作為用于真菌的另外營養(yǎng)源。在噴灑了不含蔗糖的球孢白僵菌和加蔗糖的 煙色擬青霉的植物中觀察到了明顯較高的第一位置棉鈴(發(fā)育果)保持。
[0125] 實施例5:植物內(nèi)生菌定殖的驗證
[0126] 將植物單獨種植在塑料袋中，其用植物編號、處理和最終蚜蟲數(shù)標(biāo)記，并儲存在4 °(：下直至第二天用于內(nèi)生菌驗證。每株植物的一半用于平鋪在roA瓊脂上，而另一半冷凍干 燥用于進(jìn)行內(nèi)生菌驗證的診斷性PCR試驗。按照以上所述的，進(jìn)行表面滅菌實驗方案以及將 第三次無菌水洗液平鋪在PDA上以測試表面污染。對于診斷性PCR試驗，將植物組織冷凍干 燥，并利用CTAB實驗方案(Doyle&Doyle，1987，Phytochemistry Bulletin 19:11-15)提取 DNA。合成的寡核苷酸引物序列是基于對應(yīng)于分離的實驗室培養(yǎng)物序列結(jié)果的NCBI BLAST 檢索（Ek-Ramos等，2013 )。用于球孢白僵菌的正義和反義寡核苷酸序列分別為：5'_ CGGCGGACTCGCCCCAGCCCG-3'（SEQ ID N0:1)和S'^CCGCGTCGGGGTTCCGGTGCG-SYSEQ ID N0: 2)。用于擴(kuò)增淡紫擬青霉的寡核苷酸為：5'CTCAGTTGCCTCGGCGGGAA 3'（SEQ ID N0:3)和5' GTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCG 3'（SEQ ID N0:4)。
[0127] PCR實驗方案由95°C下5min的退火步驟，接著56°C下2min的寡核苷酸比對和72°C 下7min的延伸步驟組成，總共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在含有1%溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中可 視化。在70伏特下進(jìn)行電泳30min。
[0128] 實施例6:真菌內(nèi)生菌可以在田間維持
[0129] 在夏季使用淡紫擬青霉和球孢白僵菌的分離物進(jìn)行田間試驗。五個重復(fù)地塊的隨 機(jī)塊設(shè)計種植了通過在三個不同的候選內(nèi)生菌(如淡紫擬青霉或球孢白僵菌)孢子濃度(〇、 10 6或108孢子/ml)的溶液水中浸泡9hr接種的種子。每地塊由四個15.24m(40ft)的行組成， 每行隔開 101.6cm(40in) 〇
[0130] 定殖效率:在第一真葉階段，針對每個處理的總共20株植物，將來自每地塊的四個 植物隨機(jī)取樣并測試每種候選內(nèi)生菌的定殖。通過在PDA培養(yǎng)基上孵育表面滅菌的根、莖和 葉片段并觀察真菌生長來測定定殖頻率。作為每個處理組具有至少一個陽性定殖植物片段 的植物數(shù)來記錄定殖頻率。
[0131]秧苗的淡紫擬青霉或球孢白僵菌的高內(nèi)生菌定殖頻率證明了在田間種植條件下 可以操縱特定內(nèi)生菌的存在(圖1)。
[0132] 實施例7:棉花蚜蟲繁殖測試
[0133] 將棉蚜群體在保持在大約28 °C下的天然光照周期的溫室中在籠子中的棉花上飼 養(yǎng)。將第二齡期蛹直接放置在內(nèi)生菌處理的棉花植物和對照植物上。每個處理組使用十株 植物，并且每株植物放置十只蚜蟲。植物接種蚜蟲后，將植物放置在單個塑料45 X 20cm杯 中，并用ηο-see-um網(wǎng)(Eastex products，NJ)密封以避免姐蟲在植物間移動。在一個實施方 案中，使用的植物為13天大，大致在第一真葉階段，并且使蚜蟲在溫室條件下繁殖七天。在 另一個實施方案中，使蚜蟲在實驗開始時在最初20天大的植物(大致第三真葉階段)上繁殖 14天。在每個實施方案結(jié)束時，將每株單獨的植物的蚜蟲數(shù)計數(shù)并記錄。與未處理的對照植 物相比，球孢白僵菌或淡紫擬青霉作為棉花中的內(nèi)生菌的存在顯著降低了內(nèi)生菌處理的植 物上的棉花蚜蟲的繁殖(圖4A、4B和圖5)。
[0134] 實施例8:真菌內(nèi)生菌降低線蟲繁殖
[0135] 植物在環(huán)境室中從處理的種子和未處理的對照種子萌發(fā)，然后在種植后11天移栽 至罐中的土壤中。對每個處理兩株重復(fù)秧苗取樣以通過表面滅菌和平鋪在PDA瓊脂上來檢 查內(nèi)生菌定殖效率。在移栽后第六天，線蟲處理組秧苗用2，000或10，000卵/植物進(jìn)行處理。 線蟲接種后6周，采收植物并處理。將針對每株植物的蟲癭數(shù)/克根組織和群體中總卵數(shù)定 量以比較內(nèi)生菌處理的和未處理的(對照)植物之間的線蟲性能。
[0136] 圖2和3證明了作為內(nèi)生菌存在于棉花中時，真菌內(nèi)生菌淡紫擬青霉和球毛殼菌負(fù) 面地影響根結(jié)線蟲(南方根結(jié)線蟲)繁殖。在高線蟲接種物水平（1〇,〇〇〇個卵）下，用含有1〇 6 或107孢子/ml的溶液處理種子后，與未處理的對照種子相比，淡紫擬青霉降低了植物中的 卵產(chǎn)生。在田間接種物水平(2000個卵）下，淡紫擬青霉的存在顯著降低了兩個種子處理濃 度下的蟲癭和卵產(chǎn)生。內(nèi)生菌球毛殼菌負(fù)面地影響了根結(jié)線蟲繁殖。在〇(未處理的對照）、 10 6和108孢子/ml的溶液中的棉花種子浸泡處理后，證明了內(nèi)生菌球毛殼菌對根結(jié)線蟲蟲癭 形成和卵產(chǎn)生的負(fù)面作用。
[0137] 實施例9:真菌內(nèi)生菌對昆蟲的作用
[0138] 從非轉(zhuǎn)基因的棉花種子（陸地棉（Gossypium hirsutum))(品種LA122，AllTex Seed Co.)生長內(nèi)生菌處理的植物和對照植物。將種子在含有所利用真菌的108孢子/ml溶 液加無菌水-只作為對照的燒杯中浸泡24小時。將燒杯置于32°C培養(yǎng)室中過夜(大約9h)直 至第二天種植。將植物在溫室和田間條件下生長。溫室植物首先在秧苗盤中發(fā)芽，然后轉(zhuǎn)移 至30cm罐中。田間生長的植物同時種植和生長。
[0139] 行為分析:進(jìn)行無選擇和選擇行為分析來比較西部牧草盲蝽(豆莢草盲蝽)和綠椿 象(稻綠蝽)對來自內(nèi)生菌處理的和未處理的植物的棉蕾和棉鈴的反應(yīng)。分析在l〇cm直徑皮 氏培養(yǎng)皿中在30°C下進(jìn)行，在底部上使用2%瓊脂的薄層以在觀察過程中對給予昆蟲的實 驗植物的棉蕾(豆莢草盲蝽分析)和棉鈴(稻綠蝽分析)提供水分。對于無選擇分析，將單個 棉蕾或棉鈴?fù)ㄟ^基部插入培養(yǎng)皿中心的瓊脂中。每個培養(yǎng)皿中放置單只年輕成年(蛻皮后 1-7天）昆蟲，并蓋上蓋子。在每個試驗中觀察總共30只昆蟲，在球孢白僵菌、淡紫擬青霉和 對照處理組中各自N=10只昆蟲。豆莢草盲蝽無選擇試驗重復(fù)四次(N = 40/處理），除了一個 試驗外，在所有試驗中使用了來自溫室生長植物的棉蕾。稻綠蝽無選擇試驗重復(fù)三次(N = 20/處理），在一個試驗中使用了來自溫室生長植物的棉鈴。
[0140] 在相似條件下，使用相同場地進(jìn)行選擇測試，但在皮氏培養(yǎng)皿中心隔開4cm放置兩 個相等大小的棉蕾(豆莢草盲蝽)或棉鈴(稻綠蝽）。每個場地的兩個棉蕾或棉鈴來自未處理 的對照植物和球孢白僵菌或淡紫擬青霉處理的植物。在每個試驗中觀察總共20只昆蟲，在 球孢白僵菌vs.對照和淡紫擬青霉vs.對照處理組中，各自N=10。豆莢草盲蝽和稻綠蝽選擇 試驗都是重復(fù)兩次(N=20/處理），在所有試驗中使用來自田間生長植物的棉蕾。
[0141]對于無選擇和選擇分析兩者使用點取樣程序，每個試驗觀察昆蟲6小時。初步觀察 表明兩個種的昆蟲在分析開始時更活躍，因此采用分段取樣安排，在試驗早期(0-60min)以 5分鐘間隔，中期(61-180min)以15分鐘間隔和試驗后期（181-360min)以30分鐘間隔來記錄 觀察。在每個取樣間隔，昆蟲記錄為離開棉蕾/棉鈴或在棉蕾/棉鈴上進(jìn)食或棲息。
[0142] 數(shù)據(jù)分析:在無選擇分析中，使用Wilcoxon Signed Ranks檢驗在試驗持續(xù)過程中 的每個觀察點比較處理組之間觀察到的棉花棉蕾（豆莢草盲蝽)或棉鈴(稻綠蝽)上進(jìn)食或 棲息的昆蟲比例。為了測試隨時間的反應(yīng)變化，針對分析的早期（0_60min)、中期（61-180min)和后期（181-360min)對于各個體計算進(jìn)食或在植物樣品上的觀察的比例，并且使 用重復(fù)測量的方差分析(AN0VA)以內(nèi)生菌處理組作為主因素和時間作為重復(fù)效應(yīng)在處理組 之間進(jìn)行比較。使用X2檢驗，將觀察到未能接觸內(nèi)生菌處理的植物的棉蕾或棉鈴的個體頻 率與基于對照組的預(yù)期未接觸的個體頻率進(jìn)行比較。在接觸棉蕾或棉鈴的昆蟲中，使用單 因素 AN0VA比較處理組間到第一次接觸的時間（潛伏期）。在SPSS 21(SPSS Inc.)中進(jìn)行了 包括方差的常正態(tài)性和齊性測試的所有分析。
[0143] 豆莢草盲蝽無選擇分析的結(jié)果:在分析持續(xù)期間，相對于來自球孢白僵菌或淡紫 擬青霉內(nèi)生菌處理組任一的那些，在來自未處理對照植物的棉蕾上隨著時間觀察到明顯較 高比例的豆莢草盲蝽個體接觸和進(jìn)食(Wilcoxon Signed Ranks檢驗，對于兩個比較，P〈 0.0001)(圖6A)。重復(fù)測量AN0VA表明明顯的時間效應(yīng)(F!, 116 = 86.175; P〈0.001)，隨著試驗 進(jìn)行，更高比例的昆蟲接觸棉蕾（圖6B)。還存在明顯的內(nèi)生菌處理效應(yīng)(F2, 116 = 4.929;P = 0.009)，沒有明顯的時間X內(nèi)生菌處理相互作用卬2,116=1.015;? = 0.366)。每個處理組中的 40只昆蟲中，12.5 %的對照組在分析過程中未能接觸棉蕾，而相應(yīng)明顯更高的35 %和 32.5%的球孢白僵菌和淡紫擬青霉處理組昆蟲未能接觸(X2檢驗，P〈0.0001)。在接觸棉蕾 的昆蟲中，在處理組中到第一次接觸的潛伏期存在顯著差異(F 2,85 = 7.2 2 5;P = 0.0001)，與 球孢白僵菌(posthoc LSD檢驗;P = 0.001)或淡紫擬青霉內(nèi)生菌處理組(posthoc LSD檢驗； P = 0.006)任一相比，對照組呈現(xiàn)出更短的接觸潛伏期（圖6A)。
[0144] 豆莢草盲蝽選擇分析的結(jié)果:在同時選擇測試中，與來自內(nèi)生菌處理植物的那些 相比，豆莢草盲蝽個體更常選擇來自未處理對照植物的棉蕾。在分析持續(xù)期間，反應(yīng)比例顯 著大于0.5,表明昆蟲相對于來自（A)球孢白僵菌(P〈0.0001 ;Wilcoxon Signed Ranks檢驗） 或(B)淡紫擬青霉(P〈0.0001;Wilcoxon Signed Ranks檢驗）內(nèi)生菌定殖植物的棉鈴（圖6B) 非隨機(jī)地選擇來自對照植物的棉鈴。
[0145] 稻綠蝽無選擇分析的結(jié)果:在分析持續(xù)期間，相對于來自球孢白僵菌或淡紫擬青 霉內(nèi)生菌處理組任一的那些，觀察到在來自未處理對照植物的棉鈴上接觸和進(jìn)食的稻綠蝽 個體的比例隨著時間明顯較高(Wilcoxon Signed Ranks檢驗，對于兩個比較，P〈0·0001) (圖7A)。重復(fù)測量AN0VA表明明顯的時間效應(yīng)(F!, 116 = 86.175; P〈0.001)，隨著分析進(jìn)行，更 高比例的昆蟲接觸棉蕾（圖1)。還存在明顯的內(nèi)生菌處理效應(yīng)(F2, 116 = 4.929;P = 0.009)，沒 有明顯的時間X內(nèi)生菌處理相互作用卬2,116=1.015;? = 0.366)。每個處理組中的40只昆蟲 中，12.5%的對照組在分析過程中未能接觸棉蕾，而相應(yīng)的明顯更高的35%和32.5%的球 孢白僵菌和淡紫擬青霉處理組昆蟲未能接觸(X2檢驗，P〈0.0001)。在接觸棉蕾的昆蟲中，在 處理組間到第一次接觸的潛伏期存在顯著差異(F 2,85 = 7.2 2 5 ;P = 0.0001)，與球孢白僵菌 (posthoc LSD檢驗;P = 0.001)或淡紫擬青霉內(nèi)生菌處理組(posthoc LSD檢驗;P = 0.006) 任一相比，對照組呈現(xiàn)出更短的接觸潛伏期（圖7B)。
[0146] 實施例10:內(nèi)生菌處理后保留更多棉鈴
[0147] 在田間試驗過程中，使用為棉花特意研發(fā)的植物作圖和信息系統(tǒng)來定量棉花物候 學(xué)和發(fā)育，以追蹤植物的果實發(fā)育和保持作為監(jiān)控植物發(fā)育和脅迫的方式（C0TMAN?， Cotton Inc.)。棉花脅迫的一種量度是分枝上第一結(jié)果位置中發(fā)育的花(棉蕾)和果實(棉 鈴)的保持。針對每個處理組，對五個重復(fù)地塊(N= 10株植物/地塊)中每一個的兩行中每行 5株植物測量第一位棉蕾和棉鈴。
[0148] 圖10證明了在生長季中早期隨著花開始發(fā)育，觀察到內(nèi)生菌處理植物中相對于對 照的較高棉蕾保持的趨勢。這種趨勢持續(xù)至季后期，如相對于未處理對照植物的內(nèi)生菌處 理組中明顯較高的棉鈴保持所證明的。
[0149] 圖8證明了田間試驗過程中棉鈴損害的降低。相對于對照植物，在通過將種子浸泡 在濃度為1〇6和1〇 8孢子/ml的球孢白僵菌和淡紫擬青霉的孢子溶液中處理的植物中，昆蟲相 關(guān)的棉鈴損害的水平較低。在田間條件下，真菌內(nèi)生菌對棉花植物性能具有正向作用。
[0150] 實施例11:內(nèi)生菌處理提高了產(chǎn)量
[0151]在使用內(nèi)生菌處理和處理植物的田間試驗結(jié)束時，地塊使用1-排摘棉機(jī)機(jī)械收 獲。令人驚訝地，收獲時的最終產(chǎn)量顯著高于預(yù)期的（比未處理對照高25%)。出乎預(yù)料的， 用淡紫擬青霉或球孢白僵菌的處理獲得高于未處理對照植物的產(chǎn)量，與最初的種子處理濃 度無關(guān)(圖11)。
[0152] 實施例12:高粱的內(nèi)生菌處理提高了GH中的生長
[0153] 在秧苗試驗中測試了所述微生物濃度對高粱的作用。如實施例1中針對棉花所述 的，使用乙醇和漂白劑將高粱雙色種子表面滅菌。將三個菌株(球孢白僵菌、煙色擬青霉和 淡紫擬青霉)制備成1〇 7分生孢子/ml的分生孢子懸浮液，并按照實施例1中所述的涂覆在高 粱種子上。將對照種子浸泡在無菌水中而非分生孢子懸浮液中。將種植的種子在恒定的生 長室條件下保持兩周，重復(fù)10個。在兩周結(jié)束時，從生長室取出植物，并測量植物高度和生 物量。圖12A顯示了相對于對照，施用所述微生物組合物時植物高度的提高(p〈0.05)。圖12B 顯示了相對于對照從用所述微生物組合物處理的種子生長的植物中植物生物量的提高(P〈 0.05)〇
[0154] 實施例13:真菌內(nèi)生菌的處理調(diào)節(jié)天然內(nèi)生菌的定殖頻率
[0155] 為了確定內(nèi)生菌種子處理是否可改變從種子生長的植物的微生物群系 (microbiome)，用淡紫擬青霉或球孢白僵菌的孢子懸浮液處理棉花種子。將植物在田間生 長作為在標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)實踐下種植和維持的田間試驗的部分。從表面滅菌的地上莖/葉和地下 根組織單獨地分開在PDA培養(yǎng)基上的真菌內(nèi)生菌，以評價微生物群落的變化。顯示于圖13中 的比較是相對于未處理對照植物的真菌內(nèi)生菌群落。結(jié)果表明這些處理可以改變天然真菌 內(nèi)生菌的定殖率。
[0156] 真菌內(nèi)生菌處理可以改變植物中天然存在的任何真菌內(nèi)生菌的定殖頻率。為了確 定通過真菌內(nèi)生菌處理種子可以影響哪些其他天然內(nèi)生菌，評估了從兩個商業(yè)棉花品種 CG3787B2RF和PHY499WRF的植物分離的棉花真菌內(nèi)生菌的特性。在Lubbock，Texas，USA附近 的品種試驗過程中獲得樣品，識別為Lubbock-RACE。在設(shè)計為田間空間變化對照的隨機(jī)化 塊中排列的多個重復(fù)地塊中從每個品種取樣的九株單獨植物的每一株收集一片單一健康 葉片。為了鑒定真菌內(nèi)生菌種，提取全基因組DNA并且使用ITS1F正向和ITS2反向通用融合 引物擴(kuò)增核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS)作為用于454焦磷酸測序的條碼。這個實驗中鑒定 的真菌內(nèi)生菌連同圖13中顯示的那些列于表2中。
[0157] 表2:可以通過用其他真菌內(nèi)生菌的種子處理改變的天然真菌內(nèi)生菌
[0158]
[0159]
[0160]
[0161] 實施例14:真菌內(nèi)生菌種子處理導(dǎo)致從種子生長的植物中植物激素水平的調(diào)節(jié)
[0162] 為了確定真菌內(nèi)生菌種子處理是否影響從種子生長的植物中的植物激素水平，從 接種了內(nèi)生菌球孢白僵菌或淡紫擬青霉的棉花植物的根或第三真葉收獲組織。使用三種內(nèi) 生菌處理(未定殖的對照、球孢白僵菌或淡紫擬青霉)并且對于球孢白僵菌，使用兩個食草 處理(無蚜蟲，或蚜蟲采食1、4、8、24或48小時)進(jìn)行了實驗。在葉和根組織中，通過LC-MS單 獨地測定脫落酸(ΑΒΑ)、塊莖酸（tuberonic acid) (12-OH-JA，JA-11 e的氧化產(chǎn)物）（TA)、抗 壞血酸(AA)、12-氧代植二烯酸(JA前體）（OPDA)、JA異亮氨酸(JA-11 e)和水楊酸(SA)的植物 激素水平。相對未定殖對照組中的植物，使用P〈〇.05的顯著性進(jìn)行了所述植物激素水平比 較。從使用球孢白僵菌處理的種子生長的植物中的激素水平顯示于表3中，而從使用淡紫擬 青霉處理的種子生長的植物中的激素水平顯示于表4中。
[0163] 表3.從使用球孢白僵菌處理的種子生長的植物中的激素水平
[0164]
[0165] 表4:從使用淡紫擬青霉處理的種子生長的植物中的激素水平
[0166]
[0167] 實施例15:真菌內(nèi)生菌種子處理改變了田間試驗中特定棉花栽培品種的性狀
[0168] 按照實施例6中所述的相似方式進(jìn)行了 2014年田間試驗。在夏季使用以下所列分 離物進(jìn)行田間試驗。每地塊由四個15.24m(40ft)行組成，每行隔開101.6cm(40in)，并且每 個處理6個重復(fù)地塊。相對于未處理對照地塊，比較來自用所述微生物組合物處理的地塊的 產(chǎn)量。對于薊馬，這種損害評價為0-5的等級，0 =無損害，1 =可見的進(jìn)食疤痕，但沒有萎縮， 2 =可見的進(jìn)食和25%萎縮，3 =具有變黑的葉端的進(jìn)食和50%萎縮，4 =嚴(yán)重進(jìn)食和75%萎 縮，以及5 =嚴(yán)重進(jìn)食和90%萎縮。對于盲蝽，作為每地塊的平均定量和記錄每株植物的昆 蟲數(shù)量。圖14顯示了分別對于Delta Pine和Phytogen栽培品種，用所述微生物組合物處理 時作物的產(chǎn)量提高。圖15顯示了兩個栽培品種中微生物的總計產(chǎn)量提高。條棒表示95%置 信區(qū)間。圖16A顯示了在Dealta Pine栽培品種中針對薊馬損害測試的15種微生物中12種的 有益效果。在Phytogen栽培品種中，測試的15種微生物組合物中只有2種顯示出降低薊馬損 害的益處。圖16B顯示了降低Phytogen栽培品種中盲蝽損害的有益效果，其中測試的15種兼 性真菌內(nèi)生菌中的6種顯示出與未處理對照植物相比盲蝽損害的平均降低。在Delta Pine 栽培品種中，只有一種微生物組合物顯示出對盲蝽損害的有益作用。
[0169] 在田間還評價了各種其他季中植物性狀以確定所述真菌內(nèi)生菌組合物的作用。圖 17A顯示了所述微生物組合物對季中平均根長度的有益提高。圖17B顯示了所述真菌內(nèi)生菌 組合物對季中地下重量的有益提高。圖18顯示了所述真菌內(nèi)生菌組合物對Delta Pine和 Phyton栽培品種的季中遮棚溫度的有益提高。圖19顯示了所述真菌內(nèi)生菌組合物對Delta Pine和Phyton栽培品種的季中NDVI (標(biāo)準(zhǔn)化差異植被指數(shù)）的有益提高。NDVI是葉綠素含量 的量度。圖20顯示了所述真菌內(nèi)生菌組合物對Delta Pine和Phyton栽培品種的季中第一位 置棉蕾保持的有益提高。圖21和圖22顯示了用所述內(nèi)生菌組合物處理Delta Pine和Phyton 栽培品種時，季中植物高度的調(diào)節(jié)（7月上調(diào)和8月下調(diào)）。圖23顯示了與未處理對照（左半 圖）相比，內(nèi)生菌處理的植物中提高的生物量(右半圖）。
[0170] 在圖15至22中，TAM505是鏈格孢屬，TAM32是黑附球菌，TAM534是夏孢生枝孢， TAM244是枝孢屬，TAM514是夏孢生枝孢，TAM474是芽枝狀枝孢，TAM554是球毛殼菌，TAM15是 明臍菌屬，TAM488是黑附球菌，TAM452是夏孢生枝孢，TAM490是淡紫擬青霉，TAMBB是球孢白 僵菌，TAM105是旋孢腔菌屬，TAM189是離蠕孢屬和TAM47是黑附球菌。
[0171] 實施例16:真菌內(nèi)生菌種子處理在溫室試驗中的棉花栽培品種中提供了耐旱性
[0172] 棉花植物從溫室中的內(nèi)生菌處理的和未處理的對照種子萌發(fā)。使用每株植物預(yù)定 的土壤水飽和體積，將所有種子澆水7天或直至子葉階段。在7DAP時，從水脅迫植物撤水，而 對照繼續(xù)澆水。在最大21DAP時測量枯萎時間和死亡時間。圖24中的數(shù)據(jù)顯示了平均枯萎時 間，而圖25中的數(shù)據(jù)顯示了平均死亡時間。內(nèi)生菌處理提高了Delta Pine (DTP)和Phytogen (PHY)栽培品種中經(jīng)歷干旱脅迫的植物的存活。在圖24和25中，內(nèi)生菌編號194是黑附球菌， 249是芽枝狀枝孢，355是球毛殼菌，46是附球菌屬，463是枝孢屬，534是夏孢生枝孢，554是 球毛殼菌，58是黑附球菌，而對照沒有內(nèi)生菌處理。
[0173] 實施例17:與表1中那些具有至少97%同一性的真菌內(nèi)生菌的鑒定
[0174] 鑒定了與SEQ ID N0:7至SEQ ID N0:77具有97%同一性的所有已知真菌內(nèi)生菌， 并通過登錄號列于此：FJ425672，AY526296，JQ760047，UDB014465，KC662098，HQ649874， JQ764783,EU881906,KF251285,JQ862870,AB019364,AB594796,JF773666,JN034678, KC343142,EU707899,AB627855,GU138704,JN695549,DQ279491,HM776417,AB361643, DQ782839,AF222826,EU682199,DQ782833,EU054429,FJ025275,AY354239,AF222828, GU721921,GU721920,DQ093715,AJ309335,FR774125,JQ747741,EF042603,KC968942, HE584924,AY740158,FJ645268,HQ692590,GQ203786,AY233867,HE579398,AB777497, KF435523,DQ420778,JQ649365,AJ271430,GQ996183,EF070423,FJ172277,AF483612, JX675127,EF070420,EF070421,AB741597,JN225408,DQ019364,KF251279,EF194151, EU977196,JX981477,EU686115,JX021531,FJ527863,AJ302451,AJ302455,JN975370, EU754952,AF284388,KF296855,AF502785,JX317207,AF502781,DQ278915,EU686867, KC179120,HM991270,AF284384,DQ632670,JQ759806,JQ747685,EU885302,GU721781, EF434047,EF505854,JQ666587,JQ619887,GQ919270,KF531831,AB627854,DQ914679, DQ914681,HQ599592,DQ279490,DQ660336,JX069862,AB607957,HE820869,FJ859345, JX966567,GU910230,AB627850,JX144030,DQ914723,HM595556,KC771473,DQ849310, EU179868,KF312152,JN890447,JX042854,EU554174,JN198518,HM992813,JQ845947, KF251310,JQ758707,AM930536,KF296912,JN865204,JN943512,GQ921743,EU245000, EU977304,EU144787,HE579322,HE579402,GU910171,HE792919,KC960885,DQ485941, JN604449,HQ607913,AF502620,DQ468027,JX944132,JN207338,JQ922240,JN207336, JX559559,JN207330,JN207333,HE820882,JX969625,HQ339994,JF744950,HE584937, JN120351,JX298885,DQ872671,AJ877102,JQ081564,DQ019391,AF071342,EF104180, JQ759755,GU827492,JN418769,GU324757,JX984750,JX256420,KF436271,JX205162, JN712450，KF435911，GU367905，JX416919，KC315933，JQ736648，AY904051，AF404126, FJ466722,HE584965,JN890282,HE584966,HQ166312,KC305124,HE977536,KC305128, AY907040,JF710504,AF483609,AJ302460,AJ302461,AJ302462,AY969615,EU685981, U75615,AJ302468,FJ210503,GU237860,JX960591,JX143632,HM044649,EU164404, 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[0175] 實施例18:內(nèi)生菌及其組合
[0176] 將實施例1 -16中所述的實驗方案結(jié)合表1的內(nèi)生菌來使用以證實對植物健康的有 益特性，如，例如，產(chǎn)量和/或抗蟲性。特別地，將來自表1的內(nèi)生菌用于與植物的合成組合 中，如本文中所述的，與作物如棉花一起。表1中所列的任何單一內(nèi)生菌或內(nèi)生菌組合也可 以以這種方式使用，例如使用種子包衣或葉、土壤或根圍施用。種子組合物可以包含種子和 表1中所列內(nèi)生菌的任意組合。表1中所列的內(nèi)生菌及其組合因此用于防止蟲害、提高產(chǎn)量、 處理蟲害、制造抗蟲種子的方法中；或根據(jù)實施例1-15方法提高作物產(chǎn)量或降低作物損失 的方法中。
【主權(quán)項】
1. 一種棉花種子或植物和包括至少一種來自表1的內(nèi)生菌的真菌內(nèi)生菌的合成組合， 其中棉花是所述內(nèi)生菌的宿主植物。2. 權(quán)利要求1的合成組合，包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20種內(nèi)生菌。3. -種種子包衣，包含 a) 包括至少一種來自表1的真菌內(nèi)生菌;和 b) 至少一種包衣材料，其中所述真菌內(nèi)生菌與所述包衣材料接觸。4. 權(quán)利要求 3 的種子包衣，包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20種內(nèi)生菌。5. 權(quán)利要求3的種子包衣，其中所述包衣材料包括海藻酸、卡拉膠、糊精、葡聚糖、 pelgel、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、聚乙烯醇、明膠或其組合。6. 權(quán)利要求3的種子包衣，其中真菌內(nèi)生菌與包衣材料的重量比為1:1-10、1:10-50、1: 50-100、1:100-500、1:500-1000或1:1000-5000。7. 權(quán)利要求3的種子包衣，其中所述種子包衣是流體。8. 權(quán)利要求3的種子包衣，其中所述種子包衣是粉末。9. 權(quán)利要求3的種子包衣，其中所述真菌內(nèi)生菌包括真菌孢子。10. 權(quán)利要求3的種子包衣，包含約102、103、104、105、10 6、107、108或109菌落形成單位/克 或孢子/克。11. 一種用于葉或土壤施用的組合物，包含 a) 至少一種來自表1的內(nèi)生菌;和 b) 至少一種載體、表面活性劑或稀釋劑。12. 權(quán)利要求11的組合物，包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20種內(nèi)生菌。13. 權(quán)利要求11的組合物，包含約102、103、104、105、10 6、107、108或109菌落形成單位/克 或孢子/克。14. 權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物包含水、去污劑、Triton X、殺蟲劑、殺真菌 劑或其組合。15. -種種子組合物，其包含植物種子和權(quán)利要求11的種子包衣。16. 權(quán)利要求15的種子組合物，其中所述植物種子包括棉花種子。17. 權(quán)利要求15的種子組合物，其中所述植物種子包括農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物的種子。18. 權(quán)利要求15的種子組合物，其中所述植物種子包括雙子葉植物種子。19. 權(quán)利要求15的種子組合物，其中所述植物種子包括單子葉植物種子。20. 權(quán)利要求15的種子組合物，其中所述種子組合物抗包括昆蟲和/或線蟲的害蟲。21. -種用于預(yù)防蟲害或提高產(chǎn)量的方法，包括用權(quán)利要求11的組合物處理植物、植物 種子或者所述植物或種子的根圍。22. 權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括鑒定所述植物為需要內(nèi)生菌處理。23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述種子被懷疑需要害蟲防治，并且所述害蟲包括線蟲 和/或昆蟲。24. 權(quán)利要求21的方法，其中所述種子被懷疑需要害蟲防治，并且所述害蟲包括根結(jié)線 蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。25. -種用于預(yù)防蟲害的方法，包括 a) 獲得根據(jù)權(quán)利要求15的抗害蟲種子組合物;和 b) 種植所述抗害蟲種子組合物。26. 權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括確認(rèn)預(yù)防蟲害的需要。27. 權(quán)利要求25的方法，其中所述害蟲包括線蟲和/或昆蟲。28. 權(quán)利要求25的方法，其中所述害蟲包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。29. -種用于處理蟲害的方法，包括 a) 鑒定懷疑被害蟲侵染的植物； b) 將權(quán)利要求11的組合物施用于所述植物，由此產(chǎn)生內(nèi)生菌處理的植物。30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述害蟲包括線蟲和/或昆蟲。31. 權(quán)利要求29的方法，其中所述害蟲包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。32. -種生產(chǎn)抗害蟲種子的方法，包括 a) 提供包含至少一種來自表1的內(nèi)生菌的內(nèi)生菌組合物； b) 提供種子； c) 將所述種子與所述內(nèi)生菌組合物混合，由此產(chǎn)生抗害蟲種子。33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述內(nèi)生菌組合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 種內(nèi)生菌。34. 權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括在所述種子與所述內(nèi)生菌組合物混合之前，將種子 滅菌以除去微生物。35. 權(quán)利要求32的方法，其中該方法提高了從所述種子產(chǎn)生的植物的內(nèi)生菌定殖百分 比。36. -種提高作物產(chǎn)量或降低作物損失的方法，包括 a) 提供包含至少一種來自表1的內(nèi)生菌的內(nèi)生菌組合物;和 b) 將所述內(nèi)生菌組合物施用于種子、植物或其部分，由此提高作物產(chǎn)量。37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述內(nèi)生菌組合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 種內(nèi)生菌。38. 權(quán)利要求36的方法，其中所述作物是棉花，并且相對于沒有施用內(nèi)生菌組合物的作 物，產(chǎn)量的提高為至少約5%、15%、20%或25%。 3 9.權(quán)利要求3 6的方法，其中相對于沒有施用內(nèi)生菌組合物的作物，產(chǎn)量的提高為約 5%、10%、15%、20%、30%、40% 或 45%。40. 權(quán)利要求36的方法，其中所述作物是棉花，并且所述損失的降低包括降低的棉鈴損 害。41. 權(quán)利要求36的方法，其中所述損失的降低包括由于蟲害或干旱引起的損失的降低， 并且相對于未施用內(nèi)生菌組合物的作物，損失低40%、30%、20%、10%、5%或5%。42. -種用于改善農(nóng)業(yè)植物的性狀的方法，該方法包括： a)將所述植物的農(nóng)業(yè)種子接觸包含至少一個物種的純化的絲狀的、孢子形成的、兼性 真菌內(nèi)生菌的制劑，其中所述內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物有益或?qū)οx有害或兼具這兩者的物 質(zhì)，并且其中所述內(nèi)生菌以與種植在農(nóng)業(yè)環(huán)境中的參照種子相比有效調(diào)節(jié)對于從種子生長 的農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌的定殖頻率且對所述種子或從所述種子生長的農(nóng)業(yè)植物的益處 的量存在于制劑中。43. 權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包括將接觸的種子包裝在容器中。44. 權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包括生長所述農(nóng)業(yè)植物的群體，其中所述益處在群體水 平測量，如與參照植物群體相比較。45. 權(quán)利要求42的方法，其中所述對于農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌是鏈格孢屬 (Alternaria)的。46. 權(quán)利要求42的方法，其中所述益處是選自相對于參照植物增加的生物質(zhì)、增加的分 蘗、增大的根群、增加的開花、提高的產(chǎn)量、提高的水利用效率、產(chǎn)量損失的降低、改變的植 物高度、縮短的發(fā)芽時間、提高的秧苗高度、增加的根長度、提高的葉綠素水平、發(fā)育花的保 持、發(fā)育果的保持、改變的植物激素水平和增強(qiáng)的對環(huán)境脅迫的抵抗力的改善的農(nóng)藝特性。47. 權(quán)利要求46的方法，其中對于源自所述種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是相對于參照植物 群體，所述植物群體的產(chǎn)量提高約5%、10%、15%、20%、30%、40%或45%。48. 權(quán)利要求46的方法，其中對于源自所述種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是所述植物群體中 產(chǎn)量損失的降低相對于參照植物群體超過40 %、30 %、20 %、10%、5%或1%。49. 權(quán)利要求46的方法，其中所述環(huán)境脅迫選自干旱脅迫、冷脅迫、熱脅迫、營養(yǎng)缺乏、 鹽毒性、鋁毒性、食草動物的放牧、蟲害、線蟲侵染及真菌感染、細(xì)菌感染和病毒感染。50. 權(quán)利要求42的方法，其中所述內(nèi)生菌以有效獲得從所述種子生長的農(nóng)業(yè)植物的葉、 莖或根的至少50%定殖的量存在于所述合成組合中。51. 權(quán)利要求42的方法，其中所述害蟲包括線蟲和/或昆蟲。52. 權(quán)利要求42的方法，其中所述害蟲包括根結(jié)線蟲、蚜蟲、草盲蝽、椿象或其組合。53. 權(quán)利要求42的方法，其中所述合成組合包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20種兼性真菌內(nèi)生菌。54. -種農(nóng)業(yè)植物種子和包含至少一個物種的純化絲狀的、孢子形成的兼性真菌內(nèi)生 菌的組合物的合成組合，其中所述內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生對植物有益的或?qū)οx有害的或兼具這 兩者的物質(zhì)，并且其中所述兼性真菌內(nèi)生菌以與種植在農(nóng)業(yè)環(huán)境中的參照種子相比有效調(diào) 節(jié)對于從所述種子生長的農(nóng)業(yè)植物天然的內(nèi)生菌的定殖頻率以及對所述種子或從所述種 子生長的農(nóng)業(yè)植物提供益處的量存在于所述合成組合中。55. 權(quán)利要求54的合成組合，其中所述兼性真菌內(nèi)生菌以，與種植在農(nóng)業(yè)環(huán)境的參照種 子相比，有效調(diào)節(jié)從所述種子生長的農(nóng)業(yè)植物的天然鏈格孢屬的內(nèi)生菌的定殖頻率的量存 在于所述合成組合中。56. 權(quán)利要求54的合成組合，其中所述益處是選自相對于參照植物增加的生物質(zhì)、增加 的分蘗、增大的根群、增加的開花、提高的產(chǎn)量、提高的水利用效率、產(chǎn)量損失的降低、改變 的植物高度、縮短的發(fā)芽時間、提高的秧苗高度、增加的根長度、提高的葉綠素水平、發(fā)育花 的保持、發(fā)育果的保持、改變的植物激素水平和增強(qiáng)的對環(huán)境脅迫的抵抗力的改善的農(nóng)藝 特性。57. 權(quán)利要求54的合成組合，其中所述環(huán)境脅迫選自干旱脅迫、冷脅迫、熱脅迫、營養(yǎng)缺 乏、鹽毒性、鋁毒性、食草動物的放牧、蟲害、線蟲侵染及真菌感染、細(xì)菌感染和病毒感染。58. 權(quán)利要求54的合成組合，其中所述內(nèi)生菌以有效獲得從所述種子生長的農(nóng)業(yè)植物 的葉、莖或根的至少50%定殖的量存在于所述合成組合物中。59. 權(quán)利要求 13 的合成組合，包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20株的內(nèi)生菌。60. 權(quán)利要求56的合成組合，其中對于源自所述種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是相對于參照 植物群體，所述植物群體的產(chǎn)量提高約5%、10%、15%、20%、30%、40%或45%。61. 權(quán)利要求56的合成組合，其中對于源自所述種子的農(nóng)業(yè)植物的益處是所述植物群 體中產(chǎn)量損失的降低相對于參照植物群超過40%、30%、20%、10%、5%或1%。
【文檔編號】A01P7/04GK106061243SQ201480072142
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年11月6日
【發(fā)明人】G·A·斯沃德
【申請人】德克薩斯A&M大學(xué)體系