一種由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以貴州地方品種頂壇花椒的未成熟果實(shí)為外植體，通過(guò)不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素組合誘導(dǎo)產(chǎn)生珠心胚和胚狀體，并對(duì)珠心胚再生培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行了研究，建立了頂壇花椒離體再生體系，為花椒種質(zhì)資源的有效利用、脫毒保存、生物技術(shù)改良等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【專利說(shuō)明】
一種由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及花椒組織培養(yǎng)的快繁方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 頂壇花椒(Zanthoxylum planispinum var.dintanensis)是蕓香科(Rutaceae)花 椒屬（Zanthoxylum)竹葉椒（Zanthoxylum planispinum)的1個(gè)變種，分布于貴州北盤(pán)江花 江峽谷喀斯特山地或路旁，歷來(lái)以"香味濃，麻味重，產(chǎn)量高"而著稱，迄今已有數(shù)百年的栽 培歷史。當(dāng)頂壇花椒樹(shù)齡處于5~9年時(shí)，生殖力達(dá)到峰值，要想獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)及 時(shí)砍伐老齡化個(gè)體，同時(shí)補(bǔ)植相應(yīng)的幼株。頂壇花椒目前的繁殖方式主要是種子脫脂育苗， 由于其種殼堅(jiān)硬，富含油脂，不透水，發(fā)芽較為困難，一粒種子最多產(chǎn)生一顆小苗。關(guān)于花椒 屬植物的組織培養(yǎng)國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但主要是以嫩莖、葉片為外植體，很少以花椒種子為外 植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，而且對(duì)于頂壇花椒組培再生研究較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是頂壇花椒珠心胚誘導(dǎo)脫毒苗的方法，本研究通過(guò)建 立頂壇花椒離體再生體系，為花椒種質(zhì)資源的有效利用、脫毒保存、生物技術(shù)改良等提供理 論依據(jù)和技術(shù)支持。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0005] -種由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)取頂壇花椒綠色果實(shí)內(nèi)的珠心組織進(jìn)行離體培養(yǎng)；
[0007] (2)MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/L+3%蔗糖+0.4%Gelzan為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo) 珠心組織產(chǎn)生珠心胚；
[0008] (3)珠心胚繼代培養(yǎng)，得到胚狀體，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/ L+3% 鹿糖+0 · 4%Gelzan;
[0009] (4)將胚狀體于WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA的分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，形成叢 生芽；
[0010] (5)將小芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培養(yǎng)并從主根上萌發(fā)側(cè) 根，葉片青綠色；
[0011] (6)生根后的頂壇花椒進(jìn)行煉苗移栽。
[0012] 所述綠色果實(shí)為成熟前7 -10天的果實(shí)。
[0013] 所述珠心組織取出前需要對(duì)綠色果實(shí)進(jìn)行消毒，所述消毒步驟包括:在無(wú)菌條件 下用75%醫(yī)用酒精浸泡殺菌1〇111；[11，無(wú)菌水沖洗一遍，用0.1%升萊滅菌301]1；[11，最后用無(wú)菌 水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水分。
[0014] 所述步驟(2)(3)(4)(5)的培養(yǎng)條件均為溫度25±1°(：、光照強(qiáng)度1500~2000以、光 周期 16h/8h。
[0015] 所述步驟(2)的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)12 - 15天，所述步驟(3)的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為25 - 35天。
[0016] 所述步驟(5)的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為40 - 50天。
[0017]所述步驟(6)的生根苗為主根長(zhǎng)達(dá)5cm，且側(cè)根有4~5條。
[0018]所述步驟(6)中的生根苗移栽前在自然光下適應(yīng)3 - 5天，取出冼凈基部培養(yǎng)基再 移栽。
[0019]所述步驟(6)中移栽基質(zhì)為珍珠巖:菜園土 = 1:3。
[0020] 所述步驟(6)中移栽后的生根苗加蓋保鮮膜。
[0021] 本發(fā)明的方法:7月中上旬采集接近成熟的果實(shí)為外植體，要求是果實(shí)表面光滑、 無(wú)明顯病斑、綠色果皮，在無(wú)菌條件下用75 %醫(yī)用酒精浸泡殺菌lOmin，無(wú)菌水沖洗一遍，用 0.1% (w/v，含有tween_§〇?_)升萊滅菌30min，最后用無(wú)菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水 分。用槍狀鑷夾住消毒后的種子，23 #手術(shù)刀切取珠心組織進(jìn)行離體培養(yǎng)。以MS+3%蔗糖(w/ v) +0.4 % Ge 1 zan (w/v)為基本培養(yǎng)基，pH5.8。添加細(xì)胞分裂素6-BA 2. Omg/L和生長(zhǎng)素2，4-D 0.4mg/L誘導(dǎo)珠心組織產(chǎn)生誅心胚，培養(yǎng)條件為溫度(25±1)°C、光照強(qiáng)度1500~20001x、光 周期16h/8h，15天左右出現(xiàn)明顯的珠心胚。珠心組織培養(yǎng)產(chǎn)生的珠心胚繼代培養(yǎng)一次，1個(gè) 月左右產(chǎn)生大量的胚狀體。然后轉(zhuǎn)接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培養(yǎng)基進(jìn)行 培養(yǎng)，形成叢生芽。將小芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培養(yǎng)45d左右， 從主根上萌發(fā)側(cè)根，主根長(zhǎng)達(dá)5cm，形成側(cè)根4~5條，葉片青綠色。生根試管苗在自然光下適 應(yīng)4d，取出冼凈基部培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)為珍珠巖:菜園土=1:3的花盆中，加蓋保鮮膜、保 持濕度，保證較高的移栽成活率。
[0022] 本發(fā)明方法用材少，外植體獲取方便，果實(shí)消毒后切取珠心組織培養(yǎng)成活率高，無(wú) 褐變、無(wú)污染。珠心胚誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生叢生芽，再生繁殖系數(shù)高。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1頂壇花椒接近成熟但尚未成熟的果實(shí)，
[0024]圖2珠心胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)，
[0025]圖3胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)，
[0026] 圖4叢生芽的誘導(dǎo)，
[0027]圖5生根培養(yǎng)，
[0028]圖6移栽成活的花椒植株。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0030] 以從貞豐縣興北鎮(zhèn)引種到貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因植物試驗(yàn)示范 基地的8年生頂壇花椒雌株為材料。
[0031] 7月12日采集大小接近成熟、表面光滑、無(wú)明顯病斑、綠色果皮的未成熟果實(shí)見(jiàn)圖1 為外植體，在無(wú)菌條件下用75%醫(yī)用酒精浸泡殺菌lOmin，無(wú)菌水沖洗一遍，用0.1% (w/v， 含有tWeen80? )升汞滅菌30min，然后用無(wú)菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表面水分。用槍狀鑷 夾住消毒后的種子，23#手術(shù)刀切取珠心組織培養(yǎng)。
[0032] 以MS+6-BA 2.0mg/L+2,4_D 0.4mg/L+3%鹿糖(w/v)+0.4%Gelzan(w/v)、pH5.8為 初始培養(yǎng)基誘導(dǎo)珠心組織見(jiàn)圖2，培養(yǎng)條件為溫度(25 ± 1) °C、光照強(qiáng)度1500~2000lx、光周 期16h/8h，15天左右出現(xiàn)明顯的珠心胚。
[0033]珠心組織培養(yǎng)產(chǎn)生的珠心胚繼代培養(yǎng)一次，1個(gè)月左右產(chǎn)生大量的胚狀體。見(jiàn)圖3 [0034] 然后將得到的胚狀體轉(zhuǎn)接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA+3%蔗糖(w/v) + 0.4%Gelzan(W/V)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，胚狀體形成叢生芽。見(jiàn)圖4 [0035] 將3cm高的小芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培養(yǎng)45d左右，從 主根上萌發(fā)側(cè)根，主根長(zhǎng)達(dá)5cm，形成側(cè)根4~5條，葉片青綠色。見(jiàn)圖5
[0036] 生根試管苗在自然光下適應(yīng)4d，取出冼凈基部培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)為珍珠巖:菜園 土 = 1:3的花盆中，加蓋保鮮膜、保持濕度。見(jiàn)圖6。
[0037] 本發(fā)明方法用材少，外植體獲取方便，果實(shí)消毒后切取珠心組織培養(yǎng)成活率高，無(wú) 褐變、無(wú)污染。珠心胚誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生叢生芽，再生繁殖系數(shù)高。
[0038] 表1不同6-BA和2,4-D對(duì)頂壇花椒珠心胚誘導(dǎo)率的影響(n = 20)
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，包括如下步驟： (1) 取頂壇花椒綠色果實(shí)內(nèi)的珠心組織進(jìn)行離體培養(yǎng)； (2) MS+6_BA 2·Omg/L+2，4_D 0·4mg/L+3%鹿糖+0·4%Gelzan為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)珠心 組織產(chǎn)生珠心胚； (3) 珠心胚繼代培養(yǎng)，得到胚狀體，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 · Omg/L+2，4-D 0 · 4mg/L+ 3%||^j|+0.4%Gelzan; (4) 將胚狀體于WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，形成叢生芽； (5) 將小芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培養(yǎng)并從主根上萌發(fā)側(cè)根， 葉片青綠色； (6) 生根后的頂壇花椒進(jìn)行煉苗移栽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述綠色果實(shí)為成 熟前7 -10天的果實(shí)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述珠心組織取出 前需要對(duì)綠色果實(shí)進(jìn)行消毒，所述消毒步驟包括:在無(wú)菌條件下用75%醫(yī)用酒精浸泡殺菌 lOmin，無(wú)菌水沖洗一遍，用0.1%升萊滅菌30min，最后用無(wú)菌水沖洗4~5次，吸水紙吸干表 面水分。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(2)(3)(4) (5)的培養(yǎng)條件為溫度25±1°C、光照強(qiáng)度1500~20001x、光周期16h/8h。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(2)培養(yǎng)時(shí) 間12 - 15天，所述步驟(3)的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為25 - 35天。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(5)的培養(yǎng) 時(shí)長(zhǎng)為40 - 50天。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)的生根 苗為主根長(zhǎng)達(dá)5cm，且側(cè)根有4~5條。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中的生 根苗移栽前在自然光下適應(yīng)3 - 5天，取出冼凈基部培養(yǎng)基再移栽。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中移栽 基質(zhì)為珍珠巖:菜園土 = 1: 3。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的由珠心胚誘導(dǎo)頂壇花椒快速繁殖的方法，所述步驟(6)中移 栽后的生根苗加蓋保鮮膜。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK106069779SQ201610613782
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月30日 公開(kāi)號(hào)201610613782.5, CN 106069779 A, CN 106069779A, CN 201610613782, CN-A-106069779, CN106069779 A, CN106069779A, CN201610613782, CN201610613782.5
【發(fā)明人】趙德剛, 李建容, 曾曉芳
【申請(qǐng)人】貴州大學(xué)