專利名稱：用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用其中谷氨酸脫氫酶基因被擴(kuò)增的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
L-氨基酸被用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，人類醫(yī)藥以及制藥工業(yè)中。
L-氨基酸由利用產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀細(xì)菌(特別是利用谷氨酸棒桿菌)菌株經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)。由于這一組產(chǎn)品的重要性，人們堅(jiān)持不懈地努力改進(jìn)其生產(chǎn)方法。方法的改進(jìn)可能與涉及發(fā)酵技術(shù)的手段有關(guān)(例如攪拌和供氧)，或者與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成有關(guān)(例如發(fā)酵期間的糖濃度)，或者與產(chǎn)物的回收有關(guān)(例如，離子交換層析)，或者與微生物自身的內(nèi)在效能特征有關(guān)。
利用誘變，選擇和突變體選擇這些方法改進(jìn)這些微生物的效能特征。按這一方式，獲得對(duì)抗代謝物(例如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性或者對(duì)通常主要的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷并且生產(chǎn)L-氨基酸的菌株。
一些年來(lái)，重組體DNA技術(shù)的方法也用來(lái)改進(jìn)生產(chǎn)L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌的菌株，其是通過(guò)擴(kuò)增個(gè)體生物合成基因，并且研究其對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)的作用。這一課題的回顧性文章在以下文獻(xiàn)中可以找到Kinoshita(″谷氨酸桿菌″，工業(yè)微生物學(xué)，Demain和Solomon(編者)，Benjamin Cummings，London，UK，1985，115-142)，Hilliger(BioTec2，40-44(1991))，Jetten和Sinskey(生物技術(shù)關(guān)鍵性綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)院年報(bào)782，25-39(1996))。
谷氨酸脫氫酶催化α-氧代戊二酸的還原性氨基化，產(chǎn)生谷氨酸。法國(guó)出版的專利申請(qǐng)2 575 492描述了Corynebacterium melassecola801的DNA片段，其攜帶有谷氨酸脫氫酶基因。它可以用來(lái)在Corynebacterium melassecola的發(fā)酵中增加谷氨酸的產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌ATCC13032的谷氨酸脫氫酶基因的核苷酸序列已由Brmann等描述(分子微生物學(xué)6，317-326(1992))。不解糖消化鏈球菌的谷氨酸脫氫酶基因的核苷酸序列由Snedecor等說(shuō)明(細(xì)菌學(xué)雜志193，6162-6167)。
本發(fā)明目的在于提供改進(jìn)發(fā)酵生產(chǎn)其他L-氨基酸的新的手段。
L-氨基酸用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，人類醫(yī)藥以及制藥工業(yè)中。因此為L(zhǎng)-氨基酸的生產(chǎn)提供改進(jìn)的方法總是令人有興趣的。
當(dāng)以下提到L-氨基酸時(shí)，其是指形成蛋白質(zhì)的氨基酸L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-脯氨酸，L-色氨酸和它們的鹽，以及L-高絲氨酸，特別是L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-色氨酸。
本發(fā)明提供了利用棒狀細(xì)菌(coryneform bacteria)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，特別是所說(shuō)的細(xì)菌已能生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的L-氨基酸，且其中編碼酶谷氨酸脫氫酶的核苷酸序列被擴(kuò)增，特別是被超量表達(dá)。
優(yōu)選的的實(shí)施方案在權(quán)利要求中闡明。
就此而言，術(shù)語(yǔ)″擴(kuò)增″描述了在微生物中的一種或多種酶的胞內(nèi)活性增加，所說(shuō)的酶由對(duì)應(yīng)的DNA編碼，例如通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)，通過(guò)利用強(qiáng)啟動(dòng)子或者編碼相應(yīng)酶(具有提高的活性)的基因，或選擇性地組合這些手段來(lái)實(shí)現(xiàn)活性增加。
本發(fā)明提供的微生物能夠由葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉，纖維素或者甘油和乙醇產(chǎn)生L-氨基酸。這些微生物可以包括代表性的棒狀細(xì)菌，特別是棒狀桿菌屬。在棒狀桿菌屬內(nèi)，可以特別提到谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
棒狀桿菌屬，特別是谷氨酸棒桿菌種的合適的菌株是已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒狀桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和它們的突變體或者來(lái)源于它們的菌株，例子是生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712，生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P5835黃色短桿菌FERM-P4164和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P4180，生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P756黃色短桿菌FERM-P759和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P4192，生產(chǎn)L-纈氨酸的菌株黃色短桿菌FERM-P512和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1845，生產(chǎn)L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-BP478黃色短桿菌FERM-BP475和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P7127。
本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在超量表達(dá)L-谷氨酸脫氫酶后，棒狀細(xì)菌以一種改進(jìn)的方式生產(chǎn)L-氨基酸，本文不要求對(duì)L-谷氨酸的保護(hù)。
谷氨酸棒桿菌的谷氨酸脫氫酶基因由Brmann等描述(分子微生物學(xué)6，317-326(1992))，按照本發(fā)明可以使用。其他微生物的谷氨酸脫氫酶基因，例如從不解糖消化鏈球菌獲得的(由Snedecor等(細(xì)菌學(xué)雜志173，6162-6167(1991))描述)也是合適的。由遺傳密碼簡(jiǎn)并或由功能性中性突變產(chǎn)生的所述基因的等位基因也可以使用。
可以通過(guò)增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)達(dá)到超量表達(dá)，或者可以突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以相同的方式起作用。在發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸期間，通過(guò)以誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的方式增加表達(dá)也是可能的。也可以通過(guò)延長(zhǎng)mRNA壽命的方法改善表達(dá)。通過(guò)阻止酶蛋白質(zhì)的降解額外地?cái)U(kuò)增酶活性?；蚧蛘呋驑?gòu)建體可以以可變拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中或者整合進(jìn)染色體，并被擴(kuò)增。另外，基因的超量表達(dá)也可以通過(guò)改變營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成與培養(yǎng)條件來(lái)完成。
在這一點(diǎn)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)從以下文獻(xiàn)中得到指導(dǎo)Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利EPS O 472 869，美國(guó)專利4,601,893，Schwarzer和Piihler(生物/技術(shù)9，84-87(1991)，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請(qǐng)WO 96/15246，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)回顧60512-538(1996))和已知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)教科書(shū)。
輔助谷氨酸脫氫酶超量表達(dá)的質(zhì)粒的例子是pEK1.9gdh-1和pEKExpgdh，其存在于菌株ATCC 13032/pEK1.9gdh-1和DH5α/pEKExpgdh中。質(zhì)粒pEK1.9gdh-1是穿梭載體，其含有谷氨酸棒桿菌的NADP-依賴性谷氨酸脫氫酶基因。質(zhì)粒pEKExpgdh是穿梭載體，其含有不解糖消化鏈球菌的NADP-依賴性谷氨酸脫氫酶基因。
為生產(chǎn)相應(yīng)的L-氨基酸以超量表達(dá)一種或多種特殊的氨基酸生物合成途徑的酶以及谷氨酸脫氫酶也可能是有利的，這樣的例子是●編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因可被額外地超量表達(dá)，以改進(jìn)生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌(EP-B 0197335)，●編碼乙酰羥酸合酶的基因可被額外地超量表達(dá)，以改進(jìn)生產(chǎn)L-纈氨酸的棒狀細(xì)菌(EP-B 0356739)，●編碼鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶的基因可被額外地超量表達(dá)，以改進(jìn)生產(chǎn)L-色氨酸的棒狀細(xì)菌(EP-B 0124048)，●編碼高絲氨酸脫氫酶的基因可被額外地超量表達(dá)，以改進(jìn)生產(chǎn)L-蘇氨酸或者L-異亮氨酸的棒狀細(xì)菌(EP-A 0131171)。
除超量表達(dá)谷氨酸脫氫酶之外，為產(chǎn)生相應(yīng)的L-氨基酸可以更有利地阻斷不需要的次級(jí)反應(yīng)(Nakayama″生產(chǎn)氨基酸的微生物的培育″，在“微生物產(chǎn)物的超量產(chǎn)生”中，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)，學(xué)院出版社，倫敦，英國(guó)，1982)。
為生產(chǎn)L-氨基酸的目的，根據(jù)本發(fā)明的微生物可采用分批或流加方法或重復(fù)流加方法連續(xù)培養(yǎng)或不連續(xù)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法總結(jié)在以下教科書(shū)中Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所使用的培養(yǎng)基必須完全滿足特定菌株的需要。各種微生物的培養(yǎng)基在美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”(華盛頓D.C.，美國(guó))中有描述?？梢岳玫奶荚窗ㄌ呛吞妓衔?，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素；油和脂肪，如大豆油，向日葵油，花生油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用或者混合使用?？梢岳玫牡窗ê袡C(jī)化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏，麥芽汁，玉米漿，大豆粉和尿素；或者無(wú)機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)使用或者混合使用。可以利用的磷源是磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基必須還含有生長(zhǎng)必需的金屬鹽，如硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除了以上所述的物質(zhì)外，對(duì)促生長(zhǎng)必需的物質(zhì)如氨基酸和維生素也可以使用。合適的前體也可以進(jìn)一步地添加至培養(yǎng)基中。所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以以單批或者在培養(yǎng)期間適當(dāng)流加至培養(yǎng)基中。
堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨，或者酸性化合物，如磷酸或者硫酸，用來(lái)適當(dāng)?shù)乜刂婆囵B(yǎng)物的pH值。消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用來(lái)控制起泡。合適的選擇性作用物質(zhì)，如抗生素，可以添加至培養(yǎng)基中，以保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。氧氣或含氧的氣體混合物，如空氣，引入培養(yǎng)基，以保持需氧條件。培養(yǎng)溫度通常從20℃至45℃，優(yōu)選地為25℃至40℃。培養(yǎng)繼續(xù)至形成最大量的所需L-氨基酸。這一目標(biāo)通常在10小時(shí)至160小時(shí)之內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
L-氨基酸可以采用陰離子交換層析和隨后的茚三酮衍生化自動(dòng)分析，如Spackman等所描述的(分析化學(xué)，30，1190(1958))。
下列微生物已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032/pEK1.9gdh-1，保藏號(hào)為DSM12614。
大腸桿菌K12菌株DH5α/pEKExpgdh，保藏號(hào)為DSM 12613。
實(shí)施例本發(fā)明由下列實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明。
這里，試驗(yàn)用生產(chǎn)氨基酸的菌株完成，其中顯示了所要求的方法的優(yōu)越性a)生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌DSM5715，(EP-B-0435132)和b)生產(chǎn)L-蘇氨酸與L-異亮氨酸的菌株黃色短桿菌DSM5399(EP-B-0385 940)和c)生產(chǎn)L-纈氨酸，需要異亮氨酸的菌株ATCC13032ΔilvA，該菌株已按照依據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM12455保藏在德意志微生物保藏中心(德國(guó))。實(shí)施例1產(chǎn)生具有擴(kuò)增的谷氨酸脫氫酶的L-氨基酸生產(chǎn)菌質(zhì)粒pEK1.9gdh-1相當(dāng)于由Brmann等(分子微生物學(xué)6，317-326(1992))描述的質(zhì)粒pEK1.9gdh。其從ATCC13032/pEK1.9gdh-1分離而來(lái)。以相同的方式從大腸桿菌菌株DH5α/pEKExpgdh分離已知質(zhì)粒pEKExpgdh(Marx等，代謝工程1，35-48(1999))，其攜帶有不解糖消化鏈球菌的谷氨酸脫氫酶基因(Snedecor等.細(xì)菌學(xué)雜志，173，6162-6167(1991))。
如Liebl等(FEMS微生物學(xué)通信65，299-304(1989))描述的方法用質(zhì)粒pEK1.9gdh-1轉(zhuǎn)化菌株DSM5715，DSM5399和ATCC13032ΔilvA。將轉(zhuǎn)化體在來(lái)源于Merck(Darmstadt，德國(guó))的腦/心瓊脂上選擇，該瓊脂已經(jīng)補(bǔ)充有50mg/l卡那霉素。按這一方式，獲得菌株DSM5715/pEK1.9gdh-1，DSM5399/pEK1.9gdh-1和ATCC13032ΔilvA/pEK1.9gdh-1。以相同的方式用質(zhì)粒pEKExpgdh轉(zhuǎn)化菌株DSM5715，獲得菌株DSM5715/pEKExpgdh。實(shí)施例2生產(chǎn)L-賴氨酸將菌株DSM5715/pEK1.9gdh-1在復(fù)合培養(yǎng)基2TY中預(yù)培養(yǎng)，所說(shuō)的培養(yǎng)基由蛋白胨16g/l，酵母膏10g/l以及NaCl 5g/l組成。為此，用接種環(huán)將菌株接種到帶有2個(gè)阻流片(flow spoilers)的500ml錐形瓶中的60ml 2TY中，在150rpm和30℃下培養(yǎng)12小時(shí)。
為了接種在帶有2個(gè)阻流片的500ml錐形瓶中的60ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，將預(yù)培養(yǎng)物在Sepatech Minifuge RF(Heraeus，Hanau，德國(guó))離心機(jī)中于5000rpm下離心10分鐘。棄去上清液，將離心沉淀懸浮在1毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基中。將一小份這樣的細(xì)胞懸液添加至生產(chǎn)培養(yǎng)基中，由此達(dá)到OD600約2.0。所使用的生產(chǎn)培養(yǎng)基是具有pH7.0的培養(yǎng)基CGXII(表1)，該培養(yǎng)基由Keilhauer等(細(xì)菌學(xué)雜志175，5595-5603(1993))描述過(guò)，其補(bǔ)充有葡萄糖20g/l，亮氨酸350mg/l以及卡那霉素單硫酸鹽50mg/l。將培養(yǎng)物在30℃和150rpm下培養(yǎng)72小時(shí)。
表1
然后在600nm測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)(Biochrom Novaspec4049，LKB Instrument GmbH，Grfelfing，德國(guó))，采用來(lái)源于Eppendorf-BioTronik(漢堡，德國(guó))的氨基酸分析儀，經(jīng)離子交換層析和柱后與茚三酮反應(yīng)檢測(cè)所形成的L-賴氨酸的濃度。表2顯示試驗(yàn)的結(jié)果。
表2
實(shí)施例3生產(chǎn)L-蘇氨酸和L-異亮氨酸將菌株DSM5399/pEK1.9gdh-1在具有50μg/ml卡那霉素的完全培養(yǎng)基CgIII(Kase & Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972))中預(yù)培養(yǎng)。為此，用接種環(huán)將菌株接種到帶有4個(gè)阻流片的100ml錐形瓶中的10ml培養(yǎng)基CgIII中，在240rpm和30℃下培養(yǎng)16小時(shí)。
為了接種在帶有4個(gè)阻流片的100ml錐形瓶中的10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，測(cè)定預(yù)培養(yǎng)物的OD(660nm)。主培養(yǎng)物接種至0.1OD。所使用的生產(chǎn)培養(yǎng)基是由Keilhauer等(細(xì)菌學(xué)雜志1993，1755595-5603)描述的培養(yǎng)基CgXII。培養(yǎng)基的組成在實(shí)施例2中顯示。添加4％葡萄糖和50mg/l卡那霉素硫酸鹽。將細(xì)胞在33℃，250rpm以及80％大氣濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。
然后在660nm測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)(Biochrom Novaspec4049，LKB Instrument GmbH，Grffelfing，德國(guó))，如實(shí)施例2所述測(cè)定形成的L-蘇氨酸與L-異亮氨酸的濃度。表3顯示試驗(yàn)的結(jié)果。
表3<
實(shí)施例4產(chǎn)生L-纈氨酸將菌株ATCC13032ΔilvA/pEK1.9gdh-1在具有50μg/ml卡那霉素的完全培養(yǎng)基CgIII(Kase &amp; Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972))中預(yù)培養(yǎng)。為此，用接種環(huán)將菌株接種到帶有4個(gè)阻流片的500ml錐形瓶中的50ml培養(yǎng)基CgIII中，在140rpm和30℃下培養(yǎng)16小時(shí)。
為了接種在帶有4個(gè)阻流片的500ml錐形瓶中的60ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，測(cè)定預(yù)培養(yǎng)物的OD(660nm)。將主培養(yǎng)物離心，棄去上清液，將離心沉淀懸浮在5毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基中，將主培養(yǎng)物接種至OD 0.3。所使用的生產(chǎn)培養(yǎng)基是如實(shí)施例3所描述的培養(yǎng)基CgXII(具有4％葡萄糖)(Keilhauer等，細(xì)菌學(xué)雜志1993，1755595-5603)。培將細(xì)胞在30℃，150rpm下培養(yǎng)48小時(shí)。
然后在660nm測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)(Biochrom Novaspec4049，LKB Instrument GmbH，Grfelfing，德國(guó))，如實(shí)施例2所述測(cè)定形成的L-纈氨酸的濃度。表4顯示試驗(yàn)的結(jié)果。
表4
實(shí)施例5生產(chǎn)L-賴氨酸，L-纈氨酸和L-丙氨酸將菌株DSM5715/pEKExpgdh在復(fù)合培養(yǎng)基2TY中預(yù)培養(yǎng)，所說(shuō)的培養(yǎng)基由蛋白胨16g/l，酵母膏10g/l以及NaCl 5g/l組成。為此，用接種環(huán)將菌株接種到帶有2個(gè)阻流片(flow spoilers)的500ml錐形瓶中的60ml 2TY中，在150rpm和30℃下培養(yǎng)12小時(shí)。
為了接種在帶有2個(gè)阻流片的500ml錐形瓶中的60ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，將預(yù)培養(yǎng)物在Sepatech Minifuge RF(Heraeus，Hanau，德國(guó))離心機(jī)中于5000rpm下離心10分鐘。棄去上清液，將離心沉淀懸浮在1毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基中。將一小份這樣的細(xì)胞懸液添加至生產(chǎn)培養(yǎng)基中，由此達(dá)到OD600約0.4。所使用的生產(chǎn)培養(yǎng)基是培養(yǎng)基CGC(表5)，該培養(yǎng)基由Schrumpf等(細(xì)菌學(xué)雜志173，4510-4516(1991))描述過(guò)，其補(bǔ)充有葡萄糖25g/l，亮氨酸350mg/l，3-嗎啉代丙烷磺酸42g/l以及卡那霉素單硫酸鹽50mg/l(pH7)。將培養(yǎng)物在30℃和150rpm下培養(yǎng)30小時(shí)。
表5
然后在600nm測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)(Biochrom Novaspec4049，LKB Instrument GmbH，Grfelfing，德國(guó))，采用來(lái)源于Eppendorf-BioTronik(漢堡，德國(guó))的氨基酸分析儀，經(jīng)離子交換層析和柱后與茚三酮反應(yīng)檢測(cè)所形成的L-丙氨酸，L-賴氨酸和L-纈氨酸的濃度。表6顯示試驗(yàn)的結(jié)果。
表權(quán)利要求
1.通過(guò)棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于，使用其中編碼谷氨酸脫氫酶的核苷酸序列被擴(kuò)增，尤其是被超量表達(dá)的細(xì)菌。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在所使用的細(xì)菌中所產(chǎn)生的谷氨酸脫氫酶是NADP依賴性的。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在所使用的細(xì)菌中所產(chǎn)生的谷氨酸脫氫酶是NAD依賴性的。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用其中在形成所需L-氨基酸的代謝途徑中的其余基因被附加擴(kuò)增的細(xì)菌。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用其中降低所需L-氨基酸形成的代謝途徑至少部分被關(guān)閉的細(xì)菌。
6.按照前述一或多個(gè)權(quán)利要求的方法，其特征在于，使用以質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體攜帶有編碼谷氨酸脫氫酶的核苷酸序列。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，使用以質(zhì)粒載體pEK1.9gdh-1轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體以在谷氨酸棒桿菌中的形式保藏，保藏號(hào)DSM 12614。
8.按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，使用以質(zhì)粒載體pEKExpgdh轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體以在大腸桿菌中的形式保藏，保藏號(hào)DSM 12613。
9.按照前述一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求的L-氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌，所說(shuō)的細(xì)菌中至少谷氨酸脫氫酶基因被擴(kuò)增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中積累所需的L-氨基酸，和c)分離所說(shuō)的L-氨基酸。
10.按照前述一或多個(gè)權(quán)利要求的方法，其特征在于，使用生產(chǎn)以下一種或多種氨基酸的棒狀細(xì)菌L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-脯氨酸，L-色氨酸以及L-高絲氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用其中谷氨酸脫氫酶基因被擴(kuò)增的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1266905SQ00102728
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期2000年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月20日
發(fā)明者阿希姆·馬克思, 貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒, 赫爾曼·扎姆, 阿爾貝特·德格拉夫, 洛塔爾·埃格林 申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司, 于利希研究中心有限公司