專利名稱：診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的dna芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的DNA芯片。
中國(guó)是一個(gè)遺傳病大國(guó)。遺傳病是由于人體生殖細(xì)胞或受精卵的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的疾病，從親代傳至后代。通常包括三大類單基因遺傳病，染色體遺傳病和多基因遺傳病。從世界范圍講，新生兒中至少2％有明顯的先天異常。雖然大多數(shù)遺傳病的發(fā)病率低(多基因病除外)。然而遺傳病種類繁多，因此總數(shù)很多。僅單基因遺傳病就有4000多種，染色體病有100多種，多基因病也不少于100種。并且目前國(guó)際上以平均每年發(fā)現(xiàn)100多種新單基因遺傳病的速度在發(fā)展。這也反應(yīng)了遺傳病帶給醫(yī)學(xué)，社會(huì)和家庭問(wèn)題的嚴(yán)重性。
絕大多數(shù)遺傳病目前還沒(méi)有有效的治療方法，因此預(yù)防就顯得尤為重要。若能在妊娠早期診斷出胎兒是否患病，對(duì)患病胎兒進(jìn)行人工流產(chǎn)，可防止患兒出生。產(chǎn)前遺傳篩檢，輔以人工流產(chǎn)，已證明是一種有效預(yù)防嚴(yán)重危害健康的遺傳病的方法。我國(guó)現(xiàn)有殘疾人5000萬(wàn)，其中相當(dāng)數(shù)量是遺傳病引起的。由于邊遠(yuǎn)地區(qū)和某些農(nóng)村近親結(jié)婚率高，遺傳病發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因此廣泛開(kāi)展產(chǎn)前遺傳篩檢，杜絕患兒出生，降低發(fā)病率，對(duì)于我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)起著重要作用。
由于許多遺傳病特別是單基因孟德?tīng)栃瓦z傳病的基因及基因突變的機(jī)制已研究清楚，使我們?cè)诨蛩侥軠?zhǔn)確診斷大部分遺傳病。在許多發(fā)達(dá)國(guó)家，新生嬰兒的遺傳篩檢很普遍。例如早在60年代，美國(guó)法律已規(guī)定必須對(duì)所有新生嬰兒進(jìn)行苯丙酮酸尿癥的篩檢。徹底消除了因苯丙酮酸尿癥引起的智能障礙兒童的出現(xiàn)。因?yàn)槿绻奖崮虬Y嬰兒在出生時(shí)便能及時(shí)接受特別食譜治療，就不會(huì)出現(xiàn)疾病癥狀。另外針對(duì)特定的新生兒遺傳篩檢，如針對(duì)黑人嬰兒的鐮刀血球細(xì)胞癥，猶太嬰兒的戴薩克斯癥等都已普遍實(shí)施。但在中國(guó)，由于遺傳病種類繁多，傳統(tǒng)遺傳篩檢方法需要較昂貴的儀器，專業(yè)人才，高費(fèi)用等，使我國(guó)在產(chǎn)前產(chǎn)后遺傳篩檢普及方面做得非常不夠。這對(duì)中國(guó)的可持續(xù)發(fā)展問(wèn)題，人口素質(zhì)提高問(wèn)題，社會(huì)保障負(fù)擔(dān)問(wèn)題都有非常深遠(yuǎn)的影響。舉例來(lái)說(shuō)，苯丙酮酸尿癥是由于肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏所致的常染色體隱性遺傳病?；颊哂捎诒奖彼崃u化酶缺乏或不足，造成苯丙氨酸不能按其正常代謝途徑轉(zhuǎn)化為酪氨酸，使得苯丙氨酸代謝物在體內(nèi)大量蓄積，損壞患者的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，而導(dǎo)致智力發(fā)育障礙。在歐美地區(qū)發(fā)病率為1/10000，在我國(guó)是1/16000。在產(chǎn)前遺傳篩檢和人工流產(chǎn)結(jié)合，控制遺傳病發(fā)病率最成功的事例是地中海地區(qū)對(duì)β地中海貧血癥的控制。地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血，是世界上最常見(jiàn)和發(fā)病率最高的一種單基因遺傳病。在地中海地區(qū)，美國(guó)黑人，東南亞，印度次大陸和中國(guó)南方(廣東，廣西，海南，貴州，四川等省)發(fā)病率較高。世界衛(wèi)生組織在1985年預(yù)測(cè)到本世紀(jì)末全世界將有7％的人口攜帶血紅蛋白病的遺傳基因。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料，廣東省α地中海貧血發(fā)病率5.15％，β地中海貧血3％；廣西省南寧地區(qū)α地中海貧血發(fā)病率14.9％，個(gè)別地區(qū)高達(dá)26％；海南省有些地區(qū)α地中海貧血發(fā)病率4.8％，β地中海貧血16.8～24.9％；香港α地中海貧血發(fā)病率3％，β地中海貧血6％；澳門(mén)α地中海貧血發(fā)病率6.2％，β地中海貧血3.4％等。由于目前對(duì)地中海貧血的治療沒(méi)有特效的方法，最根本的措施是產(chǎn)前診斷，杜絕患兒出生，以達(dá)到預(yù)防和優(yōu)生的目的。從1975年以來(lái)，地中海地區(qū)的塞浦路斯，意大利，Sardinia，和希臘成功地實(shí)施了產(chǎn)前遺傳篩檢和選擇性人工流產(chǎn)方法，現(xiàn)在地中海貧血的發(fā)病率顯著下降了5倍以上。
因?yàn)檫z傳病種類多，每種遺傳病所相關(guān)基因突變也多。傳統(tǒng)的遺傳病診斷方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且價(jià)格昂貴，不適合在中國(guó)進(jìn)行全國(guó)性的產(chǎn)前遺傳篩檢。在現(xiàn)有技術(shù)中，α和β地中海貧血癥，鐮刀性貧血癥，血紅細(xì)胞異常和6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏癥等遺傳性貧血的診斷主要是利用相關(guān)基因突變檢測(cè)和酶活性分析方法。疾病相關(guān)基因突變的檢測(cè)主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，該方法利用多種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同的基因序列將產(chǎn)生不同的電泳圖譜(Mercier，B.et al.，Eur.J.Immunogenetics，21，105，1994)。該方法只能應(yīng)用于當(dāng)突變改變了某一酶切位點(diǎn)時(shí)。該方法的改進(jìn)是在突變位點(diǎn)引入酶切位點(diǎn)法，即PCR-AIRS(attificial introduction of restrictionsites)(Cotton，R.G.H.Mut.Res.，285，125，1993)。(2)PCR-SSO(sequence specificoligonucleotide)或PCR-ASO(allele specific oligonucleotide)(Cotton，R.G.H.Mut.Res.，285，125，1993；Saiki，R.K.et al.，Nature，324，163，1986)，待測(cè)基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別與15-20bp標(biāo)記的野生型和突變型探針雜交。該方法需進(jìn)行同位素標(biāo)記或地高辛，生物素，過(guò)氧化物酶等標(biāo)記，分析過(guò)程復(fù)雜，不適宜快速分析。(3)PCR-SSP(sequence specific primers)或ASPCR(allele specific PCR)，其原理是根據(jù)已知突變位點(diǎn)的性質(zhì)在引物中設(shè)計(jì)一錯(cuò)配堿基，使之僅能擴(kuò)增突變型或野生型基因。該方法較為快速簡(jiǎn)便。(Wu，D.Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2757，1989；Rust，S.，et al.，Nucleic Acids Research，21，3623，1993；Newton，R.et al.，Nucleic Acids Research，17，2503，1989)。(4)PCR-SSCP(single-strandedconformation polymorphism)，SSCP是指單鏈DNA分子在中性PAGE中電泳遷移率隨其構(gòu)象改變的性質(zhì)。因此可作為基因變異的檢測(cè)方法，最早由Orita用于癌基因點(diǎn)突變和人基因組多態(tài)性研究(Orita，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766，1989)，此法僅能檢測(cè)基因變異的存在，而不能確定突變的部位和內(nèi)容。(5)DNA測(cè)序法，這是最直觀，最準(zhǔn)確的方法。但技術(shù)復(fù)雜價(jià)格昂貴，不能作為常規(guī)方法。
綜上所述，在有關(guān)疾病相關(guān)基因突變?cè)\斷的現(xiàn)有技術(shù)中，存在操作繁雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，成本較高，難以自動(dòng)化及大量樣本平行分析等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的是提供一種可同時(shí)檢測(cè)遺傳性貧血所有相關(guān)基因突變的診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的DNA芯片。
為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采取下列措施診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的DNA芯片，它是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定檢測(cè)遺傳性貧血相關(guān)基因突變的特異DNA探針，所說(shuō)的探針為β地中海貧血癥β(27-28)1TGG TGA GGC CCT GGG CAGβ(27-28)2GGT GAG GCC CCT GGG CAGβ(43)1 GGT TCT TTG AGT CCT TTβ(43)2 GGT TCT TTT AGT CCT TTβ(42＋T)2AGG TTC TTT TGA GTC CTIVS(2-1)1 CTT CAG GGT GAG TCTIVS(2-1)2 CTT CAG GAT GAG TCTβ(1)1ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTβ(1)2ACA GAC ACC AGG GTG CAC CTβ(8)1GAG GAG AAG TCT GCCβ(8)2TGA GGA GGT CTG CCGβ(8-9)2 AGG AGA AGG TCT GCCβ(37)1TAC CCT TGG ACC CAGβ(37)2TAC CCT TAG ACC CAGP(+40-43)1 GCA ACC TCA AAC AGA CAP(+40-43)2 AGC AAC CTC AGA CAC CAP(β31，IVS1)1 CAC CCT TAG GCT GCT GGP(IVS1)2 CCC ACC CTG AGG CTG CTβ(31)2 CCC TTA GGT GCT GGT GGP(cap＋1)1ATT GCT TAC ATT TGCP(cap＋1)2ATT GCT TCC ATT TGCβ(19)1 AAG GTG AAC GTG GATβ(19)2 AAG GTG AGC GTG GATβ(95＋A)1CTG TGA CAA GCT GCAβ(95＋A)2TGT GAC AAA GCT GCAIVS(2-5)1 AGG GTG AGT CTA TGGIVS(2-5)2 AGG GTG ACT CTA TGGβ(41-42)1CAG AGG TTC TTT GAG Tβ(41-42)2 CAG AGG TTG AGT CCT TIVS(2-654)1 GTT AAG GCA ATA GCAIVS(2-654)2 GTT AAG GTA ATA GCAβ(17)1 CTG TGG GGC AAG GTG AACβ(17)2 CTG TGG GGC TAG GTG AACβ(71-72)1TGC CTT TAG TGA TGGβ(71-72)2TGC CTT TAA GTG ATGβ(71-72)3TGC CTT TTA GTG ATGIVS(1-5)1CAG GTT GGT ATC AAGIVS(1-5)2CAG GTT GCT ATC AAGIVS(1-1)1TGG GCA GGT TGG TATIVS(1-1)2TGG GCA GTT TGG TATβ(30)2 CTG GGC GGG TTG GTAP(-28)1 GGG CAT AAG AGT CAGP(-28)2 GGG CAT AGG AGT CAGP(-29)2 TGG GCA TGG AAG TCAP(-30)1 CTG GGC ATA AAA GTCP(-30)2 CTG GGC ACA AAA GTCP(-31)2 GCT GGG CGT AAA AGTP(-32)2 GGC TGG GAA TAA AAGβ(14-15)1 TAC TGC CCT GTG GGG CAA GGβ(14-15)2 TAC TGC CCT GGT GGG GCA AGHbE(26)1 TGG TGG TGA GGC CCTHbE(26)2 TGG TGG TAA GGC CCTα地中海貧血癥，HbH，HbS，和HbM血紅蛋白異常Constant Spring突變P(cs)1 ATA CCG TTA AGC TGGP(cs)2 ATA CCG TCA AGC TGGQuong SZE突變P(qs)1 GCC TCC CTG GAC AAGP(qs)2 GCC TCC CCG GAC AAGHbS鐮刀形貧血突變P(hbs)1 ACT CCT GAG GAG AAGP(hbs)2 ACT CCT GTG GAG AAGDuan突變P(duan)1 GTG GAC GAC ATG CCCP(duan)2 GTG GAC GCC ATG CCCHbM突變P(hbm)1TAA GGG CCA CGG CAAP(hbm)2TAA GGG CTA CGG CAAP(hbm)3CGA CCT GCA CGC GCAP(hbm)4CGA CCT GTA CGC GCAP(hbm)5AAG AAA GTG CTC GGTP(hbm)6AAG AAA GAG CTC GGTP(hbm)7TGA GCT GCA CTG TGAP(hbm)8TGA GCT GTA CTG TGAP(hbm)9GAA GGC TCA TGG CAAP(hbm)10 GAA GGC TTA TGG CAA本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，在一顯微鏡載玻片大小的載體表面，固定70×4DNA探針，因此可同時(shí)檢測(cè)遺傳性貧血相關(guān)基因突變。具有平行分析和多重分析特點(diǎn)。特定的洗脫條件可以區(qū)分全配雜交和單堿基失配雜交。適合于早期診斷，產(chǎn)前篩查遺傳性貧血。同一芯片可同時(shí)檢測(cè)導(dǎo)致中國(guó)人種遺傳性貧血所有基因突變位點(diǎn)，如β地中海貧血癥，包括β41-42(-TCTT)，IVS2-654(C-T)，β17(A-T)，-28(A-G)，β71-72(+A或+T)，IVS1-5(G-C)，-30(T-C)，β14-15(+G)，IVS1-1(G-C)，HbE26(G-A)，β27-28(+C)，-29(A-G)，β43(G-T)，IVS2-1(G-T)，β1(T-G)，IVS(2-5)，β(30)，-31，-32，β(31)，cap＋1，β(19)，β(95＋A)，β(42＋T)，β(1)，β(8)，β(8-9)，+40-43，β(37)，β(31)突變；血紅蛋白異常的Constant Spring(T-C)，Quong SZE(T-C)，HbS(β6 A-T)，Duan(α75 A-C)，HbM(α58 C-T，α87 C-T，β68T-A，β93 C-T，β64 C-T)突變。開(kāi)發(fā)中國(guó)常見(jiàn)遺傳病診斷基因芯片將是最好的產(chǎn)前遺傳篩檢方法。設(shè)計(jì)中國(guó)最常見(jiàn)的幾種遺傳性貧血疾病，例如地中海貧血，血紅蛋白異常等的基因的中國(guó)發(fā)生率最高的幾種突變檢測(cè)探針，通過(guò)自動(dòng)化微控制技術(shù)將其按一定的陣列順序固定在芯片上，構(gòu)建中國(guó)常見(jiàn)遺傳性貧血診斷基因芯片。如果全國(guó)廣泛采用該技術(shù)進(jìn)行全面的產(chǎn)前遺傳篩檢，結(jié)合選擇性的人工流產(chǎn)，從而徹底杜絕嚴(yán)重影響身體健康的遺傳性貧血的出現(xiàn)，對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)，減輕社會(huì)家庭的負(fù)擔(dān)具有重要的意義。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。


圖1是遺傳性貧血診斷DNA專用芯片模式圖；圖2是檢測(cè)β14-15(+G)，突變的地中海貧血患者的結(jié)果模式圖；圖3是檢測(cè)β14-15(+G)突變的地中海貧血患者的雜交結(jié)果圖；圖4是檢測(cè)HbS鐮刀形貧血突變的患者的雜交結(jié)果圖。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的。將設(shè)計(jì)的特異性探針固定于一種載體如載玻片、硅片、膜和高分子材料表面。用表面陣列的特異性DNA探針雜交方法來(lái)檢測(cè)各種各種遺傳病基因的突變。探針設(shè)計(jì)選取遺傳性貧血相關(guān)基因突變中中國(guó)人最常見(jiàn)的基因突變?chǔ)碌刂泻Ｘ氀Y，包括β41-42(-TCTT)，IVS2-654(C-T)，β17(A-T)，-28(A-G)，β71-72(+A或+T)，IVS1-5(G-C)，-30(T-C)，β14-15(+G)，IVS1-1(G-C)，HbE26(G-A)，β27-28(+C)，-29(A-G)，β43(G-T)，IVS2-1(G-T)，β1(T-G)，IVS(2-5)，β(30)，-31，-32，β(31)，cap＋1，β(19)，β(95＋A)，β(42＋T)，β(1)，β(8)，β(8-9)，+40-43，β(37)，β(31)突變；血紅蛋白異常的Constant Spring(T-C)，Quong SZE(T-C)，HbS(β6 A-T)，Duan(α75 A-C)，HbM(α58 C-T，α87 C-T，β68 T-A，β93 C-T，β64 C-T)突變；合成相對(duì)應(yīng)得野生型和突變型DNA探針，固定于芯片表面。相關(guān)探針如下β地中海貧血癥β(27-28)1 TGG TGA GGC CCT GGG CAGβ(27-28)2 GGT GAG GCC CCT GGG CAGβ(43)1 GGT TCT TTG AGT CCT TTβ(43)2 GGT TCT TTT AGT CCT TTβ(42＋T)2AGG TTC TTT TGA GTC CTIVS(2-1)1 CTT CAG GGT GAG TCTIVS(2-1)2 CTT CAG GAT GAG TCTβ(1)1ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTβ(1)2ACA GAC ACC AGG GTG CAC CTβ(8)1GAG GAG AAG TCT GCCβ(8)2TGA GGA GGT CTG CCGβ(8-9)2 AGG AGA AGG TCT GCCβ(37)1TAC CCT TGG ACC CAGβ(37)2TAC CCT TAG ACC CAGP(+40-43)1 GCA ACC TCA AAC AGA CAP(+40-43)2 AGC AAC CTC AGA CAC CAP(β31，IVS1)1 CAC CCT TAG GCT GCT GGP(IVS1)2 CCC ACC CTG AGG CTG CTβ(31)2CCC TTA GGT GCT GGT GGP(cap＋1)1 ATT GCT TAC ATT TGCP(cap＋1)2 ATT GCT TCC ATT TGCβ(19)1AAG GTG AAC GTG GATβ(19)2AAG GTG AGC GTG GATβ(95＋A)1 CTG TGA CAA GCT GCAβ(95＋A)2 TGT GAC AAA GCT GCAIVS(2-5)1 AGG GTG AGT CTA TGGIVS(2-5)2 AGG GTG ACT CTA TGGβ(41-42)1 CAG AGG TTC TTT GAG Tβ(41-42)2 CAG AGG TTG AGT CCT TIVS(2-654)1GTT AAG GCA ATA GCAIVS(2-654)2GTT AAG GTA ATA GCAβ(17)1CTG TGG GGC AAG GTG AACβ(17)2CTG TGG GGC TAG GTG AACβ(71-72)1 TGC CTT TAG TGA TGGβ(71-72)2 TGC CTT TAA GTG ATGβ(71-72)3 TGC CTT TTA GTG ATGIVS(1-5)1 CAG GTT GGT ATC AAGIVS(1-5)2 CAG GTT GCT ATC AAGIVS(1-1)1 TGG GCA GGT TGG TATIVS(1-1)2 TGG GCA GTT TGG TATβ(30)2CTG GGC GGG TTG GTAP(-28)1 GGG CAT AAG AGT CAGP(-28)2 GGG CAT AGG AGT CAGP(-29)2 TGG GCA TGG AAG TCAP(-30)1 CTG GGC ATA AAA GTCP(-30)2 CTG GGC ACA AAA GTCP(-31)2 GCT GGG CGT AAA AGTP(-32)2 GGC TGG GAA TAA AAGβ(14-15)1 TAC TGC CCT GTG GGG CAA GGβ(14-15)2 TAC TGC CCT GGT GGG GCA AGHbE(26)1 TGG TGG TGA GGC CCTHbE(26)2 TGG TGG TAA GGC CCTα地中海貧血癥，HbH，HbS，和HbM血紅蛋白異常Constant Spring突變P(cs)1 ATA CCG TTA AGC TGGP(cs)2 ATA CCG TCA AGC TGGQuong SZE突變P(qs)1 GCC TCC CTG GAC AAGP(qs)2 GCC TCC CCG GAC AAGHbS鐮刀形貧血突變P(hbs)1 ACT CCT GAG GAG AAGP(hbs)2 ACT CCT GTG GAG AAGDuan突變P(duan)1 GTG GAC GAC ATG CCCP(duan)2 GTG GAC GCC ATG CCCHbM突變P(hbm)1TAA GGG CCA CGG CAAP(hbm)2TAA GGG CTA CGG CAAP(hbm)3CGA CCT GCA CGC GCAP(hbm)4CGA CCT GTA CGC GCAP(hbm)5AAG AAA GTG CTC GGTP(hbm)6AAG AAA GAG CTC GGTP(hbm)7TGA GCT GCA CTG TGAP(hbm)8TGA GCT GTA CTG TGAP(hbm)9GAA GGC TCA TGG CAAP(hbm)10 GAA GGC TTA TGG CAA遺傳性貧血診斷芯片的構(gòu)建合成以上DNA探針，5’末端用氨基或其它活性基團(tuán)修飾。每種探針重復(fù)3次固定于載體的活性表面，構(gòu)建遺傳性貧血診斷DNA專用芯片。
樣品處理用設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增待檢測(cè)樣品的靶的基因或突變區(qū)域，熒光標(biāo)記可以用PCR引物5’末端標(biāo)記或PCR擴(kuò)增時(shí)加入熒光標(biāo)記的dNTP。DNA芯片表面雜交過(guò)程熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在一定的條件下與遺傳性貧血診斷芯片表面的DNA探針雜交，用特定的洗脫條件可以區(qū)分全配雜交和單堿基失配雜交。
雜交信號(hào)檢測(cè)雜交后用共聚焦熒光顯微鏡或熒光掃描儀檢測(cè)DNA芯片雜交信號(hào)；從而可以檢測(cè)待測(cè)基因突變。
圖1為遺傳性貧血診斷DNA專用芯片模式圖。1玻片；220×3突變序列探針，從左到右是IVS1-5(G-C)，IVS1-1(G-C)，HbE26(G-A)，β27-28(+C)，β17(A-T)，β14-15(+G)，-28(A-G)，-29(A-G)，-30(T-C)，-31，-32，β1(T-G)，cap＋1，β(19)，β(8)，β(8-9)，+40-43，β(30)，β(31)，β(37)；320×3與2相對(duì)應(yīng)的正常序列探針；420×3突變序列探針，從左到右是β71-72(+A或+T)，β41-42(-TCTT)，β(42＋T)，β43(G-T)，IVS2-654(C-T)，IVS2-1(G-T)，IVS(2-5)，β(95＋A)；ConstantSpring突變，Quong SZE突變，HbS鐮刀形貧血突變，Duan突變，HbM突變的1，2，3，4，5，β41-42(-TCTT)，IVS2-654(C-T)。520×3與4相對(duì)應(yīng)的正常序列探針；圖2為檢測(cè)β14-15(+G)，突變的地中海貧血患者的結(jié)果模式圖。6β14-15(+G)突變位點(diǎn)信號(hào)。
圖3為檢測(cè)β14-15(+G)突變的地中海貧血患者的雜交結(jié)果圖。7和8正常序列信號(hào)；6β14-15(+G)突變位點(diǎn)信號(hào)。
圖4為檢測(cè)HbS鐮刀形貧血突變的患者的雜交結(jié)果圖。7和8正常序列信號(hào)；9HbS鐮刀形貧血突變位點(diǎn)信號(hào)。
DNA芯片表面雜交過(guò)程5μl雜交緩沖液(5×SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加于DNA陣列表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時(shí)。雜交信號(hào)檢測(cè)用共聚焦熒光顯微鏡或熒光掃描儀檢測(cè)DNA芯片雜交信號(hào)。結(jié)果如圖3。
DNA芯片表面雜交過(guò)程5μl雜交緩沖液(5×SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加于DNA陣列表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時(shí)。雜交信號(hào)檢測(cè)用共聚焦熒光顯微鏡或熒光掃描儀檢測(cè)DNA芯片雜交信號(hào)。結(jié)果如圖4。實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明在遺傳性貧血相關(guān)基因突變檢測(cè)方面的應(yīng)用的可行性。適合于早期診斷，產(chǎn)前篩查遺傳性貧血。
權(quán)利要求
1.一種診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的DNA芯片，其特征在于在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定檢測(cè)遺傳性貧血相關(guān)基因突變的特異DNA探針，所說(shuō)的探針為β地中海貧血癥β(27-28)1TGG TGA GGC CCT GGG CAGβ(27-28)2GGT GAG GCC CCT GGG CAGβ(43)1 GGT TCT TTG AGT CCT TTβ(43)2 GGT TCT TTT AGT CCT TTβ(42＋T)2AGG TTC TTT TGA GTC CTIVS(2-1)1 CTT CAG GGT GAG TCTIVS(2-1)2 CTT CAG GAT GAG TCTβ(1)1ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTβ(1)2ACA GAC ACC AGG GTG CAC CTβ(8)1GAG GAG AAG TCT GCCβ(8)2TGA GGA GGT CTG CCGβ(8-9)2 AGG AGA AGG TCT GCCβ(37)1TAC CCT TGG ACC CAGβ(37)2TAC CCT TAG ACC CAGP(+40-43)1 GCA ACC TCA AAC AGA CAP(+40-43)2 AGC AAC CTC AGA CAC CAP(β31，IVS1)1 CAC CCT TAG GCT GCT GGP(IVS1)2 CCC ACC CTG AGG CTG CTβ(31)2CCC TTA GGT GCT GGT GGP(cap＋1)1 ATT GCT TAC ATT TGCP(cap＋1)2 ATT GCT TCC ATT TGCβ(19)1AAG GTG AAC GTG GATβ(19)2AAG GTG AGC GTG GATβ(95＋A)1 CTG TGA CAA GCT GCAβ(95＋A)2 TGT GAC AAA GCT GCAIVS(2-5)1 AGG GTG AGT CTA TGGIVS(2-5)2 AGG GTG ACT CTA TGGβ(41-42)1 CAG AGG TTC TTT GAG Tβ(41-42)2 CAG AGG TTG AGT CCT TIVS(2-654)1GTT AAG GCA ATA GCAIVS(2-654)2GTT AAG GTA ATA GCAβ(17)1CTG TGG GGC AAG GTG AACβ(17)2CTG TGG GGC TAG GTG AACβ(71-72)1 TGC CTT TAG TGA TGGβ(71-72)2 TGC CTT TAA GTG ATGβ(71-72)3 TGC CTT TTA GTG ATGIVS(1-5)1 CAG GTT GGT ATC AAGIVS(1-5)2 CAG GTT GCT ATC AAGIVS(1-1)1 TGG GCA GGT TGG TATIVS(1-1)2 TGG GCA GTT TGG TATβ(30)2CTG GGC GGG TTG GTAP(-28)1 GGG CAT AAG AGT CAGP(-28)2 GGG CAT AGG AGT CAGP(-29)2 TGG GCA TGG AAG TCAP(-30)1 CTG GGC ATA AAA GTCP(-30)2 CTG GGC ACA AAA GTCP(-31)2 GCT GGG CGT AAA AGTP(-32)2 GGC TGG GAA TAA AAGβ(14-15)1 TAC TGC CCT GTG GGG CAA GGβ(14-15)2 TAC TGC CCT GGT GGG GCA AGHbE(26)1 TGG TGG TGA GGC CCTHbE(26)2 TGG TGG TAA GGC CCTα地中海貧血癥，HbH，HbS，和HbM血紅蛋白異常Constant Spring突變P(cs)1 ATA CCG TTA AGC TGGP(cs)2 ATA CCG TCA AGC TGGQuong SZE突變P(qs)1 GCC TCC CTG GAC AAGP(qs)2 GCC TCC CCG GAC AAGHbS鐮刀形貧血突變P(hbs)1 ACT CCT GAG GAG AAGP(hbs)2 ACT CCT GTG GAG AAGDuan突變P(duan)1 GTG GAC GAC ATG CCCP(duan)2 GTG GAC GCC ATG CCCHbM突變P(hbm)1TAA GGG CCA CGG CAAP(hbm)2TAA GGG CTA CGG CAAP(hbm)3CGA CCT GCA CGC GCAP(hbm)4CGA CCT GTA CGC GCAP(hbm)5AAG AAA GTG CTC GGTP(hbm)6AAG AAA GAG CTC GGTP(hbm)7TGA GCT GCA CTG TGAP(hbm)8TGA GCT GTA CTG TGAP(hbm)9GAA GGC TCA TGG CAAP(hbm)10 GAA GGC TTA TGG CAA
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種診斷遺傳性貧血相關(guān)基因突變的DNA芯片,其特征在于:在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定檢測(cè)遺傳性貧血相關(guān)基因突變的特異DNA探針。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,在一顯微鏡載玻片大小的載體表面,固定70×4DNA探針,因此可同時(shí)檢測(cè)遺傳性貧血如α,β地中海貧血癥,血紅蛋白異常等相關(guān)基因突變。具有平行分析和多重分析特點(diǎn)。特定的洗脫條件可以區(qū)分全配雜交和單堿基失配雜交。適合于早期診斷,產(chǎn)前篩查遺傳性貧血。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1335406SQ0010449
公開(kāi)日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2000年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月24日
發(fā)明者葉邦策 申請(qǐng)人:浙江江南生物科技有限公司