專利名稱：含s(主蛋白)和前s1(大蛋白)乙肝表面基因工程融合抗原的純化工藝的制作方法
我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，有50-70％的人群感染過HBV，10％的人群(1億多人)為帶毒者，目前還沒有治療的有效方法，接種疫苗是預(yù)防肝炎的有效措施。
1968年，美國(guó)科學(xué)家Prince等人在乙肝病人血清中發(fā)現(xiàn)了特異存在的乙型肝炎病毒抗原成分，1971年Kongman又利用HBsAg陽(yáng)性血清首次分離得到了HBsAg亞單位顆粒，1981年，利用慢性HBV攜帶者血清分離純化得到的乙型肝炎血源疫苗正式被批準(zhǔn)生產(chǎn)并用于人體免疫。
八十年代以來(lái)，基因工程技術(shù)的發(fā)展為新型乙肝疫苗的研究開辟了新途徑。1984年，DeWilde M[1]等人利用酵母細(xì)胞成功地表達(dá)了HBsAg并純化得到了HBsAg亞單位顆粒，并將其制成疫苗用于臨床實(shí)驗(yàn)，并獲得了很好的免疫效果。1986年，美國(guó)正式批準(zhǔn)默克(Merk)公司使用酵母菌生產(chǎn)的基因工程乙肝疫苗進(jìn)入市場(chǎng)，隨后，HBsAg在中華地鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中也得到了成功的表達(dá)并純化得到疫苗成品。
目前使用的乙型肝炎疫苗，無(wú)論是血源疫苗還是基因工程重組疫苗都只含有S蛋白的成分。有5-10％的人群對(duì)其反應(yīng)低下或無(wú)反應(yīng)[2]，這主要是由于抗原成分中缺少前S的抗原決定簇。Raul Raz[3，4]等人的研究表明，帶前S的HBV基因重組疫苗可克服人群中對(duì)S低反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)的現(xiàn)象，可以達(dá)到低劑量高反應(yīng)的效果，是很有希望的新型乙肝疫苗。
目前現(xiàn)有的血源疫苗的超離心純化法[5]并不適合于基因工程產(chǎn)品，而酵母細(xì)胞表達(dá)的乙肝表面抗原因?yàn)榘麅?nèi)表達(dá)因需破碎細(xì)胞等復(fù)雜工藝[6]也不適合于本抗原。我室已建立了CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝病毒主蛋白的純化工藝[7，8]，然而CHO細(xì)胞表達(dá)的S和前S1融合蛋白的純化工藝未見文獻(xiàn)報(bào)道。
本室已在CHO細(xì)胞中成功地表達(dá)了含S和前S1乙肝表面融合抗原，這個(gè)新型抗原與以往文獻(xiàn)報(bào)道的均不同，為了使用該抗原研制新型乙肝疫苗，首先要對(duì)該抗原的純化進(jìn)行研究，因此建立該抗原的分離純化工藝，就成了本發(fā)明的主要目的。
本發(fā)明以表達(dá)含S和前S1(S+S1)乙肝表面抗原的基因工程細(xì)胞系GdSS1-18#細(xì)胞培養(yǎng)上清液為原料，利用柱層析技術(shù)對(duì)S+S1的純化進(jìn)行研究，以建立能夠從含乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過層析技術(shù)分離純化乙肝表面抗原S和前S1的新工藝。
乙肝表面抗原S和前S1融合抗原(S+S1)，是在乙肝表面抗原226個(gè)氨基酸的羧基端加上了前S1第21到47位27個(gè)氨基酸形成的融合抗原，該抗原從我們已建立的GdSS1-18#基因工程細(xì)胞系(另申請(qǐng)專利)分泌表達(dá)，是一個(gè)新抗原，其理化性質(zhì)及生物學(xué)活性均與以前報(bào)道的乙肝表面抗原不同，因此分離純化工藝也可能會(huì)有明顯的不同。
含乙肝表面抗原S的層析工藝流程是我們建立的[8]，其基本特征是細(xì)胞培養(yǎng)液加硫酸銨處理→上疏水柱層析→脫鹽處理再行離子交換柱層析→濃縮后再過分子篩柱。我們對(duì)S+S1抗原的研究表明，該抗原與DEAE-Sepharose的結(jié)合能力較單純S抗原更強(qiáng)，需用更強(qiáng)的鹽濃度才能從該柱洗脫下來(lái)，例如，S抗原只能使用極低鹽濃度上柱才能吸附，在0.12M NaCl時(shí)S抗原就會(huì)從該柱上洗脫下來(lái)，而S+S1抗原結(jié)合能力強(qiáng)，洗脫鹽濃度高到0.41M NaCl，這就為建立新的分離純化工藝奠定了基礎(chǔ)?；谶@一特點(diǎn)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索，建立了使用含S+S1的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)離心去細(xì)胞殘?jiān)螅唤?jīng)任何調(diào)整，直接上樣離子交換柱進(jìn)行層析的工藝，并把它做為整個(gè)工藝的第一步。由于S+S1在離子交換柱上的洗脫鹽濃度高，原液鹽濃度約0.12M NaCl，在上樣時(shí)就去除了很多雜蛋白，這在S抗原是做不到的(其洗脫鹽濃度即為0.12MNaCl)，接著使用0.26-0.3M NaCl鹽洗柱可進(jìn)一步去除大量雜蛋白，因此在用0.39-0.41M NaCl洗脫S+S1時(shí)，可獲得相對(duì)較純的S+S1抗原，這樣就實(shí)現(xiàn)了原液大量、快速粗純化的目的。由于第一步獲得樣品相對(duì)較純，即總蛋白量相對(duì)較少，就大大提高了其后疏水柱的柱效。實(shí)驗(yàn)表明疏水柱的柱效提高了2-3倍，并進(jìn)而確定了S+S1分離純化工藝流程細(xì)胞培養(yǎng)原液→除渣后直接上樣離子交換柱層析→調(diào)電導(dǎo)后上樣疏水柱層析→濃縮后上樣分子篩柱層析。工藝流程各步具體條件如下1.樣品處理含S+S1抗原的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離心去除細(xì)胞殘?jiān)?℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.離子交換柱層析經(jīng)除渣的細(xì)胞分泌上清液上離子交換柱，介質(zhì)為DEAE-Sepharose，上樣量為離子交換柱介質(zhì)量的15倍。上樣后，記錄儀出現(xiàn)A峰，為未被吸附的雜蛋白峰，上樣完畢后以0.26-0.30M NaCl-20mM磷酸鹽緩沖液洗柱，洗脫的仍為雜蛋白。A峰完全洗脫完畢后以0.41M NaCl-20mM磷酸鹽緩沖液洗脫收集S+S1抗原B峰(


圖1)。以1MNaCl-20mM磷酸鹽緩沖液洗脫再生柱床。
3.疏水柱層析離子交換柱獲得的S+S1抗原B峰，進(jìn)一步經(jīng)疏水柱純化，介質(zhì)為Butty-S-Sepharose 6，上樣量為相當(dāng)于從疏水柱介質(zhì)體積50倍細(xì)胞培養(yǎng)原液中獲得的B峰量。先以7.5-8.5％硫酸銨-10mM磷酸鹽緩沖液(電導(dǎo)率45-48ms/cm室溫26℃-22℃)平衡柱床。樣品加硫酸銨調(diào)電導(dǎo)至45-48ms/cm(室溫26℃-22℃)后上樣，上樣時(shí)記錄儀上出現(xiàn)A峰為雜蛋白峰，上樣完畢后用柱床平衡液將A峰完全洗下，再以10mM磷酸鹽緩沖液洗脫收集S+S1抗原B峰(圖2)，以70％乙醇-10mM磷酸鹽緩沖液洗脫再生柱床。分子篩柱層析疏水柱獲得的S+S1抗原B峰，進(jìn)一步經(jīng)分子篩柱純化，介質(zhì)為Sepharose4FF。上樣總量為相當(dāng)于從分子篩柱介質(zhì)總量8-10倍的細(xì)胞培養(yǎng)原液中獲得的疏水柱B峰量。以0.15M NaCl-20mM磷酸鹽緩沖液平衡柱床，上樣體積為分子篩柱床體積的1/50-1/100。上樣后以0.15M NaCl-20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，大分子蛋白質(zhì)A峰被先洗脫下來(lái)，此峰不收集。收集含S+S1抗原的B峰(圖3)。
經(jīng)上述工藝流程純化的乙肝表面抗原S+S1外觀清澈透明，無(wú)沉淀。經(jīng)Lowery法定氮抗原回收率大于40％，純度大于95％(HPLC)。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果條帶與預(yù)期結(jié)果相同為p27 gp30，在分子量60KD左右的條帶是二聚體或多聚體。PAGE凝膠蛋白染色結(jié)果表明蛋白成球狀況良好，無(wú)小分子雜蛋白。牛血清殘留量檢測(cè)低于1ug/dose。細(xì)胞DNA含量小于100pg/dose。以上各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均符合檢定部門對(duì)乙型肝炎疫苗半成品的檢定要求。
權(quán)利要求
1.一種從表達(dá)乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的哺乳動(dòng)物基因工程細(xì)胞系培養(yǎng)液中分離純化乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白的工藝細(xì)胞培養(yǎng)原液→離子交換柱層析→疏水柱層析→分子篩柱層析。
2.根據(jù)權(quán)力要求1，細(xì)胞培養(yǎng)原液是指經(jīng)離心去除了細(xì)胞殘?jiān)暮幸腋伪砻婵乖璖和前S1融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)力要求1和2，離子交換柱層析的條件為細(xì)胞培養(yǎng)原液直接上樣離子交換層析柱，上樣液總體積與介質(zhì)體積比為15∶1，離子交換柱層析介質(zhì)為DEAE-Sepharose，上樣完畢后使用含0.26-0.30M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白A峰，洗至基線后使用含0.39-0.41M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
4.根據(jù)權(quán)力要求1，2和3，疏水柱層析的條件為從相當(dāng)于疏水柱介質(zhì)總量50倍的細(xì)胞培養(yǎng)原液所獲得的離子交換柱層析B峰量，獲得的B峰樣品在26℃-22℃加硫酸銨調(diào)電導(dǎo)至45-48ms/cm后，上樣疏水層析柱，疏水層析柱介質(zhì)為Butty-S-Sepharose 6，上樣前先用經(jīng)硫酸銨在26℃-22℃將電導(dǎo)調(diào)至45-48ms/cm的10mM磷酸鹽緩沖液平衡柱床，上樣完畢后使用同樣磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白A峰，洗至基線后使用10mM磷酸鹽緩沖液洗脫并收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
5.根據(jù)權(quán)力要求1，2，3和4，分子篩柱層析條件為疏水層析獲得的B峰樣品超濾濃縮后上樣分子篩柱，上樣總量為從相當(dāng)于分子篩柱介質(zhì)總量8-10倍的細(xì)胞培養(yǎng)原液所獲得的疏水層析B峰量，上樣體積為分子篩柱介質(zhì)總量的1/50-1/100，分子篩層析介質(zhì)為Sepharose 4FF，上樣完畢后用含0.15M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗柱，收集乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白B峰。
6.根據(jù)權(quán)力要求1，2，3，4和5，分子篩柱層析獲得的B峰含乙肝表面抗原S和前S1融合蛋白，純度大于95％，回收率大于40％。
全文摘要
工藝所屬技術(shù)領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)和蛋白質(zhì)純化本發(fā)明建立了哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO－dhfr－表達(dá)的含S和前S1乙肝表面融合抗原的純化工藝流程:細(xì)胞培養(yǎng)原液→離子交換柱層析→疏水柱層析→分子篩柱層析,該工藝乙肝表面抗原S1和前S蛋白回收率高,純度好,保持良好生物學(xué)活性,符合乙肝疫苗半成品檢定要求。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1277206SQ00105730
公開日2000年12月20日 申請(qǐng)日期2000年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月4日
發(fā)明者李軍, 阮力, 陳紅, 王文, 田淑芳, 楊芙蓉, 宗芳, 張陵林 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所