專(zhuān)利名稱(chēng)：天然折疊和分泌型蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在原核細(xì)胞中表達(dá)之后生產(chǎn)水溶性、天然折疊和分泌型多肽的方法。
在原核生物中蛋白質(zhì)的合成，也稱(chēng)之為轉(zhuǎn)譯，發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上。當(dāng)重組DNA在原核生物寄主中表達(dá)時(shí)，通常需要將這一過(guò)程中得到的重組基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)通過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜分泌到內(nèi)、外膜之間的周質(zhì)間隙中。例如，用滲透壓休克的方法，分泌型蛋白質(zhì)能夠從周質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是該外泌型多肽常常不能形成天然的、有生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)(Hockney，TIBTECH 12(1994)456-463；Baynex，Curr.Opin.Biotechnol，10(1999)411-421)。
近來(lái)，分子伴侶和折疊催化劑，諸如肽基-脯氨酰基-順/反式異構(gòu)酶或蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(Glockshuber etal.，EP-A0510658)被用于提高在體內(nèi)折疊時(shí)天然重組蛋白質(zhì)的得率(Thomas et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.66(1997)197-238)。在某些情況下，這可極大地改進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如，核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO；Goloubinoffet al.，Nature 337(1989)44-47)，人原膠原酶(Lee & olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852)或來(lái)自鼠的神經(jīng)氮氧化物合成酶(Roman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)8428-8432)的表達(dá)。在這些例子中來(lái)自大腸桿菌(E.Coli)的GroEL/ES或Dnak系統(tǒng)在胞質(zhì)中是共同過(guò)表達(dá)的。通常正效應(yīng)是提高所需要的可溶形式的蛋白質(zhì)的得率。
當(dāng)重組蛋白質(zhì)分泌到大腸桿菌周質(zhì)時(shí)，對(duì)伴侶蛋白質(zhì)(chaperones)的共表達(dá)進(jìn)行了考察。然而，這種情況下僅僅是評(píng)價(jià)胞質(zhì)伴侶蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)，以選擇最適分泌到周質(zhì)的條件(Perez-Perez et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.210(1995)524-529；Sato et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264；Berges et al.，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60)。以前在大腸桿菌中對(duì)共分泌的嘗試僅僅涉及折疊催化劑，比如，來(lái)自大腸桿菌的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI；Glockshuber etal.，EP-A 0510658)或肽基-脯氨?；?順/反式異構(gòu)酶或來(lái)自大腸桿菌E.Coli的Dsb蛋白質(zhì)(Knappik et al.，Bio/Technology 11(1993)77-83；Qiu et al.，Appl.Environm.Microbiol.64(1998)4891-4896 and Schmidtet al.，Prot.Engin，11(1998)601-607)。最近，周質(zhì)的Skp蛋白質(zhì)共過(guò)表達(dá)產(chǎn)生了更有效的折疊相顯現(xiàn)，而且抗體片段分泌到周質(zhì)的產(chǎn)率較高(Bothman and Pluckthun，Nat.Biotechnol.16(1998)376-380；Hayhurut andHarris，Prot.Expr.Purif.15(1999)336-343)。
為了使在原核細(xì)胞重組DNA在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)時(shí)所形成的不溶性聚集的蛋白質(zhì)(包函體)在體外復(fù)性，在方法中使用了諸如脲素、脲素衍生物、甲酰胺、乙酰胺或者L-精氨酸-類(lèi)化合物。L-精氨酸作為一種添加劑能夠極大改進(jìn)體外復(fù)性中天然折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)率(Rudolph et al.，US-Patent No.5,593,865；Buchner & Rudolph，Bio/Technology 9(1991)157-162；Brinkmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89(1992)3075-3079；Lin& Traugh，Prot.Express.Purif.4(1993)256-264)。
本發(fā)明的目的是提供一種在原核生物表達(dá)后生產(chǎn)水溶性的、天然折疊的真核多肽的方法。該方法簡(jiǎn)便易行以及在體外后處理，諸如溶解、包函體的還原和復(fù)性、還原和復(fù)性時(shí)勿需費(fèi)力。
采用原核生物細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)含有通過(guò)二硫鍵連接的二個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸水溶性的、天然折疊的真核生物多肽的方法達(dá)到了本發(fā)明的目的，a)其中所說(shuō)的原核細(xì)胞含有編碼所說(shuō)的在N-末端含有原核生物的信號(hào)序列的多肽的一個(gè)表達(dá)載體，b)在所說(shuō)的多肽分泌到周質(zhì)或培養(yǎng)基中的條件下，c)切除信號(hào)序列，并從周質(zhì)或培養(yǎng)基中分離這種多肽。
其中該培養(yǎng)是在有精氨酸或通式(I)的一種化合物存在下進(jìn)行的。
R2-CO-NRR1(I)其中R和R1代表氫或一種飽和的或不飽和的支鏈或直鏈C1-C4烷基鏈和R2代表氫、NHR1或飽和的或不飽和的支或直鏈C1-C3烷基鏈。精氨酸或通過(guò)(I)的化合物的濃度優(yōu)選至少0.1mol/l，只要確保精氨酸和所說(shuō)化合物溶解度，也可考慮多加。精氨酸或通式(I)的化合物優(yōu)選使用的濃度范圍是0.1-1.5mol/l。
作為通式(I)的化合物，甲酰胺、乙酰胺、脲素或諸如乙酰脲素或甲酰脲素的脲素衍生物被優(yōu)選地加入培養(yǎng)原核生物細(xì)胞的培養(yǎng)基中。精氨酸為例，可作為鹽酸鹽的形式被使用或者作為另一種精氨酸堿基滴定的形式被使用。無(wú)論如何，L-精氨酸是被優(yōu)選使用的，特別是L-精氨酸鹽酸鹽的形式。
在按本發(fā)明方法的一優(yōu)選實(shí)施例方案中，含有SH的硫醇還原劑被額外加入到原核生物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，用于進(jìn)一步提高重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)得率。硫醇試劑優(yōu)選添加量是0.1-15mmol/l。按照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“硫醇試劑”，可以是一種具有SH基團(tuán)的還原劑(還原后的)，或者是具有SH基團(tuán)的還原劑和具有二硫化物基團(tuán)的氧化劑的混合物。優(yōu)選的物質(zhì)是還原的和氧化的谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱胺、β-巰基乙醇和類(lèi)似化合物。硫醇試劑可以單獨(dú)或以混合物的形式使用。硫醇試劑，如每個(gè)分子含有一個(gè)SH基團(tuán)的谷胱甘肽(GSH)是特別合適的。當(dāng)重組DNA在原核生物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，諸如谷胱甘肽的硫醇試劑已知能夠改進(jìn)天然折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。(Glockshuber et al.，EPA0510658)。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分子伴侶蛋白額外地過(guò)表達(dá)和共分泌。按本發(fā)明，伴侶蛋白應(yīng)被理解為一種蛋白質(zhì)，它保護(hù)其它非天然蛋白質(zhì)在體內(nèi)避免聚集而且促進(jìn)它們天然構(gòu)型的形成。在已有技術(shù)中，伴侶蛋白被用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，這樣可以保持蛋白質(zhì)避免聚集和失活(Buchner et al.，EP-A0556726A1)。
優(yōu)選使用依賴ATP的侶伴蛋白HSP40型(分子量大約40kDa)或一種小的熱休克蛋白(sHSP)。DnaJ是在原核生物大腸桿菌中存在的一種40kDa熱休克蛋白，而且是所謂的Hsp70侶伴蛋白系統(tǒng)的一部分(Bukau，B.& Horwich，A.，Cell 92(1998)351-366)。DnaK(Hsp70)和GrpE也屬于這一系統(tǒng)。特定的一些蛋白質(zhì)通過(guò)Dnak系統(tǒng)以依賴ATP的方式被折疊成天然的構(gòu)型(Schroder et al.，.EMBO J.12(1993)4137-4144；Langer et al.，Nature 356(1992)683-689)。在缺少Dnak和ATP時(shí)DnaJ保護(hù)非天然的蛋白質(zhì)避免蛋白的聚集并介導(dǎo)具有折疊能力的狀態(tài)(Schroderet al.，EMBO J.12(1993)4137-4144)。
已有實(shí)驗(yàn)顯示，在胞質(zhì)中DnaJ的共表達(dá)可導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)率提高(Yokoyama et al.，Microbial.Ferment.Technol.62(1998)1205-1210)。特別優(yōu)選DnaJ的N-末端片段的共分泌，它含有第1-108位氨基酸，下文被稱(chēng)作J區(qū)域(kelley.TIBS23(1998)222-227)。該J區(qū)域和一個(gè)負(fù)責(zé)與DnaK相互作用的G/F富集區(qū)位于這一區(qū)段中(Wall et al.，J.Biol.Chem.270(1995)2139-2144)。
Hsp25(例如，來(lái)自于鼠)是小的熱休克蛋白質(zhì)的一個(gè)代表(Gaestel etal.，Eur.J.Biochem.179(1989)209-213)，它是一類(lèi)普遍存在的蛋白質(zhì)伴侶。這些蛋白質(zhì)的分子量是在15和30KDa之間。在熱休克期間，細(xì)胞中的sHsp有相當(dāng)多的積累(占總細(xì)胞蛋白的1％-Arrigo & Landry(1994)，In Morimoto(Hrsg.)The Biology of Heat Shock Proteins & MolecularChaperones，Cold Spring Harbour Press，335-373)。類(lèi)似DnaJ蛋白質(zhì)，sHsp具有防止非天然蛋白質(zhì)聚集和保持這些蛋白質(zhì)處于具有折疊能力的狀態(tài)的性質(zhì)(Jakob et al.，J.Biol.Chem.268(1993)1517-1520；Ehrsperger et al.，EMBO J.16(1997)221-229)。
本發(fā)明中的“過(guò)表達(dá)”是指分泌蛋白質(zhì)，例如DnaJ和Hsp25，與在各自的野生型原核生物寄主中的表達(dá)相比提高(優(yōu)選至少提高100％)。這種過(guò)表達(dá)可以是在，例如，當(dāng)這些基因(蛋白質(zhì)、侶伴蛋白質(zhì)和/或信號(hào)肽的基因)是由一種強(qiáng)的原核生物的，優(yōu)選可誘導(dǎo)的，表達(dá)信號(hào)(例如，lac或T7啟動(dòng)子或其衍生物)的控制下達(dá)到的。
用于多肽(蛋白質(zhì))過(guò)表達(dá)的分泌構(gòu)建體包括重組DNA的調(diào)節(jié)區(qū)(啟動(dòng)子和終止子)，它最好被整合到一個(gè)額外編碼在原核生物少有的精氨酸-tRNAAGA/AGG的一個(gè)載體上，或者它與編碼這種tRNA的一個(gè)載體共表達(dá)(Brinkmann et al.，Gene 85(1989)109-114)。這樣能夠使表達(dá)的各個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)和使稀有的tRNAArgAGA/AGG轉(zhuǎn)錄，這通常導(dǎo)致細(xì)菌寄主中所需要的蛋白質(zhì)合成的提高。
在本發(fā)明的意義上的原核生物的信號(hào)序列應(yīng)被理解是一種核酸片段，它來(lái)自原核生物，優(yōu)選來(lái)自格蘭氏陰性細(xì)菌，并保證連到信號(hào)肽的蛋白質(zhì)能夠穿過(guò)細(xì)菌的內(nèi)膜。其結(jié)果，蛋白質(zhì)位是在周質(zhì)中或者是在細(xì)胞的上清液中。通常，這樣的信號(hào)序列有18-30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，例如在Murphy & Beckwith大腸桿菌的細(xì)胞包膜的蛋白質(zhì)輸出，Neidhardt等(編者)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌(Escherichia coli and Salmonella)，SecondEdition Vol.l，ASM Press，Washington，1996，第967-978頁(yè)中的描述。細(xì)菌信號(hào)序列的切除可以，例如，發(fā)生在Ala-x-Ala序列之后(Von Heiineet al.，J.Mol.Biol.184(1985)99-105)。Paetzel在自然(Nature)396(1998)186-190)上描述了細(xì)菌信號(hào)肽酶的結(jié)構(gòu)。被使用的信號(hào)序列優(yōu)選由原核細(xì)胞周質(zhì)中的蛋白酶從需要的蛋白質(zhì)被再次切除。或者這些蛋白酶可被加入細(xì)胞上清或加入分離的蛋白質(zhì)來(lái)切下信號(hào)序列。
本發(fā)明的方法能夠改進(jìn)許多真核蛋白質(zhì)的異源表達(dá)，例如蛋白酶，干擾素，蛋白質(zhì)荷爾蒙，抗體或其片段。該方法特別適合在天然狀態(tài)下至少有二個(gè)半胱氨酸通過(guò)二硫鍵連結(jié)的異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，尤其是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沒(méi)有原核信號(hào)序列融合在N-末端，而且在它們的原核表達(dá)時(shí)形成不溶性的包函體時(shí)。該方法特別適合在天然狀態(tài)下含有五個(gè)以上的二硫鍵的蛋白質(zhì)。這樣一種蛋白質(zhì)是，例如，一種重組的纖溶酶原激活物(下列稱(chēng)為rPA，Martin et al.，Cardiovasc.Drug Rev.11(1993)299-311，US-Patent Nr.5,223,256)。rPA有9個(gè)在大腸桿菌還原胞質(zhì)中不能形成的二硫鍵。
蛋白質(zhì)和任選的伴侶蛋白質(zhì)在周質(zhì)中的定位是通過(guò)與信號(hào)肽有效地連接來(lái)保證的，使其穿過(guò)細(xì)菌的內(nèi)膜。
L-精氨酸濃度為0.4mol/l，谷胱甘肽為5mmol/l(在DnaJ，J區(qū)域，Hsp25和scFv的共分泌的情況下)或L-精氨酸為0.4mol/l，沒(méi)有谷胱甘肽(沒(méi)有DnaJ共分泌)的條件已被證實(shí)對(duì)這種纖溶酶原激活物的表達(dá)最為適合。
為了從大腸桿菌中分離功能形式的分泌rPA蛋白，通過(guò)基因工程的方法將來(lái)自質(zhì)粒pA27fd7的這種蛋白基因(Kohnert et al.，蛋白質(zhì)工程5(1992)93-100)融合到革蘭氏陰性細(xì)菌的原核生物的信號(hào)序列上，例如，融合到來(lái)自Erwinia carotovora的果膠酸裂解酶B(PelB)的信號(hào)序列上?；蛉诤鲜峭ㄟ^(guò)克隆到pET20b(+)載體上構(gòu)建成的(Novagen Inc.，Madison，USA)。結(jié)果，基因表達(dá)是在T7啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行。存在于融合蛋白上的信號(hào)序列介導(dǎo)蛋白質(zhì)向周質(zhì)中的分泌。在分泌期間或分泌后，信號(hào)肽被位于內(nèi)膜的肽酶切除。然后這樣分泌的蛋白質(zhì)能夠在周質(zhì)中折疊。這一空間中的氧化條件能夠使二硫鍵形成(Wuelting andPluckthun，Mol.Microbiol.12(1994)685-692)。創(chuàng)造性地在培養(yǎng)基中加入改善蛋白質(zhì)折疊的低分子量的添加物和硫醇試劑以及在周質(zhì)中同時(shí)共表達(dá)DnaJ，J區(qū)域或者Hsp25能使功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)量成百倍以上地提高。
本發(fā)明的另外一些多肽的例子是抗體或抗體片段，例如，單鏈Fv片段(scFv，例如抗促甲狀腺激素，TSH)。ScFv是一種截短的抗體，它只有抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Fv)組成，它通過(guò)一段短肽連接物(通常是Gly4Ser3)人工融合(Hudson，Curr.Opin Biotechnol.9(1998)395-402)。通常ScFv對(duì)抗原具有與親本Fv鏈相同的親合力，但可以在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)。由于它們具有穩(wěn)定性的內(nèi)區(qū)二硫健，這對(duì)其穩(wěn)定性是必需的，所以通常在胞質(zhì)中表達(dá)導(dǎo)致包函體形成(Shibui et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.37(1992)352-257)。用隨機(jī)誘變和隨后的噬菌體顯示選擇可對(duì)用于結(jié)合所需抗原的ScFv進(jìn)行特別的優(yōu)化(Allen et al.，TIBS20(1995)511-516；Hoogenboom et al.，Immunotechnology 4(1998)1-20)。與不加添加物的培養(yǎng)相比，添加5mM GSH和0.4M L-精氨酸能使功能性ScFv-TSH在周質(zhì)中的產(chǎn)量提高7倍，在培養(yǎng)基的上清液中提高43倍。
通過(guò)下列實(shí)施例、出版物、序列表和圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明，保護(hù)的范圍由權(quán)利要求限定。所描述的方法應(yīng)被理解為示例性的，即使進(jìn)行一些變化后仍然描述本發(fā)明的主題。
序列描述SEQ ID NO1和2表示編碼由OmpA信號(hào)序列和DnaJ以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ的部分的序列，它是從pIN III ompA3-dnaJ擴(kuò)增到的。
SEQ ID NO3和4表示編碼由OmpA信號(hào)序列和J區(qū)域以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-J區(qū)域的部分的序列，它是從pIN III ompA3-dnaJ擴(kuò)增到的。
SEQ ID NO5和6表示編碼由OmpA信號(hào)序列和Hsp25以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-Hsp25的部分的序列，它是從pIN III ompA3-hsp25擴(kuò)增到的。
SEQ ID NO7和8表示編碼由PelB信號(hào)序列和scFvOxazolon以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-scFvOx的部分的序列，它是從pHEN-scFv或pIN III ompA3擴(kuò)增到的。
SEQ ID NO9和10表示編碼由PelB信號(hào)序列和rPA組成的融合蛋白質(zhì)的pET20b(+)-rPA表達(dá)質(zhì)粒的部分的序列。
圖的描述
圖1表示在含有5mM GSH的大腸桿菌周質(zhì)中天然rPA的表達(dá)對(duì)L-精氨酸的濃度的依賴性，和各種共發(fā)泌構(gòu)建體。
圖2表示當(dāng)與DnaJ共分泌和當(dāng)培養(yǎng)基中加入5 mM GSH和改進(jìn)折疊的各種低分子量物質(zhì)時(shí)，rPA在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞周質(zhì)中的表達(dá)的比較。
圖3表示質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ表達(dá)的示意圖。
圖4表示質(zhì)粒pUBS520-pIN-J-區(qū)域表達(dá)的示意圖。
圖5表示質(zhì)粒pUBS520-pIN-hsp25表達(dá)的示意圖。
圖6表示質(zhì)粒pUBS520-scFvOx表達(dá)的示意圖。
圖7表示質(zhì)粒pET20b(+)-rPA表達(dá)的示意圖。
圖8表示周質(zhì)和培養(yǎng)基中含有5mM GSH的條件下，功能性scFv-TSH的表達(dá)對(duì)L-精氨酸濃度的依賴性。
為了在大腸桿菌周質(zhì)中過(guò)表達(dá)DnaJ，J-區(qū)域和Hsp25，編碼這些蛋白質(zhì)的DNA通過(guò)基因工程方法被融合到大腸桿菌外膜蛋白質(zhì)A(OmpA)的信號(hào)序列上，在lac-lpp啟動(dòng)子的控制下重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白。結(jié)果DnaJ和Hsp25的多肽鏈被輸送到原核生物寄主的周質(zhì)，并在此自然折疊。通過(guò)胰蛋白酶有限水解和Western Blot測(cè)定它們的定位和天然折疊的狀況。
實(shí)施例一表達(dá)質(zhì)粒pIN III ompA3-dnaJ的構(gòu)建分子遺傳技術(shù)是根據(jù)Ausubel et al.，(ed.)，J.Wiley & Sons，1997，Curr，Protocols of Molecular Biology。寡核苷酸得自MWG Biotech，Ebersberg或GIBCO Life Science公司，Eggenstein，DE。
編碼Dnaj，Gene Bank Accession No.M12565，的基因通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增并借助由此產(chǎn)生的限制性切點(diǎn)EcoR1和BarmH1克隆到表達(dá)質(zhì)粒pIN III ompA3(Ghayreb et al.，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。通過(guò)雙脫氧序列分析確證了克隆的PCR片段的序列(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)。產(chǎn)生的質(zhì)粒定名為pIN III ompA3-dnaJ。在周質(zhì)中表達(dá)的DnaJ序列不同于野生型蛋白的序列，該多肽序列上是以Gly-Ile-Pro而不是Met開(kāi)始的，因此，在N-末端有二個(gè)氨基酸延伸。由此，DnaJ的表達(dá)是在lac-lpp啟動(dòng)子的控制下，它用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)。
實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ的構(gòu)建借助于PCR擴(kuò)增了編碼lac-lpp操縱子，信號(hào)序列，dnaJ基因和操縱子終止子的質(zhì)拉pIN III ompA3-dnaJ的區(qū)域(SEQ ID NO1)。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BgIII酶切，然后克隆到用限制性內(nèi)切酶BamHI線性化的pUBS520載體上。產(chǎn)生的質(zhì)粒定名為pUBS520-pIN-dnaJ(圖3)。
實(shí)施例3表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-J-區(qū)域的構(gòu)建通過(guò)QuikChange突變系統(tǒng)(promega，Mannheim，DE)處理，二個(gè)終止密碼子被插入到質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ的324核苷酸之后，以至于使僅僅開(kāi)始的108個(gè)氨基酸被表達(dá)。通過(guò)雙脫氧序列分析(LiCorDNA-Seguencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)測(cè)定了序列的突變區(qū)。用Westernblotting和抗-DnaJ抗體的方法檢測(cè)了截短了的蛋白質(zhì)片段的表達(dá)。所形成的質(zhì)粒定名為pUBS520-pIN-J-區(qū)域(圖4)。
實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒pIN III ompA3-hsp25的構(gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼Hsp25基因(Gent Bank Accession NoL07577)以及通過(guò)由此產(chǎn)生的限制性酶切位點(diǎn)EcoR1和BamH1克隆到表達(dá)質(zhì)粒pIN III ompA3(Ghayreb et al.，EMBO J.3(1984)2437-2442)。用雙脫氧序列分析(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)核對(duì)克隆的PCR片段的序列。產(chǎn)生的質(zhì)粒定名為pIN III ompA3-hsp25。在周質(zhì)中表達(dá)的Hsp25序列不同于野生型蛋白質(zhì)，該多肽序列是以Gly-Ile-Leu而不是met開(kāi)始的，因此N-端有二個(gè)氨基酸延伸。因此，Hsp25是在lac-lpp的啟動(dòng)子控制下，它受IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)。
實(shí)施例5表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-hsp25的構(gòu)建通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增編碼lac-lpp操縱子，信號(hào)序列，hsp25基因和操縱子的終止子區(qū)域的來(lái)自質(zhì)粒pIN III ompA3-hsp25的區(qū)域(序列No.5)。用限制性內(nèi)切酶BglII切PCR產(chǎn)物然后克隆到用限制性內(nèi)切酶BamH1處理為線性的pUBS520載體上。產(chǎn)生質(zhì)粒定名為pUBS520-pIN-hsp25(圖5)。
實(shí)施例6表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-scFvOx的構(gòu)建針對(duì)半抗原惡唑酮(scFvOxazolon；Fiedler and Conrad，Bio/Technology 13(1995)1090-1093)(它沒(méi)有侶伴蛋白的性質(zhì))的一種單鏈Fv片段抗體的共表達(dá)在檢測(cè)中作為負(fù)對(duì)照。
通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增來(lái)自質(zhì)粒pHEN-scFvOx的編碼lac啟動(dòng)子，信號(hào)序列peIB和scfvox基因的區(qū)域。通過(guò)第二個(gè)PCR擴(kuò)增編碼lpp終止子的來(lái)自質(zhì)粒pIN III ompA3的區(qū)域。通過(guò)下一個(gè)PCR中融合這二個(gè)片段。以這種方式形成的PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO7)用限制性內(nèi)切酶BglII切開(kāi)，而且將其克隆到用限制性內(nèi)切酶BamH1處理成線性的載體pUBS520上。產(chǎn)生的質(zhì)粒定名為pUBS520-scFvOx(圖6)。
實(shí)施例7表達(dá)質(zhì)粒pET 20b(+)-rPA的構(gòu)建借助PCR的方法，擴(kuò)增來(lái)自質(zhì)粒載體pA27fd7(Kohnert et al.，proteinEngineering 5(1992)93-100)的血纖維蛋白溶酶原激活因子(rPA)的基因。用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI切開(kāi)PCR產(chǎn)物，然后克隆到質(zhì)粒載體pET20b(+)(Novagen Inc.，Madison，USA)上。質(zhì)粒編碼一種由PelB的信號(hào)序列(取自Erwinia Carotovova果膠酸裂解酶)和rPA組成的融合蛋白，用雙脫氧測(cè)序法(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech.Ebersberg.DE)檢查rPA向周質(zhì)中的分泌。構(gòu)建的質(zhì)粒定名為pET20b(+)-rPA(圖7)。rPA在T7啟動(dòng)子的控制下從質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，在大腸桿菌BL21(DE3)中的T7-RNA聚合酶受LacUV5啟動(dòng)子調(diào)控。加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。在周質(zhì)中表達(dá)的rPA不同于Kohnert et al.描述過(guò)的血纖維蛋白溶酶原，其中第二個(gè)氨基酸絲氨酸(Ser)是被丙氨酸(Ala)取代。
實(shí)施例8采用培養(yǎng)基添加劑谷胱甘肽和L-精氨酸，rPA在大腸桿菌的周質(zhì)中的功能表達(dá)對(duì)用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共分泌)轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌BL21(DE3)(studier & Moffat，J.Mol.Biol.189(1986)113-130)進(jìn)行靜止過(guò)夜培養(yǎng)、對(duì)用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-J-區(qū)域(J-區(qū)域的共分泌)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)、對(duì)用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-hsp25(Hsp25的共分泌)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL 21(DE3)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)、對(duì)用pET20b(+)-rpA和pUBS520-scFvOx(scFvOx的共分泌)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL 21(DE3)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)、對(duì)用pET20b(+)-rpA和pUBS520轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL 21(DE3)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)、或?qū)τ胮ET20b(+)和pUBS520(對(duì)照培養(yǎng))轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，將其按1∶50的比率稀釋在100ml含有氨芐青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml，F(xiàn)luka Chemica，Neu-Ulm，DE)的LB-培養(yǎng)基中，在24℃搖動(dòng)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。培養(yǎng)3小時(shí)后，取5ml等份加到10ml的含有前述量的氨卞青霉素、卡那霉素和不同濃度的GSH(0-10mM，F(xiàn)luka，DE)和L-精氨酸鹽酸鹽(0-0.4M，ICN)LB培養(yǎng)基中，而且每份都用1 mM IPIG(異丙基-β-D-硫醇半乳糖苷，AppliChem，Darmstadt，DE)誘導(dǎo)。細(xì)胞在24℃，170rpm進(jìn)一步搖動(dòng)培養(yǎng)21小時(shí)，取1ml樣品在OD600下進(jìn)行測(cè)定。這些1ml的細(xì)胞樣品按照J(rèn)acoli et al.(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)修改的方法在2ml Eppendorf反應(yīng)管中分級(jí)。將詳細(xì)地說(shuō)，在細(xì)胞團(tuán)中加入500μl分級(jí)緩沖液(150mM NaCl(Roth GmbH)，50mM Tris/HCl(Roth GmbH)，5mM EDTA(Biomol)和1mg/ml多粘菌素B硫酸鹽(Sigma)，pH7.5)，用Eppendorf振蕩器，在1400rpm，10℃振蕩1小時(shí)，然后，在10℃用低溫Eppendorf小型離心機(jī)，10℃，14000rpm離心15分，形成一個(gè)含有可溶的周質(zhì)蛋白(上清)和一種殘留的組分(沉淀)的分級(jí)。
rpA的活性是按照Verheijen et al.Thromb.Haemostasis 48(1982)266-269的方法測(cè)定的。
為了校準(zhǔn)不同緩沖液測(cè)定發(fā)生的誤差，所有細(xì)胞抽提液測(cè)定的rPA濃度被統(tǒng)一在細(xì)胞懸浮液OD600等于1。
實(shí)施例9用甲酰胺、甲基甲酰胺、乙酰胺、甲基脲素和乙基脲素作為培養(yǎng)添加劑與谷胱甘肽形成的混合物，在大腸桿菌的周質(zhì)中rPA的功能性表達(dá)用pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共分泌)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL 21(DE3)的靜止過(guò)夜培養(yǎng)是按實(shí)施例8所述的方法進(jìn)行的。在培養(yǎng)基中還要加入式I化合物和每種情況都含5mM谷胱甘肽。在沒(méi)有添加劑的LB中進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)。表1中列出了式I化合物和使用的濃度。樣品的制備，周質(zhì)的分級(jí)分離和酶測(cè)定rPA活性是按照實(shí)施例8所述的方法進(jìn)行的。
表1和表2以及
圖1和圖2表示rPA表達(dá)的結(jié)果。表1 L-精氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)周質(zhì)中的天然rPA產(chǎn)量的影響
培養(yǎng)是在含有5mM GSH條件下進(jìn)行的。表2 各種低分子量添加物在培養(yǎng)基中對(duì)大腸桿菌周質(zhì)有關(guān)天然rPA產(chǎn)量的影響
<p>實(shí)施例10培養(yǎng)基加入還原谷胱甘肽和L-精氨酸后功能性單鏈Fv片段的表達(dá)一種過(guò)夜培養(yǎng)的用編碼抗TSH抗體(US-patent No.5,614,367)的單鏈Fv片段和pUBS520(Brinkmann et al.，Gene 85(1989)109-114)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌培養(yǎng)液，在100ml含有氨卞青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml，F(xiàn)luka Chemica，Neu-Ulm，DE)的LB培養(yǎng)基按1∶50比例稀釋?zhuān)缓笤?4℃，170rpm振動(dòng)培養(yǎng)。生長(zhǎng)3小時(shí)后，取5ml等分培養(yǎng)液加入含有前述含量的氨卞青霉素和卡那霉素和各種濃度的GSH(0-10mM，F(xiàn)luka)和L-精氨酸HCl(0-0.4M，ICN)的LB培養(yǎng)基中，而且每一個(gè)用1mM IPTG(異丙基-β-D-硫醇半乳糖苷，AppliChem，Darmstadt))誘導(dǎo)。細(xì)胞還要在24℃，170rpm條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)21小時(shí)，取1ml樣品接著用OD600測(cè)定。這些1ml的樣品按照J(rèn)acobi et al.，(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)(見(jiàn)實(shí)施例8)修改的方法在2ml的Eppendorf反應(yīng)管中分級(jí)。另外取1ml培養(yǎng)基上清樣品。這些樣品通過(guò)ELISA測(cè)定分析它們的功能抗體。
天然的scFv-TSH與TSH的結(jié)合是用scFv-TSH標(biāo)準(zhǔn)校驗(yàn)的，它是通過(guò)RPAS-系統(tǒng)純化了的(pharmacia Biotech，Germany)，(一個(gè)單位相應(yīng)于1μl標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合到用TSH包被的微滴定板上)。培養(yǎng)基加入L-精氨酸對(duì)周質(zhì)和大腸桿菌培養(yǎng)基上清中有關(guān)天然的scFv-TSH的產(chǎn)量也有正影響。加入0.4M L-精氨酸和5mM GSH與5mM GSH的培養(yǎng)相比能夠使得通過(guò)ELISA檢測(cè)的抗體片段在培養(yǎng)基上清液中的量增加7倍，在周質(zhì)的部分增加43倍(圖8)。參考文獻(xiàn)Allen et al.，生物化學(xué)趨勢(shì)(TIBS)20(1995)511-516Arrigo & Landry(1994)In Morimoto(Hrsg.)熱休克蛋白質(zhì)和分子伴侶的生物學(xué)(TheBiology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones)，Cold Spring Harbour Press，335-373Ausubel et al.(Hrsg.)現(xiàn)代分子生物學(xué)(Current Protocols in Molecular Biology)，J.Wiley& Sons.1997Baynex，生物技術(shù)新見(jiàn)(Curr.Opin.Biotechnol.)10(1999)411-421Berges et al.，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)62(1996)55-60Bothman and Plückthun，自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)16(1998)376-380Brinkmann et al.，基因(Gene)85(1989)109-114Brinkmann et al.，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci)USA 89(1992)3075-3079Buchner & Rudolph，生物/工藝學(xué)(Bio/Technology)9(1991)157-162Bukau，13.& Horwich，A.，細(xì)胞(Cell)92(1998)351-366Ehrsperger et al.，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)志(EMBOJ.)16(1997)221-229ER-A 0510 658ER-A 0 556 726Fiedler arid Conrad，生物/工藝學(xué)(Bio/Technology)13(1995)1090-1093Gaestel et al.，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)179(1989)209-213Ghayreb et al.，EMHO 1.3(1934)2437-2442Goloubinoffet al.，自然(Nature)337(1989)44-47Hayhurst and Harris，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(Prot.Expr.Purif.)15(1999)336-343Hockney，生物技術(shù)趨勢(shì)(TIBTECH)12(1994)456-463Hoogenboom et al.，免疫工藝學(xué)(Immunotechnology)4(1998)1-20Hudson，生物技術(shù)新見(jiàn)(Curr.Opin Biotechnol.)9(1998)395-402Jacobi etal.生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)272(1997)21692-21699Jakob etal.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)268(1993)1517-1520Kelley，生物化學(xué)趨勢(shì)(TIBS)23(1998)222-227Knappik et al.，生物/工藝學(xué)(Bio/Technoogy)11(1993)77-83Kohnert et al.，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)5(1992)93-100Langer et al.，自然(Nature)356(1992)683-689Lee & Olins，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267(1992)2849-2852Lin & Traugh，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(Prot.Express.Purif.)4(1993)256-264).Martin et al.，Cardiovasc.藥物綜述(Drug Rev.)11(1993)299-311Murphy & Beckwith大腸桿菌中蛋白質(zhì)胞外輸出(Export of Proteins to the CellEnvelope in Escherichia coli inNeidhardt)et al.(Hrsg.)大腸桿菌和沙的氏菌，第二版，卷1(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Vol.l，)35 ASM Press，Washington，1996，5.967-978Paetzel et al.，自然(Nature)396(1998)186-190Perez-Perez et al.，生物化學(xué)、生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)210(1995)524-529Qiu et al.，應(yīng)用環(huán)境微生物(Appl.Environm.Microbiol.)64(1998)4891-4896Roman et al.，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 92(1995)8428-8432Sato et al.，生物化學(xué)、生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)202(1994)258-264Schmidt et al.，蛋白質(zhì)工程(Prot.Engin.)11(1998)601-607Schrder et al.，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)志(EMBO J.)12(1993)4137-4144Shibui et al.，應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)37(1992)352-357Studier & Moffat，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)189(1986)113-130Thomas et al.，應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)(Appl.Biochem.Biotechnol.)66(1997)197-238美國(guó)專(zhuān)利No.5,223,256(US-Patent No.5,223,256)美國(guó)專(zhuān)利No.5,593,865(US-Patent No.5,593,865)美國(guó)專(zhuān)利No.5,614,367(US-Patent No.5,614,367)Verheijen et al.血栓(Thromb.Haemostasis)48(1982)266-269Wall et al.，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270(1995)2139-2 144Wuclting and Plückthun，分子微生物學(xué)(MoI.Microbiol.)12(1994)685-692Yokoyama et al.，微生物發(fā)酵工藝學(xué)(Microbiol.Ferment.Technol.)62(1998)1205-1210
序列表<110> 霍夫曼-拉羅奇有限公司<120> 生產(chǎn)天然折疊和分泌型蛋白的方法<130> Case 20379<160> 10<210> 1<211> 1881<212> 脫氧核糖核酸<213> 大腸桿菌<220><221> CDS<222> (392)...(1591)<400> 序列1TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA 60CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT 120TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT 180TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG 240GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT 300GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT 360TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG412Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala1 5ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT 460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile10 15 20CCA GCT AAG CAA GAT TAT TAC GAG ATT TTA GGC GTT TCC AAA ACA GCG 508Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala25 30 35GAA GAG CGT GAA ATC AGA AAG GCC TAC AAA CGC CTG GCC ATG AAA TAC 556Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr40 45 50 55CAC CCG GAC CGT AAC CAG GGT GAC AAA GAG GCC GAG GCG AAA TTT AAA 604His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys60 65 70GAG ATC AAG GAA GCT TAT GAA GTT CTG ACC GAC TCG CAA AAA CGT GCG 652Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala75 80 85GCA TAC GAT CAG TAT GGT CAT GCT GCG TTT GAG CAA GGT GGC ATG GGC 700Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly90 95 100GGC GGC GGT TTT GGC GGC GGC GCA GAC TTC AGC GAT ATT TTT GGT GAC 748Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp105 110 115GTT TTC GGC GAT ATT TTT GGC GGC GGA CGT GGT CGT CAA CGT GCG GCG 796Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala120 125 130 135CGC GGT GCT GAT TTA CGC TAT AAC ATG GAG CTC ACC CTC GAA GAA GCT 844Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala140 145 150GTA CGT GGC GTG ACC AAA GAG ATC CGC ATT CCG ACT CTG GAA GAG TGT 892Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys155 160 165GAC GTT TGC CAC GGT AGC GGT GCA AAA CCA GGT ACA CAG CCG CAG ACT 940Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr170 175 180TGT CCG ACC TGT CAT GGT TCT GGT CAG GTG CAG ATG CGC CAG GGA TTC 988Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Met Arg Gln Gly Phe185 190 195TTC GCT GTA CAG CAG ACC TGT CCA CAC TGT CAG GGC CGC GGT ACG CTG 1036Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu200 205 210 215ATC AAA GAT CCG TGC AAC AAA TGT CAT GGT CAT GGT CGT GTT GAG CGC 1034Ile Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His Gly His Gly Arg Val Glu Arg220 225 230AGC AAA ACG CTG TCC GTT AAA ATC CCG GCA GGG GTG GAC ACT GGA GAC 1132Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp235 240 245CGC ATC CGT CTT GCG GGC GAA GGT GAA GCG GGC GAG CAT GGC GCA CCG 1180Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro250 255 260GCA GGC GAT CTG TAC GTT CAG GTT CAG GTT AAA CAG CAC CCG ATT TTC 1228Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe265 270 275GAG CGT GAA GGC AAC AAC CTG TAT TGC GAA GTC CCG ATC AAC TTC GCT 1276Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala280 285 290 295ATG GCG GCG CTG GGT GGC GAA ATC GAA GTA CCG ACC CTT GAT GGT CGC1324Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg300 305 310GTC AAA CTG AAA GTG CCT GGC GAA ACC CAG ACC GGT AAG CTA TTC CGT1372Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg315 320 325ATG CGC GGT AAA GGC GTC AAG TCT GTC CGC GGT GGC GCA CAG GGT GAT1420Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp330 335 340TTG CTG TGC CGC GTT GTC GTC GAA ACA CCG GTA GGC CTG AAC GAA AGG1468Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr pro Val Gly Leu Asn Glu Arg345 350 355CAG AAA CAG CTG CTG CAA GAG CTG CAA GAA AGC TTC GGT GGC CCA ACC1516Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr360 365 370 375GGC GAG CAC AAC AGC CCG CGC TCA AAG AGC TTC TTT GAT GGT GTG AAG1564Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys380 385 390AAG TTT TTT GAC GAC CTG ACC CGC TAA GGATCCGGCT GAGCAACGAC 1611Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg395 400GTGAACGCAA TGCGTTCCGA CGTTCAGGCT GCTAAAGATG ACGCAGCTCG TGCTAACCAG 1671CGTCTGGACA ACATGGCTAC TAAATACCGC AAGTAATAGT ACCTGTGAAG TGAAAAATGG 1731CGCACATTGT GCGACATTTT TTTTGTCTGC CGTTTACCGC TACTGCGTCA CGCGTAACAT 1791ATTCCCTTGC TCTGGTTCAC CATTCTGCGC TGACTCTACT GAAGGCGCAT TGCTGGCTGC 1851GGGAGTTGCT CCACTGCTCA CCGAAACCGG 1881<210> 2<211> 400<212> 蛋白質(zhì)<213> 大腸桿菌<400> 序列2Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile20 25 30Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr35 40 45Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys50 55 60Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu65 70 75 80Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala85 90 95Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly 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Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn305 310 315 320Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu325 330 335Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly340 345 350Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr355 360 365Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro *370 37
權(quán)利要求
1.通過(guò)培養(yǎng)原核生物的細(xì)胞生產(chǎn)一種通過(guò)二硫鍵連接二個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸的、水溶性的、天然折疊真核多肽的方法，a)其中所說(shuō)的原核細(xì)胞含有編碼所說(shuō)的在N-末端含有原核生物的信號(hào)序列的多肽的一個(gè)表達(dá)載體，b)在多肽分泌到周質(zhì)或培養(yǎng)基中的條件下，c)切除信號(hào)序列，并從周質(zhì)或培養(yǎng)基中分離該多肽。其中該培養(yǎng)是在有精氨酸或通式(I)的一種化合物存在下進(jìn)行的R2-CO-NRR1(I)其中R和R1代表氫或一種飽和的或不飽和的支鏈或直鏈C1-C4烷基鏈和R2代表氫、NHR1或飽和的或不飽和的支或直鏈C1-C3烷基鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所使用的精氨酸是其鹽酸鹽或其它的滴定形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中一種還原性硫醇試劑被加入到培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中使用的谷胱甘肽(GSH)作為還原性硫醇試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的方法，其中信號(hào)序列是由格蘭氏陰性細(xì)菌得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)所述的方法，其中原核細(xì)胞還含有一個(gè)編碼一種分子伴侶的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中分子伴侶是來(lái)自大腸桿菌的DNAJ，或Hsp25。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中編碼分子伴侶的重組DNA與一個(gè)編碼能滲過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜的一個(gè)信號(hào)肽的DNA片段有效連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8其中之一所述的方法，其中編碼分泌的分子伴侶和/或分泌的蛋白質(zhì)的DNA是在一種可誘導(dǎo)的表達(dá)信號(hào)控制下。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9其中之一所述的方法，其中多肽是一種抗體，抗體片段，干擾素，蛋白質(zhì)荷爾蒙或一種蛋白酶。
全文摘要
一種通過(guò)培養(yǎng)原核生物的細(xì)胞生產(chǎn)一種通過(guò)二硫鍵連接二個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸的、水溶性的、天然折疊真核多肽的方法,a)其中所說(shuō)的原核細(xì)胞含有編碼所說(shuō)的在N－末端含有原核生物的信號(hào)序列的多肽的一個(gè)表達(dá)載體,b)在多肽分泌到周質(zhì)或培養(yǎng)基中的條件下,c)切除信號(hào)序列,并從周質(zhì)或培養(yǎng)基中分離該多肽。其中該培養(yǎng)是在有精氨酸或通式(Ⅰ)的一種化合物存在下進(jìn)行的R
文檔編號(hào)C12N15/58GK1272550SQ0010597
公開(kāi)日2000年11月8日 申請(qǐng)日期2000年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月26日
發(fā)明者多蘿特·安布羅修斯, 賴納·魯?shù)婪? 約爾格·舍夫納, 伊麗莎白·施瓦茨 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司