專利名稱：2－甲基喹喔啉的微生物轉化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備2-喹喔啉羧酸的方法，更具體地說，涉及微生物氧化2-甲基喹喔啉制備2-喹喔啉羧酸。
用微生物氧化特定芳香族雜環(huán)的方法對于本領域技術人員是已知的，更具體地說，微生物氧化特定芳香族雜環(huán)的上的甲基，例如，下述兩篇文獻中描述的那些“Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid UpperPathway Operon and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by thexy1A Product，”由S.Harayama等人.，J.Bacteriol.，167(2)455-461(1986)報道和“芳香族雜環(huán)上的甲基基團的酶促氧化一種用于制備雜環(huán)芳香族羧酸的通用方法，”由A.Keiner，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，31(6)774-775(1992)報道。
美國專利US4,859,592公開了一種用于制備吡啶甲酸的微生物學方法，然后這種物質可通過化學手段被轉化成為吡啶產(chǎn)物。
美國專利US5,104,798；5,213,973和US5,236,832公開了一種微生物方法，該方法使用甲苯、二甲苯或甲基·異丙基苯作為誘導劑，在一種甲單孢菌微生物的作用下，將特定的芳香族5員或6員雜環(huán)化合物中的甲基氧化成為相應的羧酸。正如其中公開的那樣，利用保藏號為ATCC NO.33015惡臭甲單孢菌株將甲苯中的甲基氧化為苯甲酸，其中包括用甲苯單加氧酶、乙醇脫氫酶以及乙醛脫氫酶分別催化的3個步驟，這些內(nèi)容是本領域已知的。
如上述Harayama等人的上述文獻中此前公開的內(nèi)容，惡臭甲單孢菌mt-2的TOL質粒pWWO是一種可傳遞的染色體外因子，它可以編碼甲苯、m-二甲苯和p-二甲苯等幾種芳香烴氧化代謝所需的全部酶。帶有TOL質粒的細菌，例如保藏號為ATCC NO.33015惡臭甲單孢菌能夠將特定的芳香烴轉化為對應的芳香族羧酸編碼二甲苯降解的酶的xy1操縱子和負責xy1基因調控的基因都位于TOL質粒pWWO上。TOL質粒pWWO上編碼上述氧化所需酶的基因，必須被誘導產(chǎn)生這類酶。因此，上述美國專利US5,213,973、US5,104,798和US5,236,832中都描述了這種誘導。
如文獻Gaucher等人在Dev.Ind.Microbiol.，22219-232(1981)中描述的那樣，真菌灰棕黃青霉包含用于將間-甲酚轉化為間-羥基苯甲酸所需的3種酶間-甲酚甲基羥化酶、間-羥苯甲醇脫氫酶和間-羥苯醛羥化酶。
在此重申，正如本領域技術人員已知的那樣，某些真菌和細菌含有能將芳香環(huán)上甲基氧化成為其對應羧酸的酶。盡管已知能通過使用微生物將這類芳香雜環(huán)上甲基氧化成其對應羧酸時，但如本領域技術人員認識到的，通常這類微生物氧化的化學產(chǎn)量和光學產(chǎn)量隨以下因素而有實質性變化，例如，選定的具體微生物、底物濃度、底物結構等。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一系列微生物，包括真菌和細菌，基本上能將2-甲基喹喔啉氧化成為2-喹喔啉羧酸。此外，所述方法還能保證2-喹喔啉羧酸的適當回收。
1998年2月5日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮镹O.60/073801(“‘801申請’)的申請，即1999年1月18日提交的國際PCT申請?zhí)朠CT/IB99/00067，公開了2-喹喔啉羧酸作為合成新型二羥基己酸的中間產(chǎn)物的用途，二羥基己酸能夠用于治療，例如炎癥以及其他免疫紊亂。本發(fā)明的新方法所提供的2-喹喔啉羧酸能夠用于合成這類二羥基己酸。
本發(fā)明中引用的所有文獻，包括上述文獻，在此全文引入作為參考。
本發(fā)明涉及一種從2-甲基喹喔啉制備2-喹喔啉羧酸的微生物方法。
更具體地說，本發(fā)明涉及制備通式I所示化合物的微生物學方法，
該方法包括通過把通式II所示化合物
與一種微生物接觸，然后在適當條件下溫育得到的混合物從而制備出一定量通式I所示化合物，所述微生物能實現(xiàn)將通式II所示化合物中的甲基氧化成為通式I所示化合物中的羧基基團。
因此，本發(fā)明提供了用于實施通式II所示化合物2-甲基喹喔啉的微生物氧化的方法，該方法包括將通式II所示化合物與一種微生物或其突變體接觸從而實現(xiàn)本發(fā)明所述的氧化(“它的一種合適的突變體”)，所述微生物或其突變體為相關領域技術人員已知或能通過這樣的突變制備出，以及在足以產(chǎn)生一定量通式I所示化合物2-喹喔啉羧酸的條件下溫育得到的混合物，其中所述微生物選自灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCCNo.74480、假柱孢犁頭霉ATCC No.24169、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、雅致放射毛霉ATCC No.6476、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865、單純粉孢革菌ATCCNo.12675、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8688a、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.8688b、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8983、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.9244、刺孢小克銀漢霉ATCC No.9245、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.10028b、刺孢小克銀漢霉ATCC No.26269、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.36190、刺孢小克銀漢霉ATCC No.36112、Cunninghamella homothallicaATCC No.16161、Cylindrocarpon destructans ATCC No.66963、棉包二孢ATCC No.20575、玉米附球菌ATCC No.12723、葫蘆病霉ATCC No.14724、棒形青霉ATCC No.10426、杜克氏青霉ATCC No.10440、平滑青霉ATCCNo.11080、Pseudocochliobolus lunatus ATCC No.24155、惡臭假單孢菌ATCC No.33015、惡臭假單孢菌ATCC No.202190、玫瑰紅紅球菌ATCCNo.19067和Thamnostylum piriforme ATCC No.8686，以及它們的適當突變體；如果當所述微生物是上述的惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190時，在上述的惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190與所述2-甲基喹喔啉進行所述的接觸之前，應當通過與誘導劑相互作用來對上述的惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190進行誘導。
本發(fā)明的方法選擇性地進一步包括通過合適的方法分離目的產(chǎn)物2-喹喔啉羧酸。例如，可以用有機溶劑對反應混合物進行抽提，優(yōu)選使用醋酸乙酯，然后可以用色譜分離抽提后得到的物質。或者，可以將2-喹喔啉羧酸從反應混合物中吸附到樹脂上，優(yōu)選使用聚合物吸附樹脂，用有機溶劑洗滌，優(yōu)選醋酸乙酯；以及使用一種有機溶劑或有機溶劑的組合，優(yōu)選醋酸乙酯或甲醇從洗滌所得的物質中結晶。另外還有，本發(fā)明方法制備得到的2-喹喔啉羧酸也可以用一種合適的堿進行處理，例如，氫氧化鈉，生成鹽，例如2-喹喔啉羧酸的鈉鹽。然后可以通過下述手段將2-喹喔啉羧酸的堿金屬的鹽從生物轉化培養(yǎng)基中分離出來過濾或離心從培養(yǎng)基中取出細胞，接著濃縮上述除去細胞的培養(yǎng)基，例如通過蒸發(fā)。
本發(fā)明微生物優(yōu)選是完整微生物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物是一種真菌。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是一種真菌，該真菌選自下列一組真菌屬犁頭霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬、青霉屬、色二孢屬以及小克銀漢霉屬。
本發(fā)明的一個具體優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是真菌，該真菌為犁頭霉屬。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是為犁頭霉屬的真菌，該微生物是灰綠犁頭霉ATCC No.22752或灰綠犁頭霉ATCC No.74480，或者是它們的合適的突變體，或者進一步還可以是灰綠犁頭霉ATCC No.22752的任一保藏物或其合適突變體，只要它們能滿足布達佩斯條約中的條款。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施例中，其中所述的微生物是犁頭霉屬真菌，該微生物是匍匐犁頭霉ATCC No.14849或匍匐犁頭霉ATCC No.74481，或者是它們的合適的突變體，或者進一步還可以是匍匐犁頭霉ATCCNo.14849的任一保藏物或其合適突變體，只要它們能滿足布達佩斯條約中的條款。
本發(fā)明真菌培養(yǎng)的優(yōu)選細胞濃度為約10～30g干細胞重/L。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中的微生物是細菌。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是細菌，該細菌選自假單孢屬和紅球菌屬。
在本發(fā)明的一個具體優(yōu)選的實施方案中，其中所述的微生物是細菌，該細菌為假單孢屬細菌。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，其中所述的微生物是假單孢屬細菌，該微生物是惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCCNo.202190或其合適的突變體，或者進一步還可以是惡臭假單孢菌ATCCNo.33015的任一保藏物或其合適突變體，只要它們能滿足布達佩斯條約中的條款。
本發(fā)明細菌培養(yǎng)物的優(yōu)選細胞濃度為其在650nm處所產(chǎn)生的光密度約為10～約30的濃度。
如上所述，本發(fā)明的實施方案中，其中所述的微生物是惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190或其合適的突變體，在所述的接觸之前或接觸過程中對該微生物或其合適的突變體進行誘導。優(yōu)選在微生物的誘導完成之后再進行接觸。優(yōu)選的誘導劑包括p-二甲苯和m-二甲苯。特別優(yōu)選p-二甲苯。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190或其合適的突變體，并且該微生物在盛裝在燒瓶內(nèi)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導劑應當在所述微生物與2-甲基喹喔啉接觸之前加入到生長培養(yǎng)基中，并且在培養(yǎng)基中溫育足夠長的時間以使所述誘導基本完成。在2-甲基喹喔啉與微生物接觸前，用以下操作收集誘導后的微生物細胞離心分離燒瓶中的內(nèi)容物，通過傾析等手段除去用過的培養(yǎng)基(因而也除去了本發(fā)明的誘導劑)，洗滌細胞沉淀以及將沉淀重懸在含水介質中，例如DPBS(Biowhittaker)中。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190或其合適的突變體，并且該微生物在盛裝在發(fā)酵罐內(nèi)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在所述微生物與2-甲基喹喔啉接觸之前將誘導劑連續(xù)地加入到生長培養(yǎng)基中，并且在培養(yǎng)基中溫育足夠長的時間以使所述誘導基本完成，然后在2-甲基喹喔啉與微生物接觸前停止。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，通過向含有本發(fā)明微生物的生長培養(yǎng)基中加入2-甲基喹喔啉來完成所述的接觸，該微生物是真菌。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的接觸是通過向含有本發(fā)明的真菌的生長培養(yǎng)基中加入2-甲基喹喔啉來完成，該生長培養(yǎng)基為玉米浸液(comsteep)固體培養(yǎng)基。一種特別優(yōu)選的玉米浸液固體培養(yǎng)基含有約20g～40g/升的玉米浸液固相物以及約20g/L萄萄糖，其pH值約為4.85。另一種優(yōu)選的生長培養(yǎng)基含約20g/L Pharmamedia(商品蛋白)以及約20g/L葡萄糖，其pH值約為7.2。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述的接觸是加入吸附到樹脂上的通式II所示化合物。參見，例如，J.T.Vicenzi等人.，“Large-scale stereoselectiveenzymatic ketone redution with in situ product removal via polymeric adsorbentresins，”酶和微生物技術，20494-499(1997)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸是通過向含有經(jīng)過洗滌的微生物細胞的含水培養(yǎng)基中加入2-甲基喹喔啉來完成的。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物是在該微生物與2-甲基喹喔啉接觸之前被洗滌的。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，其中所述的微生物是在該微生物與2-甲基喹喔啉接觸之前被洗滌的，在接觸前將洗滌后的微生物固定。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，在通過向其中加入2-甲基喹喔啉完成所述接觸之前，所述微生物在玉米浸液固體培養(yǎng)基中生長約24小時～約72小時。
本發(fā)明的方法還可以選擇性地包括2-喹喔啉羧酸的分離，例如用下列操作來完成有機溶劑抽提、吸附到樹脂上，結晶，或者采用上述方法，其中2-喹喔啉羧酸的堿金屬鹽是通過蒸發(fā)除去細胞的培養(yǎng)基濃縮，或者通過其他手段得到的。
本發(fā)明進一步包括在上述’801申請中公開的采用’801申請公開的方法或采用任何其他合適的方法合成新型二羥基己酸過程中使用2-喹喔啉羧酸。
本領域技術人員應當完全理解本發(fā)明使用的術語是用來描述本發(fā)明的，但本發(fā)明中使用的下列術語在下面緊接的部分描述。
“完整微生物”是指微生物細胞基本上具有其天然固有的(和/或誘導的，如本例)機械、物理以及生化完整性。
“微生物氧化”是指本發(fā)明所述的氧化，它是通過利用完整微生物或其任意制劑等來完成的。
“微生物”包括任一完整微生物或其適當?shù)闹苿?，包括，例如洗滌除去發(fā)酵培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基等物質的微生物，也可以是這樣的情況，微生物被固定到柱、吸附到珠等載體上。
除非另有說明，在本說明書的全文以及所附的權利要求中℃是指攝氏溫度；％是指百分比；ACN是指乙腈；DMSO是指二甲基亞砜；DPBS是指Dulbeccos磷酸緩沖鹽溶液；EtOAC是指乙酸乙酯；EtOH是指乙醇；g是指克；HPLC是指高效液相色譜；L是指升；MeOH是指甲醇；mg是指毫克；min是指分鐘；mm是指毫米；mmol是毫摩爾；mL是指毫升；m-二甲苯是指間-二甲苯；N是指當量(濃度)；nM是指納摩爾(濃度)；PBS是指磷酸鹽緩沖液；p-二甲苯是指對二甲苯；rpm是指每分鐘的轉數(shù)；TFA是指三氟乙酸；μL是指微升；v/v是指體積比；American National Can位于Menasha，威斯康星州，美國；Becton Dickinson位于富蘭克林湖，新澤西州，美國；Becton Dickinson微生物系統(tǒng)，Sparks，馬里蘭州，美國；Biowhittaker位于Walkerswille，馬里蘭州，美國；Column Engineering，Inc.位于安大略省，加利福尼亞州，美國；IECCentrifuge位于Needham Heights，麻薩諸塞州，美國；Rohm and Hass位于費城，賓夕法尼亞州，美國；Traders Protein位于孟斐斯，田納西州，美國。
另外， ATCC是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，位于10801 UniversityBoulevard，Manassas，弗吉尼亞州，20110-2209，美國。下面的表1中列出了本發(fā)明中公開的微生物以及它們的寄存人(參見，www ATCC.com)。
表1
1NRRL代表北部地區(qū)研究實驗室(Peoria，lllinois)。2灰綠犁頭霉ATCC No.22752于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏的。3匍匐犁頭霉ATCC No.14849于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏的。4惡臭假單孢菌ATCC No.33015于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏的。
如上所述，本發(fā)明涉及制備通式I所示化合物的微生物學方法，
該方法包括通過把通式II所示化合物
與一種微生物接觸，然后在適當條件下溫育得到的混合物從而生產(chǎn)出2-喹喔啉羧酸，所述微生物能實現(xiàn)將通式II所示化合物中的甲基氧化成為通式I所示化合物2-喹喔啉羧酸中的羧基基團。
本發(fā)明的方法易于實施。培養(yǎng)微生物，當該微生物是惡臭假單孢菌ATCCNo.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190或其合適的突變體時，需對其進行誘導；然后讓其與2-甲基喹喔啉接觸從而將2-甲基喹喔啉上的甲基氧化成為2-喹喔啉羧酸的-COOH基團。然后可以，例如用上述’801申請中公開的方法進一步反應最終生產(chǎn)出新型二羥基己酸，二羥基己酸能夠用于治療炎癥以及其他免疫紊亂。有關上述’801申請中公開的新型二羥基己酸的活性、活性檢測方法、劑量、劑型、給藥方法以及背景知識，在該申請中已被全部公開。
如上所述，任意一種合適的微生物或其合適的突變體都可以用于本發(fā)明的方法。盡管有關本發(fā)明公開的內(nèi)容本領域技術人員都能理解，但本發(fā)明方法的條件需根據(jù)微生物及具體制劑的種類等因素來選定。在使用選定微生物時，為獲得特定的預期結果，需要對下列因素進行選擇發(fā)酵培養(yǎng)基及有機溶劑等物質的pH、溫度、組分濃度等，以及2-甲基喹喔啉和誘導劑(如果使用)的濃度。
優(yōu)選的真菌包括犁頭霉屬、放射毛霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬、粉孢革菌屬、小克銀漢霉屬、Cylindrocarpon、色二孢屬、附球菌屬、鐮孢屬、病霉屬、青霉屬、Pseudocochliobolus、Thamnostylum以及輪枝孢屬的成員。但是它們的種沒有具體限制，只要這些微生物或其突變體能夠完成本發(fā)明所述的氧化就可以。
具體優(yōu)選的真菌屬于犁頭霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬、小克銀漢霉屬、色二孢屬以及青霉屬。
特別優(yōu)選的真菌屬于犁頭霉屬。
更具體地說，優(yōu)選的真菌包括灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480、假柱孢犁頭霉ATCC No.24169、匍匐犁頭霉ATCCNo.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、雅致放射毛霉ATCC No.6476、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865、單純粉孢革菌ATCC No.12675、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8688a、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8688b、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8983、刺孢小克銀漢霉ATCC No.9244、刺孢小克銀漢霉ATCC No.9245、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.10028b、刺孢小克銀漢霉ATCC No.26269、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.36190、刺孢小克銀漢霉ATCC No.36112、同宗(homothallica)小克銀漢霉ATCC No.16161、C.destructans ATCC No.66963、棉色二孢ATCCNo.20575、玉米附球菌ATCC No.12723、葫蘆病霉ATCC No.14724、棒形青霉ATCC No.10426、杜克氏青霉ATCC No.10440、平滑青霉ATCCNo.11080、P.lunatus ATCC No.24155和T.pirforme ATCC No.8686，以及它們的合適的突變體。
更優(yōu)選的真菌包括灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCCNo.74480、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8983、棉色二孢ATCC No.20575、和平滑青霉ATCCNo.11080，以及它們的合適的突變體。
具體優(yōu)選的真菌包括灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCCNo.74480、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481，以及它們的合適的突變體。
特別優(yōu)選的真菌包括匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCCNo.74481，以及它們的合適的突變體。
優(yōu)選的細菌包括屬于以下屬的細菌芽孢桿菌屬、短桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬和紅球菌屬，但是它們的種類沒有具體限制，只要這些微生物或其突變體能夠完成本發(fā)明所述的氧化就可以。
具體優(yōu)選的細菌包括那些屬于假單胞菌屬和紅球菌屬的細菌。
特別優(yōu)選的細菌包括那些屬于假單胞菌屬的細菌。
更具體地說，優(yōu)選的細菌包括惡臭假單孢菌ATCC No.33015、惡臭假單孢菌ATCC No.202190、玫瑰紅紅球菌ATCC No.19067，以及它們的合適的突變體。
特別優(yōu)選的細菌是惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCCNo.202190；和其合適的突變體。
如此前討論的那樣，本發(fā)明包括使用任意一種合適的微生物的任意合適的突變體。此外，本發(fā)明的方法中還可以使用那些與其親本菌株相比具有更適意的特性的一組突變體，例如，能夠氧化更多的底物，使用已知方法就可以制備出這些新菌株，例如，標準誘變及篩選技術，以及包括定點誘變的重組技術。
標準誘變方法包括使用下列物質的化學誘變N-甲基-N′-亞硝基胍(Delic等人(1970)，Mutat.Res.9167)、亞硝酸(Crueger和Crueger(1984)，BiotechnologyA Textbook Of Industrial Microbiology，P.16，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA)，以及紫外光照射(Thrum(1984)，Biotechnology Of Industrial Antibiotics(Vandamme，ed.)，Marcel Dekker，NewYork，pp.373-374)。
篩選技術包括通過篩選分離后的菌落簡單地重篩選菌株，特定菌落形態(tài)的篩選以及抗性的篩選，這種抗性是針對已知或被認為是通式I所示化合物生物合成途徑中的成分的類似物的(Crueger和Crueger(1984)，BiotechnologyA Textbook Of Industrial Microbiology，p.24-25，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，USA)。
這些新菌株可以用于本發(fā)明的方法，是由于，例如，與其親本株相比它們具有改良特性，例如，它們可以生產(chǎn)更多的2-喹喔啉羧酸，同時它們表現(xiàn)出較小的對2-甲基喹喔啉和/或2-喹喔啉羧酸和/或中間產(chǎn)物的有害固有降解活性，中間產(chǎn)物依具體選擇的特定微生物的不同可能產(chǎn)生于本發(fā)明的方法中。此外，當使用突變體是由于它的使用可以生產(chǎn)出更多的2-喹喔啉羧酸時，根據(jù)本發(fā)明的方法為了獲得生產(chǎn)大量2-喹喔啉羧酸所需物質，需生長更少量的培養(yǎng)物，這樣就可以大大地降低成本。
如上所述，任意一種合適的微生物制劑都可以用于本發(fā)明的方法中，例如，生長基中的微生物，洗滌除去發(fā)酵培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基等的微生物，或者固定到柱、吸附到株等載體上的微生物。
從本發(fā)明提供的說明書中，本領域技術人員可以理解如何制備合適的固定化的完整微生物，例如，出版于Biotechnology Letters，18(3)343-348(1996)中的A.Bauer等人的文章“Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cellpreparations for biotransformation of nitriles”。
優(yōu)選的完整微生物能夠基本上氧化2-甲基喹喔啉制備出產(chǎn)物，具體地是2-喹喔啉羧酸，并且可以使產(chǎn)物基本保持不變，例如除去了可能會降解或者對本發(fā)明方法中任一階段的所需要的產(chǎn)物產(chǎn)生不良影響的固有活性。
適宜用于本發(fā)明微生物氧化的微生物可以利用相關領域技術人員已知的任意一種合適方法制備得到。下面提供了從商品化原種制備微生物合適方法的一個實例。在包括下面提供的方法的本發(fā)明的說明書的基礎上，本領域技術人員可以理解如何改良這些方法中的任一部分，例如，制備微生物的方法，除去培養(yǎng)基或固定菌體的方法；2-喹喔啉羧酸與微生物接觸的方法；生長培養(yǎng)基成分以及條件，例如，溫度、pH等；2-甲基喹喔啉、誘導劑(如果使用)的各自濃度；或者溫育條件；從而通過使用適宜的微生物得到需要的結果。
在本發(fā)明的實施方案中，其中所述的微生物是真菌，2-甲基喹喔啉的優(yōu)選濃度為約0.01g/L～約2.5g/L，特別優(yōu)選約0.1g/L～約2.0g/L范圍。本發(fā)明的實施方案中，其中所述的微生物是真菌，選自匍匐犁頭霉ATCCNo.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480，以及它們的合適的突變體，2-甲基喹喔啉的優(yōu)選濃度為約0.1g/L-約2.0g/L。
在本發(fā)明的實施方案中，其中所述的微生物是細菌，2-甲基喹喔啉的優(yōu)選濃度范圍為約0.01g/L～1.5g/L，特別優(yōu)選約0.1g/L～約1.0g/L范圍。本發(fā)明的實施方案中，其中所述的細菌選自惡臭假單孢菌ATCC No.33015、惡臭假單孢菌ATCC No.202190，以及它們的合適的突變體，2-甲基喹喔啉的優(yōu)選濃度為約0.1g/L～約1.0g/L。
此外，如此前討論的那樣，帶有本發(fā)明氧化所需的TOL質粒的細菌惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190必須被誘導。在本發(fā)明的實施方案中，其中所述的惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190培養(yǎng)在盛裝于發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基中，誘導劑，優(yōu)選p-二甲苯，其加入時的優(yōu)選添加速度為約4.5mmol/L小時～約6.5mmol/L/小時，特別優(yōu)選的添加速度為約4.9mmol/L/小時～約6.1mmol/L/小時。
本發(fā)明的實施方案中，其中所述的惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190培養(yǎng)在盛裝于燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基中，誘導劑優(yōu)選p-二甲苯以氣態(tài)形式連續(xù)加入到培養(yǎng)基中。從本發(fā)明公開的內(nèi)容以及上述文獻和專利(例如US5,236,862)中，本領域技術人員可以理解到，通常要對所述誘導劑的濃度進行選擇以使其低于負責氧化的酶的最小抑制濃度。參見，Claus和walker，J.Gen.Microbiol.，36107-122(1964)。
任意一種能讓底物2-甲基喹喔啉與微生物接觸的方法都可以用于本發(fā)明的方法中。底物與微生物之間可以任意合適的順序接觸。例如，可以將2-甲基喹喔啉加入到含有微生物的肉湯等培養(yǎng)基中，除去或固定，或者它們之間的某些組合；或者是可以在培養(yǎng)基中含有2-甲基喹喔啉，然后將微生物一并加入到該培養(yǎng)基中；或者可以將2-甲基喹喔啉或微生物一起加入到培養(yǎng)基中；或者將2-甲基喹喔啉或微生物二者之一加入到含有另一成分的合適溶劑中；或者可以將2-甲基喹喔啉吸附到樹脂上；等等。從本發(fā)明提供的說明書內(nèi)容中，本領域技術人員可以理解如何對本發(fā)明方法的任一部分進行需要的改進。
如上所述，本發(fā)明優(yōu)選的微生物是灰綠犁頭霉ATCC No.22752。仍如上所述，灰綠犁頭霉ATCC No.22752的一種凍干樣品于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏于ATCC。這種新近保藏的培養(yǎng)物被給予新的保藏號ATCC No.74480。因此，灰綠犁頭霉ATCC No.74480也是本發(fā)明優(yōu)選的微生物。當本發(fā)明說明書中的專利公開時，公眾在獲得這些保藏微生物培養(yǎng)物上的限制將被不能撤回地消除掉。
仍如上所述，本發(fā)明特別優(yōu)選的微生物是匍匐犁頭霉ATCC No.14849。匍匐犁頭霉ATCC No.14849的一種凍干樣品于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏于ATCC。這種新近保藏的培養(yǎng)物被給予新的保藏號ATCC No.74481。因此，灰綠犁頭霉ATCC No.74481也是本發(fā)明優(yōu)選的微生物。當本發(fā)明說明書中的專利公開時，公眾在獲得這些保藏微生物培養(yǎng)物上的限制將被不能撤回地消除掉。
真菌匍匐犁頭霉ATCC No.14849(或者匍匐犁頭霉ATCC No.74481、灰綠犁頭霉ATCC No.22752或灰綠犁頭霉ATCC No.74480)的培養(yǎng)物可以從ATCC獲得，下面緊接地提供了用于制備這些可獲得原種的合適方法的實例。原種培養(yǎng)物可以從稻米(rice)培養(yǎng)基中制備出來，例如，采用下述方法將裝有約50g糙米和約20ml蒸餾水的Erlenmeyer燒瓶(250ml)在121℃下熱壓30分鐘，向滅菌后的蒸餾水中加入小份液體培養(yǎng)物或一菌針瓊脂糖培養(yǎng)基上的固體培養(yǎng)物，從而制備出匍匐犁頭霉ATCC No.14849(或者匍匐犁頭霉ATCC No.74481、灰綠犁頭霉ATCC No.22752或灰綠犁頭霉ATCC No.74480)的營養(yǎng)細胞或芽孢懸液。向每個稻米燒瓶中接種孢子或細胞懸液5mL，并在28℃溫育約10天，用約0.5％的Tween80蒸餾水溶液洗滌稻米培養(yǎng)基制備孢子原液，將孢子懸液從稻米培養(yǎng)基中傾析出來，加入約10％～約20％甘油。孢子原液在約-70℃保存。
如本領域技術人員對于任一選定的真菌所能理解的那樣，并且如本發(fā)明下面關于優(yōu)選的灰綠犁頭霉ATCC No.22752或灰綠犁頭霉ATCC No.74480以及特別優(yōu)選的匍匐犁頭霉ATCC No.14849或匍匐犁頭霉ATCC No.74481的實施例中給出的那樣，一種合適的制備選定的真菌的方法如下所述按照上述方法，將真菌從凍存的營養(yǎng)細胞或孢子原液培養(yǎng)物中接種到裝有生長培養(yǎng)基(內(nèi)含一等份包含Tween80，甘油和蒸餾水的無菌溶液)的燒瓶或帶有金屬帽的玻璃試管中，下面將對該生長培養(yǎng)基的組成做更詳細的描述。發(fā)酵采用的溫度為約22℃～約32℃，更優(yōu)選約29℃，適當振蕩，優(yōu)選約200rpm～約220rpm的轉速，最優(yōu)選約210rpm的轉速。如果需要(where so desired)，通過使用向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入合適的緩沖液和/或者通過加入所需的酸或堿定期調節(jié)，來維持生長培養(yǎng)基的pH，優(yōu)選的pH范圍是約6到約7。
培養(yǎng)微生物(例如，真菌或細菌)生長、微生物與2-甲基喹喔啉接觸以及2-甲基喹喔啉與微生物溫育的任一合適持續(xù)時間都可以用于本發(fā)明。微生物合適的生長可以在，例如約24小時時間內(nèi)實現(xiàn)，在此期間，可以將下述形式的2-甲基喹喔啉加入到培養(yǎng)基中(a)2-甲基喹喔啉自身；(b)一合適等份2-甲基喹喔啉溶液，該溶劑是將2-甲基喹喔啉溶解在合適的，例如客觀上不影響微生物的生長或功能的溶劑優(yōu)選，EtOH中形成的；或(c)吸附到樹脂上的2-甲基喹喔啉。然后繼續(xù)溫育，例如約2～約24天，溫育時間的長短取決于，例如，發(fā)生生物轉化的容器、培養(yǎng)基以及反應條件，例如溫育采用的溫度、pH以及攪拌。然后可以用任一合適的抽提方法將溫育肉湯抽提除去，例如(a)采用合適的溶劑除去溫育肉湯中的有機成分，例如，采用乙酸乙酯、甲基·異丁基酮、甲基·乙酮、二氯甲烷等，優(yōu)選EtOAc；或者(b)把產(chǎn)物2-喹喔啉羧酸吸附到一合適的樹脂上，優(yōu)選聚合物吸附樹脂，更優(yōu)選商標名為Amberlite(Rohm和Hass)的樹脂，最優(yōu)選XAD4的樹脂(Amberlite樹脂中的一種)。在用合適的有機溶劑抽提肉湯培養(yǎng)基并將有機相和水相分離后，可以用任意一種合適的方法，例如色譜法對含有機殘基的化合物進行測定。或者，在用樹脂將2-喹喔啉羧酸從溫育肉湯中提取出來后，用一合適的溶劑，優(yōu)選EtOAc或MeOH，就可以將2-喹喔啉羧酸從樹脂上洗脫下來，，然后再用例如EtOAc和MeOH將其從例如EtOAc中結晶出來。
任意一種合適的生長培養(yǎng)基都可以用于本發(fā)明的方法中，該合適的生長培養(yǎng)基中含有一種或多種可同化碳源、可同化氮源以及含必需礦物質的無機鹽。通常，多種糖類，例如葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、甘油、黍膠(millet jelly)、糖蜜、大豆等，都可以用作可同化碳源?？赏窗ǎ缃湍负屠业鞍姿馕?、初生酵母、酵母提取物、棉籽粉、大豆固相物(soybean solid)、麥芽、肉類提取物、蛋白胨、玉米浸液、玉米浸液固相物以及銨鹽的物質。本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的合適無機鹽營養(yǎng)物包括，例如含鈉、鐵、鎂、鉀、鈷、磷等的常用鹽。
更具體地，當本發(fā)明中微生物是真菌時適于本發(fā)明使用的培養(yǎng)基的成分包括，例如玉米浸液、玉米浸液固相物、Pharmamedia及麥芽提取物。玉米浸液培養(yǎng)基由約40g/L玉米浸液和約20g/L右旋糖制備而成，滅菌前將pH調至約4.85。玉米浸液固相物培養(yǎng)基由約20g/L～約40g/L玉米浸液和約20g/L右旋糖制備而成，滅菌前將pH調至約4.85。另一個適用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基是由約20g/L Pharmamedia和約20g/L右旋糖制備而成，滅菌前將pH調至約7.2。麥芽提取物培養(yǎng)基是由約10g/L麥芽提取物、約10g/L右旋糖、約5g/L蛋白胨以及約2g/L酵母提取物制備而成，滅菌前將pH調至約7。另一個適用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基是由約20g/L右旋糖、約5g/L營養(yǎng)豆粉(nutrisoy flour)、約5g/L酵母提取物、約5g/L NaCl以及約5g/L K2HPO4制備而成，滅菌前用H2SO4將pH調至約7.0。一種特別優(yōu)選的適用于本發(fā)明的真菌的生長培養(yǎng)基是上述的玉米浸液固相物培養(yǎng)基。
如上所述，本發(fā)明中特別優(yōu)選的微生物是惡臭假單孢菌ATCCNo.33015。仍如上所述，惡臭假單孢菌ATCC No.33015的一種凍干樣品于1999年1月13日按照布達佩斯條約中的條款保藏于ATCC。這種新近保藏的培養(yǎng)物被給予新的保藏號ATCC No.202190。因此，惡臭假單孢菌ATCCNo.202190也是本發(fā)明優(yōu)選的微生物。當本發(fā)明說明書中的專利授權時，公眾在獲得這些保藏微生物培養(yǎng)物上的限制將被不能撤回地消除掉。
此外，當本發(fā)明中微生物是細菌時，適宜本發(fā)明使用的生長培養(yǎng)基的成分包括，任一已知的合適培養(yǎng)基，例如，營養(yǎng)肉湯(約32g/L，Becton Dickinson微生物系統(tǒng))和甘油(約5g/L)。如本領域技術人員對于任一選定的細菌所能理解的那樣，并且如本發(fā)明下面關于惡臭假單孢菌ATCC No.33015實施例中提供的內(nèi)容，一種合適的制備選定細菌的方法如下所述將細菌從凍存的用本領域已知方法制備的原液培養(yǎng)物(約17％的甘油原液)中接種到裝有生長培養(yǎng)基(內(nèi)含一等份包含Tween 80甘油和蒸餾水的滅菌溶液)的燒瓶、帶有金屬帽的玻璃試管或發(fā)酵罐中，下面將對該生長培養(yǎng)基的組成做更詳細的描述。發(fā)酵采用的溫度為約20℃～約40℃，優(yōu)選約25℃～32℃，適當振蕩，優(yōu)選約200rpm～約220rpm的轉速，最優(yōu)選約210rpm的轉速。如果需要，通過使用向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入合適的緩沖液以及/或者通過加入所需的酸或堿定期調節(jié)，來維持生長培養(yǎng)基的pH值。優(yōu)選的接種體為約1％～約20％v/v(接種體/培養(yǎng)基)。優(yōu)選的pH范圍為約6～8。
應該注意本發(fā)明中任一部分中使用的特定緩沖液、培養(yǎng)基、試劑、接觸或培養(yǎng)條件、底物量以及誘導劑量等的有關內(nèi)容都并非是對本發(fā)明的限制，而應該把本領域普通技術人員認為是有用或有價值的這類相關物質都包括到本發(fā)明的特定范圍中。例如，經(jīng)常可以用一種不同的已知緩沖液系統(tǒng)或培養(yǎng)基來代替另一種，從而可以按照一種提議方法、原料或組成建議的方式，使用一種不同的已知方法實現(xiàn)同樣的目的。而且，應該理解的是，本發(fā)明還包括本發(fā)明方法用于商業(yè)化目的的大規(guī)模方式。
本發(fā)明微生物氧化進一步包括目的產(chǎn)物2-喹喔啉羧酸的分離?？梢园凑障旅婷枋龅姆椒?，把2-喹喔啉羧酸從培養(yǎng)基中分離出來，該培養(yǎng)基中進行新的微生物氧化過程，更特定的情況下，把2-喹喔啉羧酸與已經(jīng)產(chǎn)生但并未完全轉化為2-喹喔啉羧酸的中間產(chǎn)物分離開，中間產(chǎn)物的出現(xiàn)取決于選擇的微生物及溫育條件等。
任意一種適用于分離和/或純化本發(fā)明方法中出現(xiàn)的中間產(chǎn)物或目的產(chǎn)物的方法都可以用于本發(fā)明，其中包括過濾、抽提、結晶、柱層析、薄層層析、制備低壓液相色譜、HPLC、樹脂吸附，或者這些方法的任意合適組合。
下面提供的詳細實施例表明，一系列微生物，特別是真菌和細菌，氧化2-甲基喹喔啉制備出2-喹喔啉羧酸，然后可以把2-喹喔啉羧酸同任一廢棄的未轉化的2-甲基喹喔啉或任一中間化合物分離開，按照本領域熟知方法進一步反應生產(chǎn)出例如′801申請中的化合物。
盡管本發(fā)明主要是涉及完整微生物在本發(fā)明方法中的使用，但是本領域技術人員還應該理解到本發(fā)明微生物方法使用其合適制劑也可以完成，例如破碎和脫水細胞制劑、含有能完成本發(fā)明氧化的微生物酶的提取物、或者這些酶本身加上任一必需的輔因子，等等。
下面提供的實施例是用來說明本發(fā)明的。本發(fā)明的上述和下述內(nèi)容以及各種實施方案都不是用來限定本發(fā)明，而是用來說明本發(fā)明的。因此，應該理解的是本發(fā)明不僅限于這些實施例的特定描述。
實施例1在試管培養(yǎng)物中用匍匐犁頭霉ATCC No.14849氧化2-甲基喹喔啉A.使用真菌匍匐犁頭霉ATCC No.14849進行生物轉化。
按照下述方法制備3個“測試”培養(yǎng)物(T1、T2和T3)在3支16×125mm玻璃試管(T1、T2和T3)每支中各加入約2.5mL滅菌生長培養(yǎng)基(約20g/L右旋糖、約5g/L營養(yǎng)豆粉(nutrisoy flour)、約5g/L酵母提取物、約5g/LNaCl以及約5g/L K2HPO4制備而成，滅菌前用H2SO4將pH調至約7.0)，這些試管都帶有一個金屬帽，然后向T1、T2和T3中加入匍匐犁頭霉ATCCNo.14849的孢子(約1％v/v的孢子原液培養(yǎng)物)。
將上述3支試管溫育于約29℃、約210rpm的轉速下振蕩。溫育約48小時(T1)、72小時(T2)、或96小時(T3)后，向試管培養(yǎng)物中加入約0.05mL2-喹喔啉羧酸原液(在約100％EtOH中約50mg/mL，終濃度為約1mg/mL)。
在約29℃下繼續(xù)溫育后(見下表2)，用4N HCl將試管培養(yǎng)物中的發(fā)酵肉湯調至pH2。用等體積的EtOAc(純的)抽提每個試管培養(yǎng)物的內(nèi)容物加入EtOAc，渦旋振蕩試管培養(yǎng)物，然后約2,000rpm離心(IEC離心機)。移去EtOAc層，并第2次抽提上述水相層。在約50℃水浴中氮氣環(huán)境下干燥上述合并后的有機提取物。B.用反相HPLC測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量。
將所有上述方法制備的提取物部各自重懸于約1mL的ACN∶水(1∶9，v/v)，將上述重懸提取物各取20μL，注入到HPLC柱上進行分析InertsiC8HPLC柱(4.6×250mm，Column Engineering，Inc.)。將包含在每個注入的重懸提取物中的化合物在流動相(ACN∶0.05％的含水TFA，1∶4，v/v)中以約每分鐘1.0mL等梯度洗脫分離。在這些條件下，2-喹喔啉羧酸在約8.6分鐘時洗脫出來，2-甲基喹喔啉在約15分鐘時洗脫出來。用幾套不同的實驗條件(即T1、T2和T3)對這些HPLC分析中2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量進行測定，這些產(chǎn)量提供于下表2。
表2<
>正如表2中T1、T2和T3的數(shù)據(jù)所顯示的，HPLC分析顯示本發(fā)明微生物方法生產(chǎn)的目的產(chǎn)物2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量分別為56％、76％和79％。
因此，完整微生物的加入，即匍匐犁頭霉ATCC No.14849，可以將2-甲基喹喔啉氧化成2-喹喔啉羧酸，大量的2-喹喔啉羧酸基本上都保持完整。
實施例II在4種不同的生長培養(yǎng)基中用匍匐犁頭霉ATCC No.14849氧化試管培養(yǎng)物中的2-甲基喹喔啉A.制備四種不同的生長培養(yǎng)基。
約40g/L玉米浸液和約20g/L右旋糖制備培養(yǎng)基1，在滅菌前調至約pH值為4.85。
約40g/L玉米固相物和約20g/L右旋糖制備培養(yǎng)基2，在滅菌前調至約pH值為4.85。
用約20g/L Pharmamedia(商品蛋白)和約20g/L右旋糖制備成培養(yǎng)基3，在滅菌前調至約pH值為7.2。
用約10g/L肉類提取物、約10g/L右旋糖、約5g/L蛋白胨以及約2g/L酵母提取物制備而成培養(yǎng)基4，滅菌前調至約pH值為7。B.用真菌匍匐犁頭霉ATCC No.14849進行生物轉化。
按照下述方法制備8個“測試”培養(yǎng)物(T1a、T1b、T2a、T2b、T3a、T3b、T4a和T4b)在8支16×125mm玻璃試管每支中各加入約2.5mL滅菌生長培養(yǎng)基(分別為培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基4)，這些試管都帶有一個金屬帽(T1a、T1b、T2a、T2b、T3a、T3b、T4a和T4b)，然后把匍匐犁頭霉ATCC No.14849的芽孢加入所有測試培養(yǎng)物中。
將上述8支試管溫育于約29℃、約210rpm的轉速下振蕩。溫育約48小時(T1a、T2a、T3a、和T4a)或72小時(T1b、T2b、T3b和T4b)后，向試管培養(yǎng)物中加入2-喹喔啉羧酸原液(在DMSO中約50mg/mL，終濃度為約1mg/mL)約0.05mL。
在約29℃下繼續(xù)溫育12天后，抽提每個試管中的發(fā)酵肉湯，按照實施例1中的方法干燥合并后的有機提取物。C.用反相HPLC測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量。
按照實施例1中描述的方法，用反相HPLC對上述制備的每個提取物進行處理和分析。用幾套不同的實驗條件(即T1a、T1b、T2a、T2b、T3a、T3b、T4a和T4b)對這些HPLC分析測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量，這些產(chǎn)量提供于下表3。
表3
正如表3中顯示數(shù)據(jù)所表明的，HPLC分析顯示出了本發(fā)明微生物方法在所有測試培養(yǎng)基中可生產(chǎn)2-喹喔啉羧酸，其中所述的微生物是匍匐犁頭霉ATCC No.14849。表3的數(shù)據(jù)還表明，在4個測試培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基2能保證目的產(chǎn)物2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量百分比最高。
實施例III在燒瓶培養(yǎng)物中用匍匐犁頭霉ATCC No.14849或灰綠犁頭霉ATCC No.22752氧化2-甲基喹喔啉A.使用匍匐犁頭霉ATCC No.14849或灰綠犁頭霉ATCC No.22752進行生物轉化。
按照下述方法制備4個“測試”培養(yǎng)物(T1a、T1b、T2a和T2b)在4個錐形燒瓶(300mL)每個中各加入約25mL滅菌生長培養(yǎng)基(約20g/L右旋糖、約5g/L營養(yǎng)豆粉(nutrisoy flour)、約5g/L酵母提取物、約5g/L NaCl以及約5g/L K2HPO4制備而成，滅菌前用H2SO4將pH調至約7.0)，然后向其中加入匍匐犁頭霉ATCC No.14849(T1a、T1b)或灰綠犁頭霉ATCCNo.22752(T2a、T2b)的孢子。
將上述4個燒瓶培養(yǎng)物溫育于約29℃、約210rpm的轉速下振蕩。接種后立即(T2a)或約24小時(T2b)后，向灰綠犁頭霉ATCC No.22752燒瓶培養(yǎng)物中加入2-甲基喹喔啉原液(在約100％EtOH中約50mg/mL，最終濃度為約1mg/mL)約0.5mL在約48小時(T1a)或72小時(T1b)之后，向匍匐犁頭霉ATCC No.14849的燒瓶培養(yǎng)物中加入約0.5mL的2-甲基喹喔啉的原液(約100％乙醇中的約50mg/mL)，終濃度為約1mg/mL)。
在約29℃下繼續(xù)溫育24天(T1a)、16天(T1b)、25天(T2a)或24天(T2b)后，用4N HCl將燒瓶培養(yǎng)基發(fā)酵肉湯調至pH值為2。用2個25mL等份的EtOAc抽提每個燒瓶培養(yǎng)物的內(nèi)容物，在減壓的條件下把有機溶劑從合并后的EtOAc提取物中移取出來，生產(chǎn)粗產(chǎn)物。B.用反相HPLC測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量。
將所有上述方法制備的提取物都各自重懸于約5mL的MeOH∶ACN(3∶2，v/v)，用水稀釋至1∶19用于HPLC分析。按照實施例1中描述的方法進行HPLC分析。用幾套不同的實驗條件(例如T1a、T1b、T2a和T2b)對這些HPLC分析測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量，這些產(chǎn)量提供于下表4。
表4
表4中的數(shù)據(jù)表明，使用完整微生物，例如灰綠犁頭霉ATCC No.22752或匍匐犁頭霉ATCC No.14849，可以將2-甲基喹喔啉氧化成2-喹喔啉羧酸。在T1a、T1b、T2a和T2b中剩余的2-甲基喹喔啉等初始原料的％分別為約7％、7％、6％和6％。
實施例IV能將2-甲基喹喔啉轉化為2-喹喔啉羧酸的微生物的篩選用含有實施例1中描述的右旋糖、營養(yǎng)豆粉(nutrisoy flour)培養(yǎng)基2.5mL的試管培養(yǎng)各種微生物細胞。將以凍存甘油懸浮液形式保存的各種微生物的孢子或營養(yǎng)細胞(約1％v/v孢子或營養(yǎng)細胞原種保藏物)接種于單個試管中。在搖床上29℃下?lián)u床振蕩(210rpm)培養(yǎng)。約48小時后，向每支試管中加入10mg/mL的2-甲基喹喔啉DMSO溶液0.05mL。溫育約4天后，抽提每支試管的內(nèi)容物，按照實施例1的方法用HPLC分析單個提取物。用HPLC測定2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量，結果總結于表5中。
表5
實施例V在燒瓶培養(yǎng)物中用惡臭假單孢菌ATCC No.33015
氧化2-甲基喹喔啉用培養(yǎng)基5(營養(yǎng)肉湯(約32g/L)和甘油(約5g/L))培養(yǎng)惡臭假單孢菌ATCC No.33015細胞。將此前保存在約-70℃的惡臭假單孢菌ATCC No.33015甘油懸液約0.10mL接種到6個裝有約30mL培養(yǎng)基的錐形燒瓶(300mL)中。加入裝在15mL錐形聚丙烯離心管(Falcon，Becton Dickinson Labware)中的p-二甲苯約2mL，用Parafilm(Amerrican National Can)密封燒瓶，置于搖床上約29℃振蕩培養(yǎng)18小時。這些燒瓶培養(yǎng)物在650nm下測得的光密度為1.9。離心收集上述6個燒瓶中的細胞，用約250mL DPBS洗滌1次，然后將細胞重懸于盛裝在300mL錐形燒瓶內(nèi)的20mL的PBS(biowhittaker)中。
對應于約0.5g/L的初始濃度，加入0.1ml濃度約100mg/mL的2-甲基喹喔啉DMSO溶液開始生物轉化。約29℃下轉速為約225rpm振蕩培養(yǎng)的條件下，繼續(xù)溫育約4天。在不同時間取出生物轉化肉湯試樣，離心取出細胞后，按照需要用MeOH稀釋，然后用HPLC對試樣進行分析。這些試樣各取約20μL，注入到InertsiC8 HPLC柱(4.6×250mm)上進行分析。所有柱都用由ACN約0.05％的含水TFA(1∶4，v/v)組成的流動相以約1.0mL/min洗脫。在分別溫育1、2和4天后，2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量為約86％、90％和94％。
實施例VI在發(fā)酵培養(yǎng)物中用惡臭假單孢菌ATCC No.33015氧化2-甲基喹喔啉用約10L培養(yǎng)基5在發(fā)酵罐中培養(yǎng)惡臭假單孢菌ATCC No.33015細胞。將各自生長在裝有約50mL培養(yǎng)基5的錐形燒瓶(300ml)中的6種惡臭假單孢菌ATCC No.33015培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐中。向每個燒瓶培養(yǎng)物中接種惡臭假單孢菌ATCC No.33015孢子原種約175μL，插入裝有約2mL p-二甲苯的15mL聚丙烯離心管，用Parafilm密封燒瓶，約29℃下置于搖床上以210rpm轉速振蕩培養(yǎng)17小時。在把6個燒瓶培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐后，在2小時的時間段內(nèi)每隔20分鐘向發(fā)酵罐中加入約2mL等份p-二甲苯。此后，在3.5小時的時間段內(nèi)每隔20分鐘向發(fā)酵罐中加入約2.5mL等份p-二甲苯。然后停止加入二甲苯，在溫育后5.25小時加入2-甲基喹喔啉(約1.95g)和7.75小時加入2-甲基喹喔啉(約7.76g)。在最后一次加入2-甲基喹喔啉后繼續(xù)溫育約22小時。離心溫育培養(yǎng)基的試樣取出細胞。用MeOH稀釋，然后按照實施例V中的方法進行HPLC分析。該分析結果顯示2-喹喔啉羧酸的產(chǎn)量約81％。
權利要求
1.一種用微生物氧化2-甲基喹喔啉制備2-喹喔啉羧酸的方法，該方法包括讓所述2-甲基喹喔啉與一種微生物接觸，將得到的混合物在足以生產(chǎn)出一定量2-喹喔啉羧酸的條件下溫育，其中所述的微生物選自灰綠犁頭霉ATCC No.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480、假柱孢犁頭霉ATCCNo.24169、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、雅致放射毛霉ATCC No.6476、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865、單純粉孢革菌ATCC No.12675、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8688a、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8688b、刺孢小克銀漢霉ATCCNo.8983、刺孢小克銀漢霉ATCC No.9244、刺孢小克銀漢霉ATCC No.9245、刺孢小克銀漢霉ATCC No.10028b、刺孢小克銀漢霉ATCC No.26269、刺孢小克銀漢霉ATCC No.31690、刺孢小克銀漢霉ATCC No.36112、同宗(homothallica)小克銀漢霉ATCC No.16161、Cylindrocarpon destructansATCC No.66963、棉色二孢ATCC No.20575、玉米附球菌ATCC No.12723、葫蘆病霉ATCC No.14724、棒形青霉ATCC No.10426、杜克氏青霉ATCCNo.10440、平滑青霉ATCC No.11080、Pseudocochliobolus lunatus ATCCNo.24155、惡臭假單孢菌ATCC No.33015、惡臭假單孢菌ATCC No.202190、玫瑰紅紅球菌ATCC No.19067和Thamnostylum piriforme ATCC No.8686，以及它們的合適突變體；如果當所述微生物是上述的惡臭假單孢菌ATCCNo.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190時，在上述的惡臭假單孢菌ATCCNo.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190與所述2-甲基喹喔啉進行所述的接觸之前，應當通過與誘導劑相互作用來對上述的惡臭假單孢菌ATCCNo.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190進行誘導。
2.權利要求1中所述的方法，進一步包括2-喹喔啉羧酸的分離。
3.權利要求2中所述的方法，其中所述的分離是采用有機溶劑抽提所述混合物來進行。
4.權利要求3中所述的方法，其中所述有機溶劑是醋酸乙酯。
5.權利要求4中所述的方法，進一步包括把所述提取物進行層析。
6.權利要求2中所述的方法，其中所述分離是把所述2-喹喔啉羧酸從所述的混合物中吸附到樹脂上，并用有機溶劑把吸附的2-喹喔啉羧酸從樹脂上洗脫下來。
7.權利要求6中所述的方法，其中所述樹脂是聚合物吸附樹脂。
8.權利要求7中所述的方法，其中所述有機溶劑是醋酸乙酯或甲醇。
9.權利要求8中所述的方法，進一步包括把洗脫的2-喹喔啉羧酸從醋酸乙酯中結晶出來。
10.權利要求8中所述的方法，進一步包括把洗脫的2-喹喔啉羧酸從醋酸乙酯或甲醇中結晶出來。
11.權利要求1中所述的方法，其中所述微生物是完整微生物。
12.權利要求11中所述的方法，其中所述微生物包括洗滌后的所述微生物細胞。
13.權利要求12中所述的方法，進一步包括固定所述洗滌后的細胞。
14.權利要求12中所述的方法，其中所述洗滌后的細胞存在于含水溶劑中。
15.權利要求14中所述的方法，其中所述接觸是把所述2-甲基喹喔啉加入到所述溶劑中。
16.權利要求11中所述的方法，其中所述微生物存在于生長培養(yǎng)基中。
17.權利要求16中所述的方法，其中所述接觸是把所述2-甲基喹喔啉加入到所述生長培養(yǎng)基中。
18.權利要求1中所述的方法，其中所述微生物選自灰綠犁頭霉ATCCNo.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865、刺孢小克銀漢霉ATCC No.8983和棉色二孢ATCCNo.20575；以及它們的突變體。
19.權利要求18中所述的方法，其中所述微生物選自灰綠犁頭霉ATCCNo.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481、馬鈴薯早疫病鏈格孢ATCC No.11078、塔木里氏曲霉ATCC No.16865；以及它們的突變體。
20.權利要求19中所述的方法，其中所述微生物選自灰綠犁頭霉ATCCNo.22752、灰綠犁頭霉ATCC No.74480、匍匐犁頭霉ATCC No.14849、匍匐犁頭霉ATCC No.74481；以及它們的突變體。
21.權利要求20中所述的方法，其中所述微生物是匍匐犁頭霉ATCCNo.14849或匍匐犁頭霉ATCC No.74481。
22.一種微生物氧化2-甲基喹喔啉制備2-喹喔啉羧酸的方法，該方法包括讓所述2-甲基喹喔啉制備與一種微生物接觸，將得到的混合物在足以生產(chǎn)出一定量2-喹喔啉羧酸的條件下溫育，其中所述微生物是匍匐犁頭霉ATCCNo.14849或匍匐犁頭霉ATCC No.74481；以及它們的合適的突變體。
23.權利要求22中所述的方法，其中所述微生物存在于生長培養(yǎng)基中。
24.權利要求23中所述的方法，其中所述接觸是把所述2-甲基喹喔啉加入到所述生長培養(yǎng)基中。
25.權利要求1中所述的方法，其中所述微生物是惡臭假單孢菌ATCCNo.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190。
26.權利要求25中所述的方法，其中所述誘導劑是p-二甲苯。
27.權利要求26中所述的方法，其中所述惡臭假單孢菌ATCC No.33015或惡臭假單孢菌ATCC No.202190存在于生長培養(yǎng)基中。
28.權利要求27中所述的方法，其中所述p-二甲苯被加入到所述的生長培養(yǎng)基中。
29.權利要求28中所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基是裝在燒瓶中。
30.權利要求29中所述的方法，進一步包括在完成所述誘導后收集所述微生物的步驟。
31.權利要求30中所述的方法，其中所述收集是通過下述操作實現(xiàn)的離心所述燒瓶中的內(nèi)容物、傾析除去液體、洗滌細胞沉淀以及在緩沖液中重懸所述沉淀。
32.權利要求31中所述的方法，其中所述接觸是在所述重懸后把2-甲基喹喔啉加入到所述緩沖液中。
33.權利要求28中所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基是裝在發(fā)酵罐中。
34.權利要求33中所述的方法，其中在所述誘導后停止將p-二甲苯加入到生長培養(yǎng)基中。
35.權利要求34中所述的方法，其中所述接觸是在停止加入p-二甲苯后把2-甲基喹喔啉加入到生長培養(yǎng)基中。
36.一種用微生物氧化2-甲基喹喔啉制備2-喹喔啉羧酸的方法，該方法包括與誘導劑反應使所述微生物的酶被誘導后，讓所述2-甲基喹喔啉與該微生物接觸，將得到的混合物在足以生產(chǎn)出一定量2-喹喔啉羧酸的條件下溫育，其中所述微生物選自惡臭假單孢菌ATCC No.33015和惡臭假單孢菌ATCC No.202190；或者它們的合適突變體。
37.權利要求36中所述的方法，其中所述誘導劑是m-二甲苯或p-二甲苯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于微生物氧化2－甲基喹喔啉制備2－喹喔啉羧酸的方法,該方法包括讓2－甲基喹喔啉與一種微生物或其合適突變體接觸,然后將得到的混合物在足以生產(chǎn)出大量2－喹喔啉羧酸的條件下溫育。本發(fā)明的方法選擇性地進一步包括2－喹喔啉羧酸的分離和純化。
文檔編號C12R1/66GK1273276SQ0010654
公開日2000年11月15日 申請日期2000年2月12日 優(yōu)先權日1999年2月12日
發(fā)明者邁克爾·P·伯恩斯, 詹姆斯·J·考利, 約翰·W·王 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司