專利名稱：用于目的蛋白可溶性表達(dá)的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可實(shí)現(xiàn)目的蛋白可溶性表達(dá)的表達(dá)載體，特別是包含分別表達(dá)一種含二硫鍵氧化還原蛋白和目的蛋白的雙順反子的表達(dá)載體；還涉及用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是原核生物細(xì)胞，及利用所述載體或宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白的方法。
許多肽或蛋白可利用各種表達(dá)系統(tǒng)重組產(chǎn)生，如各種細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞。但當(dāng)用細(xì)菌作為外源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞時(shí)，常存在一些問題。例如外源蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)常見到包涵體的形成，因?yàn)樵S多治療有用的蛋白的穩(wěn)定天然狀態(tài)需要二硫鍵交聯(lián)等，而在細(xì)菌胞漿中不存在這種穩(wěn)定化影響。這些包涵體常需要進(jìn)一步處理以使外源蛋白溶解和再折疊，處理?xiàng)l件要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，對(duì)于不同的情形有不確定性。如果這些處理步驟不成功則從宿主細(xì)胞回收的生物活性蛋白量少甚至得不到。而且，這些處理方法常常是技術(shù)上困難的，經(jīng)濟(jì)上昂貴的，不能用于治療、診斷或其他研究用重組蛋白的實(shí)際生產(chǎn)。
為了克服這一問題，現(xiàn)有技術(shù)中已提出將目的蛋白與“伴侶蛋白“連結(jié)形成融合蛋白的方法。其中比較成功地達(dá)到可溶表達(dá)的是利用硫氧還蛋白作為伴侶蛋白進(jìn)行的融合表達(dá)，見LaVallie ER、DiBlasio EA、Kovacic S等，“克服了大腸桿菌胞漿中包涵件形成的一種硫氧還蛋白基因融合表達(dá)系統(tǒng)”，BIO/TECHNOLOGY，1993，Vol.11187-193。他們利用載體pTRXFUS以與硫氧還蛋白的融合蛋白形式表達(dá)了IL-3、IL-6、IL-11等，發(fā)現(xiàn)這些原本在大腸桿菌中以包涵體形式存在的外源蛋白均能以可溶性的形式存在。
但融合蛋白方法的缺點(diǎn)是需要后續(xù)的融合蛋白裂解等處理步驟，才能得到真正的目的蛋白。因而長(zhǎng)期以來本領(lǐng)域一直需要一種克服這種缺點(diǎn)的目的蛋白可溶性表達(dá)的方法和載體。
因而本發(fā)明的目的是提供一種可實(shí)現(xiàn)目的蛋白本身直接的可溶性表達(dá)的方法和載體，并且發(fā)現(xiàn)利用一種雙順反子載體可達(dá)到這一目的，其中第一個(gè)順反子表達(dá)一種含二硫鍵氧化還原酶(特別是硫氧還蛋白)，第二個(gè)順反子表達(dá)目的蛋白。
本發(fā)明涉及一種用于在細(xì)菌宿主中產(chǎn)生可溶性目的蛋白的表達(dá)載體，其以5′至3′方向含有下列元件(i)啟動(dòng)子；(ii)含有編碼一種含二硫鍵氧化還原酶之基因的第一順反子，該順反子在含二硫鍵氧化還原酶N-末端氨基酸的密碼子緊上游含有轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，在含二硫鍵氧化還原酶C-未端氨基酸的密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；(iii)含有編碼目的蛋白之基因的第二順反子，該順反子在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子緊上游含有起始信號(hào)，在目的蛋白C-末端氨基酸密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；其中啟動(dòng)子與第一順反子可操作地連接，所述載體在含二硫鍵氧化還原酶N-末端氨基酸密碼子的上游含有第一個(gè)SD序列，在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子上游含有第二個(gè)SD序列，所述載體是可選擇的、在細(xì)菌宿主中是可以自主復(fù)制的。
本發(fā)明還涉及含有上述載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主，特別是大腸桿菌。
本發(fā)明還涉及一種制備可溶性蛋白的方法，該方法包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)菌宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞，然后收集細(xì)菌，及從破碎細(xì)菌后所得上清液回收目的蛋白。
如上所述，本發(fā)明提供了一種供目的蛋白溶性表達(dá)的含有雙順反子結(jié)構(gòu)的載體，其中第一個(gè)順反子含有一種含二硫鍵氧化還原酶的編碼基因，第二個(gè)順反子含有目的蛋白的編碼基因。
本發(fā)明所述的含二硫鍵氧化還原酶是指能夠催化二硫鍵的形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞中氧化還原環(huán)境以利于硫醇二硫鍵交換的具有保守活性位點(diǎn)序列的含有二硫鍵的氧化還原蛋白。具體例子包括蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、硫氧還蛋白和glutaredoxin等(Loferer，H.(1995)J.Biol.Chem.27026178-26183)。這些蛋白在功能上有些差異，但都可用于本發(fā)明的目的，并且它們普遍分布于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中。例如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶見于真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中和原核細(xì)胞的周質(zhì)空間內(nèi)。它們可以用自身的二硫鍵交換折疊肽鏈中的硫醇。本發(fā)明優(yōu)選使用硫氧還蛋白基因。所述硫氧還蛋白基因可以是分離自大腸桿菌的(Laurent，T.C.等，J.Biol.Chem.239，1964，3436-3445)或分離自其他來源，如酵母(Porque G.P.等，J.Biol，Chem，245，1970，2362-2379)、藍(lán)細(xì)菌(GleasonF.K.等于“硫氧還酶、結(jié)構(gòu)和功能”[P.Gadal編]，1983，Editions du CentreNational de la Recherche Scientifique)、大鼠(Guerara J.等，1983，同上)、T4噬菌體(Soderberg，B，O等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1978，5827-5830)。還可以預(yù)期使用保留氧化還原活性位點(diǎn)的硫氧還蛋白衍生物或片段，所述活性位點(diǎn)為Cys-X-Y-Cys-Lys，其中X和Y獨(dú)立地為20種氨基酸中的任一種。對(duì)于大腸桿菌硫氧還蛋白，氧化還原活性肽序列為Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。還可以設(shè)想使用具有催化二硫鍵形成能力的硫氧還蛋白模擬肽，可以是天然來源的，也可以是合成的。本發(fā)明所用的含二硫鍵氧化還原蛋白基因的克隆、衍生物或片段基因的生成(如酶切、誘變等)、甚至肽或蛋白的化學(xué)合成相信在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選使用大腸桿菌的硫氧還蛋白基因。
可利用本發(fā)明載體或方法進(jìn)行可溶性的目的蛋白可以是任何具有二硫鍵交聯(lián)的蛋白。具體實(shí)例可舉出胰島素、溶菌酶、干擾素、腎素、催乳素、纖溶酶原活化物、人α-1胰蛋白酶抑制物、凝血因子vIII、各種細(xì)胞因子及其受體如IL-6和IL-6R或它們的片段等等。這些蛋白的縮碼基因可以是已知的，可從公眾可得的載體中直接獲得或者從生物體細(xì)胞中克隆而得。
對(duì)本發(fā)明載體中的啟動(dòng)子沒有特別的限制，只要在所選擇的細(xì)菌宿主中有功能即可。非限制性地可以舉出色氨酸操縱子啟動(dòng)子、λpL啟動(dòng)子等。
本發(fā)明含雙順反子結(jié)構(gòu)的載體可以按本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建。關(guān)于雙順反子構(gòu)建的一般描述見Schoner等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.815403-5407和Schoner等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.838506-8510.BioTechniques 20346-350(1996年3月)中描述了利用順反子表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的載體可以從任何在細(xì)菌宿主(尤其是大腸桿菌)中可自主復(fù)制的載體構(gòu)建而得，優(yōu)選質(zhì)粒載體。為了便于選擇轉(zhuǎn)化子，該載體應(yīng)含有選擇標(biāo)志如β-半乳糖苷酶基因，各種抗菌素抗性基因，如氨芐青毒素抗性。含有選擇性標(biāo)志和適當(dāng)啟動(dòng)子的起始載體是已知的，可以經(jīng)商業(yè)渠道購(gòu)得，或從這些已知的載體容易地構(gòu)建而成。可用于本發(fā)明質(zhì)粒構(gòu)建的一個(gè)方便的起始載體是pTRXFUS，其構(gòu)建方法見Bio/Technology vol.11，1993年2月，187-192。該質(zhì)粒是基于pUC-18構(gòu)建的，含有ColE復(fù)制起始區(qū)，作為選擇標(biāo)志的β-半乳糖苷酶基因和位于大腸桿菌硫氧還蛋白(trxA)基因上游的噬菌體λpL啟動(dòng)子。在trxA的3′-末端有一個(gè)編碼如下接頭肽的DNA序列“-GSGSGDDDDK-”。在該載體再下游有一個(gè)含限制性位點(diǎn)的多接頭DNA序列和大腸桿菌天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄終止子序列。有利的是，在該質(zhì)粒中已預(yù)先插入了大腸桿菌硫氧還蛋白基因trxA，該質(zhì)粒的圖譜見


圖1。
作為實(shí)例，本發(fā)明構(gòu)建了質(zhì)粒pZD2，其構(gòu)建方法詳見實(shí)施例和圖2中所示。表達(dá)載體pZD2中第一個(gè)順反子編碼大腸桿菌硫氧還蛋白，而插入的外源基因?qū)?gòu)成第二個(gè)順反子。在該表達(dá)載體上可被利用的克隆位點(diǎn)有NdeI、NheI、BamRI、SalI和PstI。當(dāng)利用NdeI位點(diǎn)克隆外源其因時(shí)，第二個(gè)順反子將只表達(dá)所插入的外源基因；而當(dāng)利用其余酶切位點(diǎn)克隆外源基因時(shí)，第二個(gè)順反子可以實(shí)現(xiàn)目的基因與φ10蛋白部分序列(前11個(gè)氨基酸)的融合表達(dá)。在后一情形中，所表達(dá)融合蛋白的φ10蛋白部分可用于蛋白的純化。另外，表達(dá)載體pZD2中保留了原始載體pTRXFUS中的KpnI位點(diǎn)和腸肽激酶切點(diǎn)，因而保留了原始載體可融合表達(dá)外源基因的特性。這些特點(diǎn)使該表達(dá)載體具有特別的使用靈活性。
在表達(dá)載體pZD2的構(gòu)建過程中還得到了另一表達(dá)載體pZD1。與pZD2相比基本相同，只是在第二個(gè)順反子的BamHI位點(diǎn)上增加了編碼IR-6Rα的BamHI/XbaI片段(約700bp)。換句話說，pZD1相當(dāng)于在pZD2表達(dá)載體中克隆了外源基因IL-6Rα編碼序列。在pZD1轉(zhuǎn)化大腸桿菌GI724后，將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并用色氨酸誘導(dǎo)，破菌后從上清液中(可溶部分)觀察到了硫氧還蛋白(約13kD)和帶有φ10蛋白頭11個(gè)氨基酸的IL-6Rα(約19KD)的表達(dá)。即實(shí)現(xiàn)了硫氧還蛋白與IL-6Rα的非融合表達(dá)。在該表達(dá)載體中，第一個(gè)順反子表達(dá)大腸桿菌硫氧還蛋白，第二個(gè)順反子表達(dá)帶有φ10頭11個(gè)氨基酸的IL-6Rα。當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，若將IL-6Rα基因克隆在pZD2的NdeI位點(diǎn)，則第二個(gè)順反子只編碼IL-6Rα，可實(shí)現(xiàn)不含φ10蛋白的片段的IL-6Rα的可溶性表達(dá)。
同樣，在pZD2的BamHI位點(diǎn)克隆來自質(zhì)粒pBV-DL6的IL-6cDNA片段，得到了本發(fā)明的另一表達(dá)載體pZD-IL-6。同樣，該表達(dá)載體的第一個(gè)順反子編碼大腸桿菌硫氧還蛋白，而第二個(gè)順反子編碼N端帶有φ10蛋白頭11個(gè)氨基酸的N端缺失的約17.5kD的IL-6。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，幾乎只在破菌離心的上清液中發(fā)現(xiàn)IL-6的表達(dá)，即為17.5kD的蛋白。
在上述構(gòu)建的表達(dá)載體中，啟動(dòng)子、第一個(gè)順反子的SD序列、硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)和編碼基因均含于原始表達(dá)載體pTRXFUS中。
在上述構(gòu)建的表達(dá)載體中，包括第二個(gè)順反子的SD序列、第一個(gè)順反子的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和第二個(gè)順反子的起始信號(hào)的第一和第二順反子的連接關(guān)系如下
其中A＝第二順反子的SD序列B＝第一順反子的終止信號(hào)C＝NdeI位點(diǎn)，含第二順反子的起始信號(hào)ATG。
箭頭表示腸肽激酶切點(diǎn)。
可以看出，第二順反子的SD序列位于第二順反子的起始信號(hào)的上游，但不一定在第一順反子的終止信號(hào)的下游，也可以在其上游。還可以設(shè)想，SD序列與起始信號(hào)可能相重疊。
在上述構(gòu)建的表達(dá)載體中含有用于轉(zhuǎn)化子挑選的選擇標(biāo)志，如氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因等。
可按常規(guī)方法將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主中，特別是大腸桿菌細(xì)胞中，如Kushner法。當(dāng)轉(zhuǎn)化子在適合細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，編碼含二硫鍵氧化還原蛋白和目的蛋白的基因被分別表達(dá)，產(chǎn)生可溶性目的蛋白。優(yōu)選的培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。大腸桿菌一般在含可利用碳源和氮源的營(yíng)養(yǎng)基中在通氣條件下進(jìn)行，如振蕩培養(yǎng)或深層培養(yǎng)。培養(yǎng)基中優(yōu)選的碳源如包括葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和淀粉等，也可以包括木糖、半乳糖、麥芽糖等。優(yōu)選的氮源包括如酵母提取物、蛋白胨、棉籽粉、大豆粉、玉米浸液等，也可以在培養(yǎng)其中加入無機(jī)或有機(jī)氮化合物，如硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨、脲和氨基酸等。必要時(shí)可以向培養(yǎng)基中加入無機(jī)鹽，如碳酸氫鉀、磷酸鈉或鉀、氯化鈉或鉀及鎂鹽、銅鹽等。按常規(guī)方法混合培養(yǎng)基后，接種轉(zhuǎn)化子并在20-42℃，優(yōu)選在35-38℃下培養(yǎng)幾小時(shí)到幾十個(gè)小時(shí)，例如2-60小時(shí)。適當(dāng)時(shí)，在培養(yǎng)過程中加入表達(dá)誘導(dǎo)物以誘導(dǎo)表達(dá)，如色氨酸等。
所表達(dá)的目的蛋白一般以可溶的形式保留在轉(zhuǎn)化子的胞漿中?？砂闯Ｒ?guī)方法從培養(yǎng)物中回收目的蛋白。一般通過過濾或離心收集細(xì)菌，然后通過真空濃縮或超聲處理將細(xì)菌細(xì)胞破碎。然后例如離心收集上清液?？砂闯Ｒ?guī)方法從上清液分離純化目的蛋白，例如HPLC、冷凍干燥、調(diào)節(jié)pH、離子交換樹脂吸附、吸附劑(如硅膠、氧化鋁、纖維素)上的吸附、凝膠過濾及親和層析等。對(duì)于與φ10蛋白融合表達(dá)的目的蛋白，可利用偶聯(lián)有抗φ10蛋白抗體的親和柱層析分離。
下面以詳細(xì)的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中引用了下列附圖
圖1.表達(dá)載體pTRXFUS示意2.表達(dá)載體pZD1和pZD2及其構(gòu)建過程trxA為大腸桿菌硫氧還蛋白；SD代表第二順反子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；φ10代表噬體φ10蛋白的前11個(gè)氨基酸；Amp表示氨芐青霉素抗性；Ori表示ColEl復(fù)制起點(diǎn)；pL表示λ噬菌體左向啟動(dòng)子。
圖3.SDS-PAGE分析IL-6Rα片段的表達(dá)1，分子量標(biāo)準(zhǔn)物；2，5為超聲破碎后的沉淀；3，6為超聲破碎后的上清；4，7為全菌體裂解物；8為對(duì)照菌裂解物。
圖4.SDS-PAGE分析IL-6的表達(dá)1，對(duì)照菌全菌體裂解物；2，菌體超聲破碎后上清；3，為全菌裂解物；4，為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
實(shí)施例1.pZD1的構(gòu)建(1)含部分雙順反子表達(dá)元件的DNA片段的獲得以質(zhì)粒pET-6R(B)(按段聚寶等，Science in China(Series B)Vol.38 No.1(1995)，p1321-1331描述的方法構(gòu)建)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。PCR所用引物如下上游引物序列為5′-GGGTACCAAGGAGTAACATATGGCTAGCATGACT-3′，含有KpnI酶切位點(diǎn)、第2個(gè)順反子的SD序列、第1個(gè)順反子的終止密碼子和第2個(gè)順反子的起始密碼子，其3′端與ET-6R(B)的φ10蛋白部分序列互補(bǔ)；下游引物序列為5′-CGGGATCCATTACTCAGCTGGAG-3′，含有BamHI位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于hIL-6R的第958-972bp序列。PCR采用以下參數(shù)94度變性40秒，52度退火30秒，72度延伸40秒，最后一個(gè)循環(huán)72度延長(zhǎng)7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，用酚/氯仿抽提一次，沉淀干燥，溶于ddH2O中。
(2)(1)中獲得的片段用KpnI和EcoRV酶切，得到處理過的雙順反子表達(dá)元件；含有翻譯終止并可有效再起始的表達(dá)元件，同時(shí)為了引入φ10蛋白的部分序列供融合表達(dá)；(3)載體的處理以載體pTRXFUS(Invitrogen)為起始載體，用Ndel進(jìn)行酶切，以破壞此NdeI位點(diǎn)。Klenow酶補(bǔ)平后，再用T4DNA連接酶連接。得到修飾的載體pTRXFUS(-)。再用BamHI酶切，補(bǔ)平后再用KpnI酶切。
(4)步驟(3)所得載體與(2)所得片段連接，得到了帶有IL-6Rα片段的雙順反子表達(dá)載體pZD1，此載體已含有供非融合可溶性表達(dá)所需的元件-硫氧還蛋白和雙順反子元件；同時(shí)可以用于檢測(cè)IL-6R的表達(dá)。
實(shí)施例2.pZD2的構(gòu)建pZD1經(jīng)BamHI和XbaI酶切處理，去除IL-6R片段；然后補(bǔ)平，用T4DNA連接酶連接便得到了最終的雙順反子表達(dá)載體pZD2。其中第一個(gè)順反子編碼大腸桿菌硫氧還蛋白，而插入的外源基因?qū)?gòu)成第二個(gè)順反子。表達(dá)載體pZD2上可被利用的克隆位點(diǎn)(單酶切位點(diǎn))有NdeI、NheI、BamHI、SalI和PstI。其中NdeI位點(diǎn)可用于完全非融合表達(dá)，而其余酶切位點(diǎn)則供目的基因與φ10蛋白部分序列的融合表達(dá)。而且此表達(dá)載體中保留了原始載體pTRXFUS中的KpnI位點(diǎn)與腸肽激酶(Enterokinase)切點(diǎn)，因而保留了原始載體可融合表達(dá)外源基因的特性。pZD2中這些單克隆位點(diǎn)均為酶切鑒定所證實(shí)。
實(shí)施例3.pZD-IL6的構(gòu)建將pZD2用BamHI酶切，補(bǔ)平后再用SalI酶切。然后，從pBV-DL6(按任啟生等，中國(guó)免疫學(xué)雜志，1992，8(3)1中描述的方法構(gòu)建)上用EcoRI和SalI切下IL-6 cDNA片段，與經(jīng)過上述處理的pZD2連接。得到pZD-IL-6。轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌K12菌株GI724(ATCC55151)，挑選重組菌落，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。
實(shí)例例4.IL-6R的可溶性表達(dá)及檢測(cè)將含有pZD1(攜有IL-6R的片段)的大腸桿菌GI724接種至IMC培養(yǎng)液中(M9培養(yǎng)液加上0.5％葡萄糖，0.2％酪蛋白水解氨基酸和100μg/ml的氨芐青霉素)。30℃搖菌至OD≈0.5時(shí)，加入色氨酸(濃度為100ug/ml)，誘導(dǎo)表達(dá)4.5小時(shí)。取1.5ml誘導(dǎo)表達(dá)菌液，離心收菌，加入400ulTE懸浮菌體。超聲破碎5分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘。取20ul上清，加入等體積的2倍載樣緩沖液；沉淀懸浮于50ulTE中，加入等體積的2倍載樣緩沖液。在15％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。判斷表達(dá)產(chǎn)物是否呈可溶性狀態(tài)。結(jié)果表明，與含有pTRXFUS的對(duì)照相比，在約19KD處有特異的蛋白條帶，而且均存在于菌體破碎后的上清中，說明表達(dá)產(chǎn)物IL-6R受體的片段是以可溶性形式存在的，而且實(shí)現(xiàn)了與硫氧還蛋白(約13KD)的非融合表達(dá)。
實(shí)施例5.IL-6的可溶性表達(dá)及檢測(cè)
將含有表達(dá)質(zhì)粒pZD-IL-6的大腸桿菌GI724接種至IMC培養(yǎng)液中(M9培養(yǎng)液加上0.5％葡萄糖，0.2％酪蛋白水解氨基酸和100μg/ml的氨芐青霉素)。30℃搖菌至OD≈0.5時(shí)，加入色氨酸(濃度為100ug/ml)，誘導(dǎo)表達(dá)4.5小時(shí)。取1.5ml誘導(dǎo)表達(dá)菌液，離心收菌，加入400ulTE懸浮菌體。超聲破碎5分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘。取20ul上清，加入等體積的2倍載樣緩沖液；沉淀懸浮于50ul TE中，加入等體積的2倍載樣緩沖液。在15％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。判斷表達(dá)產(chǎn)物是否呈可溶性狀態(tài)。結(jié)果表明，與未含有pTRXFUS的對(duì)照相比，在約17KD處有一特異蛋白條帶，與IL-6的預(yù)期分子量一致，而且此條帶完全存在于菌體破碎后的上清中，說明IL-6是可溶性表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種用于在細(xì)菌宿主中產(chǎn)生可溶性目的蛋白的表達(dá)載體，其以5′至3′方向含有下列元件(i)啟動(dòng)子；(ii)含有編碼一種含二硫鍵氧化還原酶之基因的第一順反子，該順反子在含二硫鍵氧化還原酶N-末端氨基酸的密碼子緊上游含有轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，在含二硫鍵氧化還原酶C-末端氨基酸的密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；(iii)含有編碼目的蛋白之基因的第二順反子，該順反子在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子緊上游含有起始信號(hào)，在目的蛋白C-末端氨基酸密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；其中啟動(dòng)子與第一順反子可操作地連接，所述載體在含二硫氧化還原酶N-末端氨基酸密碼子的上游含有第一個(gè)SD序列，在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子上游含有第二個(gè)SD序列，所述載體是可選擇的、在細(xì)菌宿主中是可以自主復(fù)制的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述含二硫鍵氧化還原酶是蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、硫氧還蛋白或glutaredoxin。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表達(dá)載休，其中所述含二硫鍵氧化還原酶是一種硫氧還蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中所述硫氧還蛋白是大腸桿菌硫氧還蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中目的蛋白是具有二硫鍵交聯(lián)的蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中目的蛋白選自胰島素、溶菌酶、干擾素、腎素、催乳素、纖溶酶原活化物、人α-1胰蛋白酶抑制物、凝血因子VIII、各種細(xì)胞因子和其受體或它們的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子為λ噬菌體左向啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中該載體為一種質(zhì)粒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中第二個(gè)順反子的SD序列在第一個(gè)順反子的終止密碼子的上游。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中在第一和第二順反子的接頭處含有以下序列AAGGAGTAACATATG。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一的表達(dá)載體，其選自載體pZD1、pZD2和pZD-IL6。
12.用權(quán)利要求1-10之一的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其為一種細(xì)菌宿主。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其為一種大腸桿菌宿主。
15.一種制備可溶性蛋白的方法，其包括用權(quán)利要求1-10之一的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)菌宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞，然后收集細(xì)菌，并從破碎細(xì)菌后所得上清液中回收目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可實(shí)現(xiàn)目的蛋白可溶性表達(dá)的表達(dá)載體,其包括分別表達(dá)一種含二硫鍵氧化還原蛋白和目的蛋白的雙順反子結(jié)構(gòu),用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及利用所述載體或宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N15/61GK1271777SQ0010874
公開日2000年11月1日 申請(qǐng)日期2000年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者段聚寶, 鄒民吉, 王嘉璽, 蔡欣 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所