專利名稱：鑒別冬蟲夏草的基因序列及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鑒別冬蟲夏草的基因序列及方法，是利用冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的獨特性，做為鑒別冬蟲夏草和其他蟲草的異同指標。
在冬蟲夏草的既有研究文獻中只見于標本的采集、描述和鑒定，而對于一些具藥用價值的冬蟲夏草也只停留在代謝產(chǎn)物所具有何種防治效用的活性成份介紹；由于冬蟲夏草的有性世代對應多種無性世代，且目前的生活史仍不清楚，加上其菌種不易采集、保存困難，至今尚無法以人工形成子座，因此無論生活史中的有性世代對應無性世代的關系及分類鑒定都呈現(xiàn)混亂無一定標準可參照的現(xiàn)象；這種現(xiàn)象相對于近年來華人地區(qū)將冬蟲夏草列為健康食品而大量食用的情形，實令人擔憂，因為廠商可能用了未經(jīng)證實的非純正的冬蟲夏草去生產(chǎn)這類食品，而消費者則因此食用了不具有冬蟲夏草某些活性成份的無效產(chǎn)品，這樣的惡性循環(huán)將違背了冬蟲夏草原本對人類健康的貢獻良意。
有鑒于目前冬蟲夏草的分類鑒定仍無一套標準可循的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供一種鑒別冬蟲夏草的基因序列以及應用該基因序列作為鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚姆椒ǎ钛a這方面的空白，該方法可作為鑒別純正冬蟲夏草的重要手段。
為此本發(fā)明人試著利用物種分類鑒定上最常用的核糖體RNA基因，希望透過對核糖體RNA基因的分析能找到鑒別冬蟲夏草的參考依據(jù)；而在既有的技術中18S核糖體RNA基因曾被做為真菌的屬與屬之間的分類依據(jù)，因此本發(fā)明更將核糖體RNA基因的利用限定在18S核糖體RNA基因。另外供做本發(fā)明操作找尋鑒定依據(jù)的冬蟲夏草標本是在不同時間、地點所分別取得的，此舉是為達到其客觀性，并且可觀察這些來源不同的冬蟲夏草的物性；另外本發(fā)明的其他供試標本也包括其他的蟲草及寄存于菌種中心的似冬蟲夏草和已存于基因資料庫(Gen Bank)與冬蟲夏草親緣關系相近的其他蟲草，借著這些供試標本所施做后的資料數(shù)據(jù)與冬蟲夏草做比對，以確定所獲得的依據(jù)能客觀地鑒別出冬蟲夏草的專一特性。
本發(fā)明是將所有供試樣本的DNA萃取物經(jīng)既知的引子組NS1/NS2、NS3/NS4、NS5/NS6及NS7/NS8去進行其18S核糖體RNA基因的PCR擴增，再將PCR擴增產(chǎn)物以自動定序儀進行基因序列的排序，接著利用基因序列進行冬蟲夏草標本與各供試標本的異同比較。由基因序列的對比發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列具有和其他蟲草甚至親緣關系最接近的其他蟲草屬都不同的獨特排列，借著這段基因序列和其他物種的同一段基因序列的比較，可以馬上確立其冬蟲夏草的真實性，因此該段基因序列足可稱做鑒別冬蟲夏草的參照性指標；另外，在確立冬蟲夏草于引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列為鑒別冬蟲夏草的參照性依據(jù)后，通過將任一物種的DNA萃取物分別進行以引子組NS3/NS4、NS5/NS6去擴增其18S核糖體RNA基因的PCR反應，并將PCR產(chǎn)物定序排列而獲得該段基因序列的排列結果，再將該結果與既知的冬蟲夏草同段基因序列做比較以確認該物種是否符合冬蟲夏草的特有象征的整個作業(yè)程序，也成為鑒別冬蟲夏草的方法。以下是本發(fā)明進行上述標本操作的實施例，因最終結果是存在于引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的變化，故本發(fā)明未列出存在于引子組NS1/NS2及NS7/NS8間的18S核糖體RNA基因序列的排列結果。
下面結合較佳實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明如下。


圖1是各引子在18S核糖體RNA基因的位置示意圖；圖2是表5在引子組NS3/NS4間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；圖3是表5在引子組NS5/NS6間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；圖4是蟲草屬菌株在引子組NS3/NS4間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；圖5是蟲草屬菌株在引子組NS5/NS6間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；
圖6是表8的演化樹圖；圖7是表9的演化樹圖；圖8是表10的演化樹圖；圖9是冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列排列圖。
本發(fā)明所利用的冬蟲夏草標本、蟲草屬標本及蟲草屬菌株分別如表1～表3所示，其中表1的冬蟲夏草標本在同一標本中又分以菌核和子座兩部份，藉以比對在同一標本中菌核和子座的差異，這些待試的樣品經(jīng)培養(yǎng)及DNA萃取后開始進行其18S核糖體RNA基因(18SrRNA gene)于不同引子組的PCR擴增，其利用的引子的來源及序列如表4所示，而該引子在18S核糖體RNA基因的作用位置如
圖1所示；本發(fā)明進行PCR擴增時，其PCR的反應條件為起始變性溫度98℃、2分鐘；變性溫度(denature)95℃；煉合溫度(annealing)52℃、45秒；延展溫度(extension)72℃、2分鐘，循環(huán)35周期；最后延展溫度72℃、10分鐘。經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物直接以純化試劑(High Pure PCR Product Purification Kit)進行純化并利用自動定序儀(Applied Biosystems 373 DNA Sequencer)進行DNA的定序，再以螢光試劑(Tag Dye Deoxy Terminor Cycle Sequencing Kit)進行標定分析；上述經(jīng)定序后的基因序列分別向歐洲分子生物實驗室EMBL(EuropeanMolecular Biology Laboratory)登錄并取得登錄號碼，其中表1的登錄號碼條列于表5，表2的登錄號碼條列于表6，表3的登錄號碼條列于表7，在表5～表7中分別就NS3、4及NS5，6引子組分別登錄，其中表2中的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)由于為既知的菌種，故不重復登錄而未列于表6中。
將冬蟲夏草標本的18S核糖體RNA基因序列全部列出其資料是龐大的且對于確定冬蟲夏草所具有的特殊序列模式也未有明顯的幫助，故本發(fā)明人在分析比較整段18S核糖體RNA基因序列后，只歸納出引子組NS3/NS4及引子組NS5/NS6間的部份18S核糖體RNA基因序列的排列情況并做部份列出，做為冬蟲夏草物性的判斷，其中圖2是表5在引子組NS3/NS4間18S核糖體RNA基因序列的部份排列結果，其第1～16欄分別為標本代號Cs824af、Cs824b、W1023f、Cs7528A1、Cs7528A2、Cs7528Jf、Cs7528Jh、Cs7528Hf、Cs7528Hh、T1023f、S1023f、H102-3f、K1023f、Cs1014df、Cs824ab、Cs824ab。圖3則是表5在引子組NS5/NS6間18S核糖體RNA基因序列的部份排列結果，其第1～15欄分別為標本代號Cs824af、Cs824ab、W1023f、Cs7528A1、Cs7528A2、Cs7528Jf、Cs7528Jh、Cs7528Hf、Cs7528Hh、T1023f、S1023f、H1023f、K1023f、Cs1014df、Cs1014db。由圖2、圖3可知，所有冬蟲夏草標本在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列均相同，以此可證明表1中由各個不同來源、時間所搜集到的野生冬早夏草標本為相同的真菌物種，及同一個冬蟲夏草標本的子座及菌核具有完全相同的18S核糖體RNA基因序列，為同一真菌物種所組成。
圖2、圖3的18S核糖體RNA基因序列的排列結果讓我們了解了冬蟲夏草的物性以及其在引子組NS3/NS6間18S核糖體RNA基因序列的排列情況，惟該區(qū)域的序列是否足以成為冬蟲夏草與其他蟲草的分辨關鍵，仍需針對冬蟲夏草標本以及其他蟲草屬類緣近屬樣品在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的排列進行比較才能有定論，而這些基因序列的排列情形分別如圖4、圖5所示，其中圖4是冬蟲夏草標本和其他蟲草屬類緣近屬樣品在引子組NS3/NS4間的18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；圖5是冬蟲夏草標本和其他蟲草屬類緣近屬樣品在引子組NS5/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形。在圖4所顯示的菌株由第1～18欄分別為冬蟲夏草C.Sinensis Cs824af、Cs7528A1、Cs7528Jf、Cs7528Hh、T1023f、H1023f；其他蟲草標本C.liangshanensis CC1014af；C.militaris Cm824a、LM1207f；P.ninchukispora CCRC 31900；C.memorabilisATCC 36743；C.militaris ATCC 26848；C.ophioglossoides ATCC 36865；Cordyceps sp.ATCC 36337；C.sinensis CCRC 36421；C.capitata(取自基因資料庫from Gen Bank)；C.ophioglossoides(取自基因資料庫)。由圖4的基因序列排列情況可區(qū)別出冬蟲夏草和其他蟲草的不同，由于圖4只是就該引子組的18S核糖體RNA基因序列的一部份呈現(xiàn)，所以在第15欄的ATCC 36337和第16欄的CCRC 36421的基因序列與冬蟲夏草的基因序列感覺非常近似，甚至第8欄的CC1014af則完全一致，如此是否將難以借此印證冬早夏草的基因序列在此段引子組間的特殊排列性？惟在發(fā)明人實際就整段基因序列的觀察上，在此段基因序列570個鹽基(base pair)中，ATCC36337有16個鹽基而CC1014af也有4個鹽基和冬蟲夏草標本不同，故其近似度雖高，但在引子組NS3/NS4間的冬蟲夏草的18S核糖體RNA基因序列的排列情形仍與其他蟲草不同，故可藉此區(qū)別出真正的冬蟲夏草。
圖5各個蟲草屬菌株在引子組NS5/NS6間部份18S核糖體RNA基因序列的排列情形，其中第1-15欄的菌株分別為冬蟲夏草C.sinensisCs7528A1、Cs7528Jf、Cs7528Hh、S1023f、H1023f；C.liangshanensisCC1014af、CC1014ab；C.militaris Cm824a、LM1207f；P.ninchukispora CCRC31900；C.memorabilis ATCC 36743；C.militaris ATCC 26848；C.ophioglossoides ATCC 36865；Cordyceps sp.ATCC 36337；C.sinensis CCTC36421。在圖5中與冬蟲夏草基因序列最相近的是CC1014af及CC1014ab，但在引子組NS5/NS6這段基因序列290個鹽基中仍有14個鹽基是不同；因此由此段基因序列的排列情形仍可將冬蟲夏草和其他蟲草做明確的區(qū)別。由圖4及圖5的基因序列排列結果可得到一個結論，那就是冬蟲夏草的18S核糖體RNA基因序列在引子組NS3/NS6間具有其序列的獨特性，并藉此成為鑒別冬早夏草和其他蟲草異同的重要指標。上述的過程證明了本發(fā)明所提供的野生冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的獨特性及與其他蟲草基因序列的相異性，以下則是藉由演化圖來驗證本發(fā)明的冬蟲夏草的屬性，以便支持其確是為冬蟲夏草無誤。其是將表1～表3中及由基因資料庫(Gen Bank)中已發(fā)表的蟲草屬與本發(fā)明的冬蟲夏草進行親緣關系的比較；如表8是將冬蟲夏草在引子組NS3/NS4間的18S核糖體RNA基因序列與取自基因資料庫上的蟲草屬類緣近屬以自動定序儀(Seq App)定序，再以S.cerevisiae為out group利用PAUP4.0(Phylogenetic Analysis Using Parsimony 4.0)進行演化樹計算及以Tree View 3.0(Diving of Environmental and Evolutionary BiologyIBLS)建立一個如圖6所示的演化樹圖；從圖6顯示的結果得知，包括冬蟲夏草的所有內(nèi)座菌目(Hypocreales)的菌種均分在同一群，證明了本發(fā)明所供試的冬蟲夏革標本隸屬于一種內(nèi)座菌目。另外表9及表10的菌種同樣經(jīng)定序、演化樹計算后所得的演化樹圖如圖7、圖8所示，其中圖7是取引子組NS3／NS4間的18S核糖體RNA基因序列以H．luta為Outgroup，圖8是取引子組NS5／NS6間的18S核糖體RNA基因序列以A.terveus為Outgroup；由圖7、圖8的結果顯示，本發(fā)明所供試的不同產(chǎn)地、來源和時間的冬蟲夏草標本均分在同一群，證實其源于同一物種，而涼山蟲草C.liangshanensis和冬蟲夏草的親緣關系雖然最近，但由演化圖上仍可清楚地判別其群屬。由圖6至圖8也證明了本發(fā)明所供試的不同來源的標本確為純正的冬蟲夏草無誤。
綜上所述，借著冬蟲夏草在引子組NS3／NS6間的18S核糖體RNA基因序列的特有排列結果(如圖9)可以成為鑒別冬蟲夏草與其他蟲草差異性的指標。
表1．本發(fā)明所使用的冬蟲夏草標本
表2本發(fā)明所使用的蟲草屬標本及酵母菌
表3．本發(fā)明所使用的蟲草屬菌株及其他參考菌株
表4．本發(fā)明所使用的引子
表5.冬蟲夏草的18S核糖體RNA基因序列登錄編號 ○登錄中表6．蟲草屬標本的18S核糖體RNA基因序列登錄編號
表7．蟲草屬菌株的18S核糖體RNA基因序列登錄編號
○登錄中表8．用于計算圖6的系統(tǒng)演化關系圖的標本及其序列登錄編號
表9用于計算圖7的系統(tǒng)演化關系圖的標本及其序列登錄編號
表10．用于計算圖8的系統(tǒng)演化關系圖的標本及其序列登錄編號
○登錄中
權利要求
1．一種鑒別冬蟲夏草的基因序列，是指以引子組NS3/NS6進行冬蟲夏草的18S核糖體RNA基因的PCR擴增所得如下的基因序列冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)在NS3/NS4間的DNA序列1 tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcgtatattaaag ttgttgtggt61 taaaaagctc gtagttgaac cttgggcctg gctggccggtccgcctcacc gcgtgtactg121 gtccggccgg gcctttccct ctgtggaacc ccatgcccttcactgggcgt ggcggggaaa181 caggactttt actttgaaaa aattagagtg ctccaggcaggcctatgctc gaatacatta241 gcatggaata atgaaatagg acgcgcggtt ctattttgttggtttctagg accgccgtaa301 tgattaatag ggacagtcgg gggcatcagt attcaatggtcagaggtgaa attcttggat361 ccattgaaga ctaactactg cgaaagcatt tgtcaaggatgttttcatta atcaggaacg421 aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtcttaaccataa actatgccga481 ctagggatcg gacgatgtta ttttttgact cgttcggcaccttacgagaa atcaaagtgc541 ttgggctcca gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactt；冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)在NS5/NS6間的DNA序列1 aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgcacgcgcgctac actgacggag61 ccagcgagtc ctcccttggc cggaaggccc gggtaatcttgttaaacttc gtcgtgctgg121 ggatagagca ttgcaattat tgctcttcaa cgaggaatccctagtaagcg caagtcatca181 gcttgcgttg actacgtccc tgccctttgt acacaccgcccgtcgctact accgattgaa241 tggctcagtg aggcgtccgg actggcccag gggggtgggaaaccgccccc cagggccggg301 aagctctcca aactcggtca tttagaggaa gtaaaagtcgtaacaaggtc tccgtaggtg361 aacctgcgga。
2．一種利用權利要求1所述的基因序列鑒別冬蟲夏草的方法，是將待鑒定物的DNA萃取物分別以引子組NS3/NS4、NS5/NS6進行PCR反應擴增其18S核糖體RNA基因，擴增后的PCR產(chǎn)物再以自動定序儀進行核酸序列的排序，所得的基因序列和權利要求1所述的鑒別冬蟲夏草的基因序列相比較，藉由兩者的序列排列異同即可確定待鑒定物是否為冬蟲夏草。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種鑒別冬蟲夏草的方法,其是將取自冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列做為參照資料;而待鑒定物的DNA萃取物也進行以引子組NS3/NS6的PCR擴增其18S核糖體RNA基因,擴增后的PCR產(chǎn)物再以自動定序儀進行核酸序列的排序,所得的基因序列與前述冬蟲夏草的基因序列相比較;藉由兩者的基因序列的排列異同,即可確定待鑒定物是否為一冬蟲夏草;而前述冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列也成為鑒別純正冬蟲夏草的重要指標。
文檔編號C12Q1/68GK1298024SQ0010908
公開日2001年6月6日 申請日期2000年6月6日 優(yōu)先權日1999年11月30日
發(fā)明者許瑞祥, 陳志升 申請人:羅森, 王世任, 許瑞祥