專利名稱：用于蕈菌液體深層發(fā)酵控制的方法
靈芝(包括紅芝、紫芝等)是我國分布廣、醫(yī)學價值高的一類藥用蕈菌?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中早有靈芝的記載，它是民間用之已久的中草藥及滋補品。近代化學分析研究表明，它含有許多種功能成份，對中樞神經(jīng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肝臟等有重要的扶正培本”作用。近年來，關(guān)于靈芝的藥理與生理作用有了更深入的研究及臨床結(jié)果，以靈芝為原料所制備的具有藥療或輔療作用的管養(yǎng)藥劑Nutriceutical”愈益受到人們的重視和關(guān)注。
靈芝子實體栽培工藝難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，加之子實體的木質(zhì)化使其有效成份又很難完全提取而被利用。不斷的研究結(jié)果又表明，液體深層培養(yǎng)的菌絲培養(yǎng)物與子實體有相同的臨床效果。而且液體培養(yǎng)過程中胞外代謝產(chǎn)物的有效成份可分泌與保留在培養(yǎng)液中，但是栽培工藝中子實體細胞的有效代謝成份的一部份卻散失到不能被利用的固體栽培基質(zhì)中。由于上述種種原因，國內(nèi)外(如日本、東南亞，包括一些西方國家)加強對靈芝類液體深層發(fā)酵工藝的研究開發(fā)。但是至今其液體發(fā)酵工藝仍沿用子實體栽培工藝中菌絲種液搖瓶培養(yǎng)方法放大的分批發(fā)酵技術(shù)，存在工藝不完善、生產(chǎn)效率低的弊病。
藥用蕈菌(大型絲狀真菌)細胞在液體深層培養(yǎng)體系中的形態(tài)學特征明顯不同于細菌或放線菌，易形成不同分支程度的纖長菌絲，進而菌絲間又發(fā)生不同緊密度及空間度的纏繞。培養(yǎng)體系中液流的物理因子與化學因子(液流類型、剪切力、黏度、固相物特性、氣相物特性、基質(zhì)濃度、酸度等)的干擾作用可引起菌絲的斷裂、分支特征的改變，導致細胞生長比速率(單位細胞量的細胞生成速率)的下降；以及由于細胞菌絲自身纏繞成絮團，引起細胞集合顆粒內(nèi)部的物質(zhì)傳遞阻力增大，而使內(nèi)部細胞缺少溶解氧及營養(yǎng)，也導致細胞生長比速率的下降。所以，蕈菌細胞在液體深層培養(yǎng)體系中，生長比速率的控制顯得更為重要。針對蕈菌類絲狀細胞的生理生化、形態(tài)及代謝特征，采用本發(fā)明的工藝手段，可以調(diào)整蕈菌細胞在液體深層培養(yǎng)體系中生長比速率值在優(yōu)化控制的范圍內(nèi)，以提高大型絲狀真菌液體深層培養(yǎng)的細胞生成濃度、細胞生成效率，從而改善發(fā)酵水平。絲狀真菌靈芝含有許多種功能蛋白、多糖、有機酸、生物堿、香豆素、甾麥醇以及甙類等有效生物活性物質(zhì)，成份復雜，藥效廣泛。取其單一成份，則藥效降低。所以，從藥理學觀點看，藥用絲狀真菌發(fā)酵液是一種綜合抗病因子制劑，對于這種復雜的活性因子培養(yǎng)體系，常用菌體生長作為發(fā)酵及其代謝過程優(yōu)劣的相關(guān)指標。發(fā)酵生產(chǎn)中，由于產(chǎn)品目標不同，有的以細胞生成濃度(即單位體積發(fā)酵液中的細胞量)為指標；有的以細胞生成效率(即單位時間內(nèi)單位體積發(fā)酵液中的細胞量)為指標。本發(fā)明的實施過程如下。
從發(fā)酵工程學觀點，分批發(fā)酵是一類封閉式培養(yǎng)體系(即培養(yǎng)過程中無料液的輸入和輸出)。細胞菌絲進入新鮮營養(yǎng)基后的生長比速率在逐步達到最大值后，即隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)基質(zhì)濃度的下降而明顯降低。采用單元反饋補料控制方法對培養(yǎng)體系輸入新鮮營養(yǎng)基可以不斷改善細胞的基質(zhì)環(huán)境，使細胞菌絲生長比速率保持在一個較佳范圍而持續(xù)一段較長培養(yǎng)時間，達到優(yōu)化目的。采用的方法步驟是按如下給出的培養(yǎng)基。靈芝液體深層發(fā)酵以蔗糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中，初始蔗糖濃度為0.8-1.5％。培養(yǎng)基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。發(fā)酵體系中的還原糖濃度降為0.3-0.5％時，開始往發(fā)酵體系內(nèi)流加濃度為15％的蔗糖溶液。發(fā)酵過程中每隔4小時(每4小時作為一個單元時間)，取樣離線檢測還原糖濃度，并計算發(fā)酵體系該單元時間的平均耗糖速率。據(jù)體系中糖濃度的變化速率，反饋調(diào)整下一單元時間的補糖速度，使發(fā)酵體系中的還原糖維持濃度始終保持在0.6-0.8％范圍內(nèi)。發(fā)酵體系中單元時間平均耗糖速率的計算方法如下由上次取樣時間到這次取樣時間之間的單元時間為4小時。該4小時的平均耗糖速率記為M[克/小時]，
則 M＝(V1)(s1)(1/4)－(V2)(s2)(1/4)＋(d)(v)，設(shè)定V1 上次取樣時間的培養(yǎng)液體積[立升]s1 上次取樣時間測得的還原糖濃度[克/立升]V2 這次取樣時間的培養(yǎng)液體積[立升]s2 這次取樣時間測得的還原糖濃度[克/立升]d 流加蔗糖溶液的還原糖濃度[克/立升]v 該單元時間的流加速度[立升/小時]v*下一單元時間的流加速度[立升/小時](其中培養(yǎng)液體積是時間變量，等于初始培養(yǎng)液體積與已補料液體積之和[立升])，然而，調(diào)整下一單元時間的流加速度v*＝(M)/(d)。該補料操作持續(xù)3-4天，在這培養(yǎng)期間，細胞菌絲生長比速率的變化區(qū)間可始終被控制在0.030-0.060(l/h)較佳范圍內(nèi)。從工藝學觀點，這是一種半開放、變體積的補料發(fā)酵操作體系。目前有關(guān)靈芝液體深層發(fā)酵報道用的都是分批發(fā)酵技術(shù)，其發(fā)酵液中細胞終濃度(純細胞絕對干重計)為6-10克/立升左右。用上述工藝技術(shù)，細胞濃度可較分批發(fā)酵的報道值最高增加到2倍以上，細胞生成效率也可較分批發(fā)酵提高到1.5倍以上。另外，在目前缺乏即允許在線滅菌、又質(zhì)量可靠的還原糖測定電極的情況下，該方法更為實用有效。
當然，我們進一步也可以控制細胞菌絲生長比速率維持在一個相同的較佳值，即采用恒定連續(xù)液流控制方法，對培養(yǎng)體系以選定速度連續(xù)輸入新鮮營養(yǎng)基、同時以相同速度連續(xù)輸出發(fā)酵液，則可以提供一個基本相同的、良好的細胞生長基質(zhì)環(huán)境，使細胞菌絲生長比速率保持一個相同的較佳值、并持續(xù)整個培養(yǎng)時間，達到優(yōu)化目的。采用的方法步驟是按如下給出的培養(yǎng)基。靈芝液體深層發(fā)酵在以工業(yè)葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基組成中，葡萄糖的初始濃度為0.8-1.2％。培養(yǎng)基中其他組成(％)玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。培養(yǎng)溫度28℃，pH控制在4.8-5.5。接種培養(yǎng)14小時后，開始從培養(yǎng)體系的進料口連續(xù)地以恒定速度(料液流動速率)輸入新鮮培養(yǎng)基(配方與初始培養(yǎng)基組成相同)，與此同時以相同恒定速度、連續(xù)地由發(fā)酵體系向外輸出并收集發(fā)酵液，維持發(fā)酵體系的恒定體積。料液流動速率值的選擇應(yīng)滿足如下條件，選用的某一料液流動速率值使相應(yīng)的某一稀釋率”參數(shù)值應(yīng)在0.030-0.060(l/h)范圍內(nèi)。
它們的定量關(guān)系為[料液流動速率]/[發(fā)酵液恒定體積]＝[稀釋率]。
其中，料液流動速率的單位[立升/小時]，發(fā)酵液恒定體積的單位[立升]，稀釋率的單位[l/小時]。其結(jié)果，細胞菌絲的生長比速率[單位l/小時]可以始終以一個較佳值持續(xù)整個培養(yǎng)時間，數(shù)值上應(yīng)等于所選定的稀釋率參數(shù)值。這樣，細胞生長比速率被控制在0.030-0.060(l/h)范圍中的一個選擇值上。發(fā)酵體系的排出液(即產(chǎn)物)的細胞生成效率可較分批發(fā)酵的報道值提高到2倍以上，而分批發(fā)酵細胞生成效率值常為0.06-0.08克/立升/小時(以純細胞絕對干重計)。從工藝學觀點，這是一種全開放、恒體積的連續(xù)發(fā)酵操作體系。這樣的操作體系，可使生產(chǎn)周期明顯延長，并節(jié)約單批生產(chǎn)時的反應(yīng)器前期處理、種子培養(yǎng)等相應(yīng)步驟。
本技術(shù)的方法特別適用于對靈芝(如赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma sinense)以及姬松茸Agaricus blazei類的工業(yè)化生產(chǎn)。為了能達到滿意的結(jié)果，使用ALR/ff生物反應(yīng)器(專利申請?zhí)?9121894.9)進行上述發(fā)酵過程的效果可以更好。
實施例一在2.5立升生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基初始體積1200ml。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(％)食用蔗糖1.0，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB10.0015，自然pH。用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液120ml接入反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。當還原糖濃度降至0.5％時，開始用15ml/h的補料速率往生物反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)流加經(jīng)滅菌的15％食用蔗糖溶液。每4小時作為一個單元時間取樣分析培養(yǎng)體系內(nèi)的還原糖濃度(常用的DNS測定法)，并計算該單元時間內(nèi)發(fā)酵體系平均耗糖速率值，以此值為依據(jù)確定下一單元時間的補料速率，使培養(yǎng)體系內(nèi)的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間。發(fā)酵體系中單元時間平均耗糖速率計算及其調(diào)整方法見上述“實施過程”的敘述部分。補完800ml補料液后，繼續(xù)培養(yǎng)10小時，使還原糖濃度降至0.3％。整個過程可用10％NaHCO3溶液調(diào)整pH值，pH控制在4.8-5.5。培養(yǎng)溫度28℃。補料期間細胞菌絲生長比速率可維持在0.032-0.042(l/h)范圍內(nèi)。發(fā)酵周期共5天。發(fā)酵液的純細胞絕對干重濃度可達13.9克/立升。同時，細胞的生成效率為0.111克/立升/小時。
實施例二在2.5立升ALR/ff生物反應(yīng)器中，裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1800ml。接種靈芝(Ganoderma sinense)菌絲搖瓶種液200ml(靈芝菌絲搖瓶種液的制備同實施例一)，總體積定為2000ml。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(％)工業(yè)葡萄糖0.8，玉米漿1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接種培養(yǎng)14小時后用蠕動泵由生物反應(yīng)器的進料口恒速流加進料(料液組成與初始培養(yǎng)基相同)。與此同時，以相同速率進行排料。保持發(fā)酵體系的恒等體積及均勻性?？刂七M料速率96ml/h，稀釋率即等于0.048(l/h)。經(jīng)過24-36小時培養(yǎng)后發(fā)酵體系逐步達到細胞濃度相對穩(wěn)定狀態(tài)(純細胞絕對干重維持約3.1克/立升)，收集排出的發(fā)酵液(產(chǎn)物)。這樣，穩(wěn)定連續(xù)地維持0.048(l/h)稀釋率的動態(tài)物料流，即控制細胞菌絲生長比速率基本恒定為0.048(l/h)、連續(xù)培養(yǎng)15天以上。培養(yǎng)溫度及pH控制要求同實施例一。所獲發(fā)酵液的細胞生成效率值為0.149克/立升/小時(以純細胞絕對干重計)。參考文獻1)應(yīng)建淅等《中國藥用真菌圖鑒》，科學出版社，1987。2)林志彬等《藥學學報》，pP.183-192，Vol.14，No.3，1979.3)趙繼鼎《中國靈芝新編》，科學出版社，1989。4)洪震等《食用藥用菌實驗技術(shù)及發(fā)酵生產(chǎn)》，中國農(nóng)業(yè)科學出版社，1992。5)閩三弟《食用菌學報》，3(1)21-26，1996。6)高大維等《食品與發(fā)酵工業(yè)》，23(2)47，1997。7)何來英等《中國食品衛(wèi)生雜志》，P.41-44，Vol，9，No，3，1997。8)賀新生等《食用菌學報》，4(2)54-64，1997。9)汪維云等《中國食用菌》，17(2)1，1998。10)吉田等《發(fā)酵工學雜志》，46125,119(1968)。11)Takuma Sasaki，et al.Chem.Pharm.Bull，19(4)821-826，1971.12)Shoichi Nakashima，et al.Microbiol.Immunol，23(6)501-513,1979.
權(quán)利要求
1.一種用于蕈菌液體深層發(fā)酵的控制方法，其特征在于，發(fā)酵過程采用控制細胞菌絲生長比速率在0.030-0.060(l/h)的范圍內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，可以用15％濃度的蔗糖溶液對發(fā)酵體系連續(xù)進行流加補料，使發(fā)酵體系的還原糖濃度始終維持在0.6-0.8％之間，達到控制發(fā)酵過程細胞菌絲生長比速率在權(quán)利要求1規(guī)定的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，可以對同時發(fā)生連續(xù)進料與連續(xù)排料的發(fā)酵體系進行液流稀釋率值的控制，達到控制發(fā)酵過程細胞菌絲生長比速率在權(quán)利要求1規(guī)定的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，是使進料速率恒等于排料速率，發(fā)酵液體積保持恒定，
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4所述的方法，可以在紅芝、紫芝、姬松茸類蕈菌(大型絲狀真菌)的液體深層發(fā)酵工藝中使用。
全文摘要
為了克服現(xiàn)今蕈菌類液體深層發(fā)酵工藝不完善、生產(chǎn)效率低的弊病。本發(fā)明針對蕈菌類絲狀細胞的生理生化、形態(tài)及代謝特征,首先采用控制蕈菌細胞生長比速率的反饋控制補料培養(yǎng)、液流控制連續(xù)培養(yǎng)手段,用于藥用蕈菌靈芝類液體深層發(fā)酵,以優(yōu)化大型絲狀真菌液體深層培養(yǎng)的細胞生成濃度、細胞生成效率,從而提高發(fā)酵水平。
文檔編號C12N1/14GK1327046SQ00109088
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月6日
發(fā)明者龔建華, 王義軍, 杜遵義 申請人:中國科學院微生物研究所