專利名稱：一種人體中新的鈣結(jié)合蛋白前體異形體蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病理學(xué)以及基因工程學(xué)等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在人類下丘腦中表達(dá)的hRP-iso蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
人hRP蛋白的全名是human reticulocalbin precurser，是一種鈣結(jié)合蛋白的前體蛋白。[Ozawa，M.and Muramatsu，T.(1993)J.Biol.Chem.268，699-705]。鈣結(jié)合蛋白reticulocalbin存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，有六個(gè)對(duì)鈣有高度親和力的重復(fù)片段，它對(duì)鈣離子的生理平衡有重要意義。(J Biochem(Tokyo)1995 May；117(5)1113-9)。
在人與鼠中，這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)高度同源，表明其在進(jìn)化上的高度保守。兩者均在其肽鏈C端有錨定序列信號(hào)表明其存在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，人hRP的信號(hào)為KDEL，而鼠中則為HDEL。(J Biochem(Tokyo)1995 May；117(5)1113-9)人hRP-iso蛋白全長(zhǎng)328aa。我們獨(dú)立地克隆了這個(gè)蛋白，它和人hRP有55.6％同源。在C端，hRP-iso也同樣有著HDEL錨定序列信號(hào)。蛋白的結(jié)構(gòu)決定了它的功能，這表明我們克隆的hRP-iso有著與人hRP相似或者相同的生理功能。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本發(fā)明涉及的人鈣結(jié)合蛋白前體異形體蛋白(簡(jiǎn)稱人類hRP-iso蛋白)序列以及編碼這個(gè)蛋白的核酸序列。
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因hRP-iso(Genbank AccessionNo.AF183423)，該基因是一個(gè)人hRP-iso蛋白基因。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hRP-iso。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hRP-iso蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種人hRP-iso蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hRP-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hRP-iso蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hRP-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法步驟如下(1)將編碼具有人hRP-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hRP-iso蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hRP-iso蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hRP-iso蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hRP-iso蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第1-987位的序列。
本發(fā)明還提供了與hRP-iso蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hRP-iso蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hRP-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第1-987位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第1-987位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.6中第1-987位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的人hRP-iso相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hRP-iso蛋白或多肽”指具有人hRP-iso蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然人hRP-iso相同功能的、SEQID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人hRP-iso蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的人hRP-iso多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hRP-iso DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hRP-iso多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hRP-iso多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括人hRP-iso多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hRP-iso多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“人hRP-iso保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
發(fā)明還包括人hRP-iso蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hRP-iso多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hRP-iso多肽時(shí)，可以將人hRP-iso編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hRP-iso蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對(duì)人hRP-iso特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備針對(duì)人hRP-iso特異的抗體。例如，將提純的人hRP-iso基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hRP-iso或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑人hRP-iso功能的抗體，也可以是不影響人hRP-iso功能的抗體。每一類抗體都可以通過(guò)對(duì)人hRP-iso基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hRP-iso基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的人hRP-iso基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來(lái)免疫動(dòng)物而得到。
本發(fā)明的人hRP-iso抗體可以用來(lái)鑒定表達(dá)人hRP-iso蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來(lái)標(biāo)記人hRP-iso特異抗體，然后讓人hRP-iso特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與人hRP-iso特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測(cè)人hRP-iso外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如下丘腦中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時(shí)將提純的人hRP-iso多肽作為陽(yáng)性對(duì)照)，接著通過(guò)電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測(cè)人hRP-iso多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測(cè)方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測(cè)方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對(duì)照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析人hRP-iso基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hRP-iso的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人hRP-iso DNA的Nothern印跡分析和人hRP-iso特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)人hRP-iso在生物樣本中的表達(dá)。人hRP-iso DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人hRP-iso核苷酸編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人hRP-iso的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在人hRP-iso核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人hRP-iso核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的人hRP-iso核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選人hRP-iso同源基因或同源蛋白。
為了得到與人hRP-iso基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)人hRP-iso的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自人下丘腦組織的文庫(kù)。來(lái)自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫(kù)也可用于篩選目的。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與人hRP-iso相關(guān)的基區(qū)家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選人hRP-iso同源物可以按如下方法完成。人體下丘腦cDNA文庫(kù)，例如Clontech Cat.#7429-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含人hRP-iso基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對(duì)與人hRP-iso序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識(shí)別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序來(lái)評(píng)價(jià)它與人hRP-iso基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
人hRP-iso同源物也可以用針對(duì)人hRP-iso蛋白或多肽的抗體來(lái)識(shí)別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來(lái)自細(xì)胞或者組織例如下丘腦的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。將文庫(kù)倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hRP-iso抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測(cè)。用這種方法所識(shí)別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序進(jìn)行分析以評(píng)價(jià)它與人hRP-iso基因的相似性。新識(shí)別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hRP-iso核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過(guò)先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hRP-iso蛋白的的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如，通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長(zhǎng)至約2000bp或者更長(zhǎng)的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見(jiàn)Verma等人，Human ChromosomesA Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過(guò)孟德?tīng)?Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(可通過(guò)Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過(guò)連鎖分析來(lái)鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明的人hRP-iso蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與人hRP-iso發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明人hRP-iso蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hRP-iso蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hRP-iso蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重—約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hRP-iso蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重—約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
通過(guò)同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為人hRP蛋白的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有人hRP蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的人hRP-iso是人hRP蛋白基因的一個(gè)同源基因而具有相似的功能。
表2為本發(fā)明的人hRP-iso與人hRP基因核酸序列(GenBank AccessionNo.D13003)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
表3為本發(fā)明的人hRP-iso蛋白與人hRP蛋白的氨基酸序列(SwissProtAccession No.Q15293)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人hRP-iso基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)下丘腦來(lái)源于5個(gè)正常成年男性供體，在死后四小時(shí)內(nèi)取出下丘腦組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)
取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見(jiàn)SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見(jiàn)SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片段分離。過(guò)柱篩選長(zhǎng)度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無(wú)菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
4.測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，將無(wú)同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。
5.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過(guò)電子克隆的方法，通?？色@取人hRP-iso基因的全長(zhǎng)序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過(guò)“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng)，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計(jì)引物，在人類下丘腦Marathon-Ready cDNA文庫(kù)(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無(wú)完整的ORF，如無(wú)，重復(fù)上述過(guò)程直至獲得全長(zhǎng)。
(3)RT-PCR對(duì)于5’和3’端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無(wú)法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計(jì)引物，3’端引物采用Oligo-dT，在下丘腦總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hRP-iso蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15’-ATGATGTGGCGACCATCA-3’(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-GGTTCTTAAAGCTGAGCTTGG-3’(SEQ ID NO.5)為反向引物，以下丘腦組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1272bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實(shí)施例2人hRP-iso基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hRP-iso全長(zhǎng)cDNA(GenBank Accession No.AF183423。因申請(qǐng)保密，故在本申請(qǐng)之前未對(duì)公眾公開(kāi))的長(zhǎng)度為1272bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，其中開(kāi)放讀框位于1-987位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出人hRP-iso的氨基酸序列，共328個(gè)氨基酸殘基，分子量37423.87，pI為4.71。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.7。
將人hRP-iso的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人RP基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與人hRP基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.D13003)的185-1105位堿基有61.8％的相同性(表2)，在氨基酸水平上，它與人hRP蛋白(SwissProt AccessionNo.Q15293)的第1-330位氨基酸殘基有55.6％的相同性和77.5％的相似性(表3)。由上可見(jiàn)，人hRP-iso基因與人hRP基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，屬于同一家族并且兩者在功能上也有很高相似性。
本發(fā)明的人hRP-iso除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明的人hRP-iso還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明的人hRP-iso蛋白的N端與人hRP蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人hRP-iso的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hRP-iso核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hRP-iso的表達(dá)水平或者抑制人hRP-iso的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人hRP-iso蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hRP-iso缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
由于本發(fā)明的人hRP-iso蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來(lái)源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒(méi)有)。
實(shí)施例3人hRP-iso蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.將人hRP-iso蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果
結(jié)果表明，在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)域區(qū)加框區(qū)(126-138，213-225)鈣結(jié)合功能模塊(EF-hand calcium-bindingdomain proteins)。
(2)功能分析在該基因氨基酸序列中存在鈣結(jié)合功能模塊(EF-hand calcium-bindingdomain proteins)，該結(jié)構(gòu)決定了其有相應(yīng)功能。
實(shí)施例4人hRP-iso基因的組織表達(dá)譜1.電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，BiochemBiophys Res Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997 Dec 16；96(12)4146-4203)，將人hRP-iso cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有36個(gè)，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在卵巢、神經(jīng)細(xì)胞前體、柱狀骨細(xì)胞等等器官或組織中有表達(dá)，表明它在人體許多重要組織或器官中都發(fā)揮著作用。
實(shí)施例5人hRP-iso多肽的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的人hRP-iso編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1.將人hRP-iso多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hRP-iso的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將人hRP-iso基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hRP-iso表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRP-iso。
表達(dá)GST-hRP-iso重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hRP-iso工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hRP-iso融合蛋白的工程菌。
GST-hRP-iso融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hRP-iso融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRP-iso。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hRP-iso的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在37kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hRP-iso蛋白。
實(shí)施例6人hRP-iso蛋白或多肽在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.人hRP-iso桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞株根據(jù)人hRP-iso的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將人hRP-iso cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無(wú)血清的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時(shí)后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時(shí)，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲(chóng)細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時(shí)，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時(shí)，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl 4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí)，而后于抗人hRP-iso的抗體溶液中封閉1小時(shí)，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗人hRP-iso一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí)，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)人hRP-iso的Sf9細(xì)胞克隆。
3.人hRP-iso蛋白的提取純化用高表達(dá)人hRP-iso的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mMPefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時(shí)。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)提取的人hRP-iso蛋白的純度。在37kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hRP-iso蛋白。
實(shí)施例7抗人hRP-iso抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的人hRP-iso蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見(jiàn)鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁(yè)。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第371頁(yè)中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁(yè)中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4.抗體的檢測(cè)在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)，就應(yīng)用人hRP-iso蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
本發(fā)明涉及的序列與記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCACGAG 13(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度9bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC 9(4)SEQ ID NO.4的信息(i).序列特征(A)長(zhǎng)度18bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.4ATGATGTGGCGACCATCA 18(5)SEQ ID NO.5的信息(i).序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.5GGTTCTTAAAGCTGAGCTTGG 21(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1272bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.61 ATGATGTGGC GACCATCAGT TCTGCTGCTT CTGTTGCTAC TGAGGCACGG51 CGCCCAGGGG AAGCCATCCC CAGACGCAGG CCCTCATGGC CAGGGGAGGG101 TGCACCAGGC GGCCCCCCTG AGCGACGCTC CCCATGATGA CGCCCACGGG151 AACTTCCAGT ACGACCATGA GGCTTTCCTG GGACGGGAAG TGGCCAAGGA201 ATTCGACCAA CTCACCCCAG AGGAAAGCCA GGCCCGTCTG GGCGGGATCG251 TGGACCGCAT GGACCGCGCG GGGGACAGCG ACGGCTGGGT GTCGCTGGCC301 GAGCTTCGCG CGTGGATCGC GCACACGCAG CAGCGGCACA TACGGGACTC351 GGTGAGCGCG GCCTGGGACA CGTACGACAC GGACCGCGAC GGGCGTGTGG401 GTTGGGAGGA GCTGCGCAAC GCCACCTATG GCCACTACGC GCCCGGTGAA451 GAATTTCATG ACGTGGAGGA TGCAGAGACC TACAAAAAGA TGCTGGCTCG501 GGACGAGCGG CGTTTCCGGG TGGCCGACCA GGATGGGGAC TCGATGGCCA551 CTCGAGAGGA GCTGACAGCC TTCCTGCACC CCGAGGAGTT CCCTCACATG601 CGGGACATCG TGATTGCTGA AACCCTGGAG GACCTGGACA GAAACAAAGA651 TGGCTATGTC CAGGTGGAGG AGTACATCGC GGATCTGTAC TCAGCCGAGC701 CTGGGGAGGA GGAGCCGGCG TGGGTGCAGA CGGAGAGGCA GCAGTTCCGG751 GACTTCCGGG ATCTGAACAA GGATGGGCAC CTGGATGGGA GTGAGGTGGG801 CCACTGGGTG CTGCCCCCTG CCCAGGACCA GCCCCTGGTG GAAGCCAACC851 ACCTGCTGCA CGAGAGCGAC ACGGACAAGG ACGGGCGGCT GAGCAAAGCG901 GAAATCCTGG GTAATTGGAA CATGTTTGTG GGCAGTCAGG CCACCAACTA951 TGGTGAGGAC CTGACCCGGC ACCACGATGA GCTGTGAGCC CCGCGCACCT1001 GCCACAGCCT CAGAGGCCCG CACAATGACC GGAGGAGGGG CCGCTGTGGT1051 CTGGCCCCCT CCCTGTCCAG GCCCCGCAGA GGCAGATGCA GTCCCAGGCA1101 TCCTCCTGCC CCTGGGCTCT CAGGGACCCC CTGGGTCGGC TTCTGTCCCT1151 GTCACACCCC CAACCCCAGG GAGGGGCTGT CATAGTCCCA GAGGATAAGC1201 AATACCTATT TCTGACTGAG TCTCCCAGCC CAGACCCAGG GACCCTTGGC1251 CCCAAGCTCA GCTTTAAGAA CC(7)SEQ ID NO.7的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度328氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.71 MMWRPSVLLL LLLLRHGAQG KPSPDAGPHG QGRVHQAAPL SDAPHDDAHG51 NFQYDHEAFL GREVAKEFDQ LTPEESQARL GGIVDRMDRA GDSDGWVSLA101 ELRAWIAHTQ QRHIRDSVSA AWDTYDTDRD GRVGWEELRN ATYGHYAPGE151 EFHDVEDAET YKKMLARDER RFRVADQDGD SMATREELTA FLHPEEFPHM201 RDIVIAETLE DLDRNKDGYV QVEEYIADLY SAEPGEEEPA WVQTERQQFR251 DFRDLNKDGH LDGSEVGHWV LPPAQDQPLV EANHLLHESD TDKDGRLSKA301 EILGNWNMFV GSQATNYGED LTRHHDEL表2.61.8％ identity in 887 nt overlap90 100110 120 130140hRP-iso.seq GGCCAGGGGAGGGTGCACCAGGCGGCCCCCCTGAGCGACGCTCCCCATGATGACGCCCAC||| |||| |||| ||| ||| |||hRP.seq AAAGAGCGCGTGGTGCGGCCCGACTCGGAGCTGGGCGAGCGGCCCCCTGAGGACAACCA-160170 180190 200210150 160170 180190 200hRP-iso.seq GGGAACTTCCAGTACGACCATGAGGCTTTCCTGGGACGGGAAGTGGCCAAGGAATTCGAC|| ||||||||||||||| ||||| |||||||| ||| | ||||| ||||||hRP.seq --GAGCTTCCAGTACGACCACGAGGCCTTCCTGGGCAAGGAGGACTCCAAGACCTTCGAC220 230240 250260 270210 220230 240 250260hRP-iso.seq CAACTCACCCCAGAGGAAAGCCAGGCCCGTCTGGGCGGGATCGTGGACCGCATGGACCGC|| |||||||| || || ||| ||| | || || ||| || || || || |||hRP.seq CAGCTCACCCCGGACGAGAGCAAGGAGAGGCTAGGGAAGATTGTTGATCGAATCGACAAT280 290 300 310320 330270 280 290300310 320hRP-iso.seq GCGGGGGACAGCGACGGCTGGGTGTCGCTGGCCGAGCTTCGCGCGTGGATCGCGCACACG
| ||| || |||| || || ||||| | |||||| ||hRP.seq GATGGG------GATGGCTTTGTCACTACTGAGGAGCTGAAAACCTGGATCAAACGGGTG340 、 350 360 370380330 340350 360 370380hRP-iso.seq CAGCAGCGGCACATACGGGACTCGGTGAGCGCGGCCTGGGACACGTACGACACGGACCGC||| | | |||||||| || |||| ||| || | ||||hRP.seq CAGAAAAGATACATCTTTGATAATGTCGCCAAAGTCTGGAAGGATTATGATAGGGACAAG390 400 410420 430440390 400410 420 430 440hRP-iso.seq GACGGGCGTGTGGGTTGGGAGGAGCTGCGCAACGCCACCTATGGCCACTAC---GCGCCC|| | |||||| || | ||||||||||| ||||| ||hRP.seq GATGATAAAATTTCCTGGGAAGAATACAAACAAGCCACCTATGGTTACTACCTAGGAAAC450460 470480490 500450 460470 480490 500hRP-iso.seq GGTGAAGAATTTCATGACGTGGAGGATGCAGAGACCTACAAAAAGATGCTGGCTCGGGAC| ||| |||||||| |||| |||| |||||||||||| | || ||hRP.seq CCCGCAGAGTTTCATGATTCTTCAGATCATCACACCTTTAAAAAGATGCTGCCACGTGAT510520 530540 550560510520 530540 550560hRP-iso.seq GAGCGGCGTTTCCGGGTGGCCGACCAGGATGGGGACTCGATGGCCACTCGAGAGGAGCTG||| | | ||| | || |||| |||| ||| || || ||||| |||||| |hRP.seq GAGAGAAGATTCAAAGCTGCAGACCTCAATGGTGACCTGACAGCTACTCGGGAGGAGTTC570580 590600 610620570580 590600 610620hRP-iso.seq ACAGCCTTCCTGCACCCCGAGGAGTTCCCTCACATGCGGGACATCGTGATTGCTGAAACC|| ||||| ||||| || || ||||||| ||| ||| || ||| || ||||||hRP.seq ACTGCCTTTCTGCATCCTGAAGAGTTTGAACATATGAAGGAAATTGTGGTTTTGGAAACC630640 650660670 680630 640 650660670 680hRP-iso.seq CTGGAGGACCTGGACAGAAACAAAGATGGCTATGTCCAGGTGGAGGAGTACATCGCGGAT||||||||| | |||| ||| ||||| | ||| | ||| ||||| || ||||||hRP.seq CTGGAGGACATCGACAAGAACGGGGATGGGTTTGTGGATCAGGATGAGTATATTGCGGAT690700710 720730 740690700710 720730 740hRP-iso.seq CTGTACTCAGCCGAGCCTGGGGAGGAGGAGCCGGCGTGGGTGCAGACGGAGAGGCAGCAG||| ||||| | ||||| | ||||| | || || |||||hRP.seq ATGTTTTCCCATGAGGAGAATGGCCCTGAGCCAGACTGGGTTTTATCAGAACGGGAGCAG750760 770780 790800
750 760770 780790 800hRP-iso.seq TTCCGGGACTTCCGGGATCTGAACAAGGATGGGCACCTGGATGGGAGTGAGGTGGGCCAC|||| |||||||||||||||||||| ||| | | || |||| | |||||hRP.seq TTTAACGAATTCCGGGATCTGAACAAGGACGGGAAGTTAGACAAAGATGAGATTCGCCAC810820 830840850 860810 820 830840850 860hRP-iso.seq TGGGTGCTGCCCCCTGCCCAGGACCAGCCCCTGGTGGAAGCCAACCACCTGCTGCACGAG||| | || || | | | || || | | || || |||| || ||| | | ||hRP.seq TGGATCCTCCCTCAAGATTATGATCACGCACAGGCTGAGGCCAGGCATCTGGTATATGAA870880 890900 910 920870880 890900 910 920hRP-iso.seq AGCGACACGGACAAGGACGGGCGGCTGAGCAAAGCGGAAATCCTGGGTAATTGGAACATG|||| ||||||| | | ||| | |||| |||||| ||| || |||||||||hRP.seq TCAGACAAAAACAAGGATGAGAAGCTAACTAAAGAGGAAATATTGGAGAACTGGAACATG930 940 950960 970980930 940 950960 970980hRP-iso.seq TTTGTGGGCAGTCAGGCCACCAACTATGGTGAGGACCTGACCCGGCACCACGATGAGCTG||||| || || || || ||||| || || || || || || | || ||||||||hRP.seq TTTGTTGGAAGCCAAGCTACCAATTACGGGGAAGATCTCACAAAAAATCATGATGAGCTT990 1000 1010 1020 1030 1040990 1000 1010 1020 1030 1040hRP-iso.seq TGAGCCCCGCGCACCTGCCACAGCCTCAGAGGCCCGCACAATGACCGGAGGAGGGGCCGC|||| | |||| |hRP.seq TGATAGACACTCACCAGAATATGGCAGACTGTCATAGGCATTCTGTTATTGTCTTGGATT1050 1060 1070 1080 1090 1100hRP-iso.seq人hRP-iso蛋白核酸序列(GenBank Accession No.AF183423)hRP.seq人hRP蛋白核酸序列(GenBank Accession No.D13003)表3.55.6％ identity in 324 aa overlap10 2030 4050hRP-iso.pep MMWRPSVLLLLLLLRHGAQGKPSPDAGPHGQGRVHQAAPLSDAPHDDAHGN+|| |+| + ++||+ + + |+ + |++ | +| + +hRP.pep MARGGRGRRLGLALGLLLALVLAPRVLRAKPTV----RKERVVRPDSELGERPPEDNQ-S10 2030 40 5060 708090100 110hRP-iso.pep FQYDHEAFLGREVAKEFDQLTPEESQARLGGIVDRMDRAGDSDGWVSLAELRAWIAHTQQ
||||||||||+| +| ||||||+||+ ||| ||||+| +|+||+|+ ||++|| ++|+hRP.pep FQYDHEAFLGKEDSKTFDQLTPDESKERLGKIVDRID--NDGDGFVTTEELKTWIKRVQK60 70 、80 90 100110120130 140 150 160 169hRP-iso.pep RHIRDSVSAAWDTYDTDRDGRVGWEELRNATYGHY--APGEEFHDVEDAETYKKMLARDE|+| |+|+ +| || |+| +++||| ++||||+| |+| ||| | +|+|||| |||hRP.pep RYIFDNVAKVWKDYDRDKDDKISWEEYKQATYGYYLGNPAE-FHDSSDHHTFKKMLPRDE120130 140150 160 170170 180 190200210 220 229hRP-iso.pep RRFRVADQDGDSMATREELTAFLHPEEFPHMRDIVIAETLEDLDRNKDGYVQVEEYIADL|||++|| +|| |||||+||||||||| ||++||+ |||||+|+| ||+|+ +|||||+hRP.pep RRFKAADLNGDLTATREEFTAFLHPEEFEHMKEIVVLETLEDIDKNGDGFVDQDEYIADM180190 200210 220230230 240250 260270 280 289hRP-iso.pep YSAEPGEEEPAWVQTERQQFRDFRDLNKDGHLDGSEVGHWVLPPAQDQPLVEANHLLHES+| | + || || +||+|| +||||||||+|| +|+ ||+|| |+ +|| ||++||hRP.pep FSHEENGPEPDWVLSEREQFNEFRDLNKDGKLDKDEIRHWILPQDYDHAQAEARHLVYES240250 260270 280290290 300310 320hRP-iso.pep DTDKDGRLSKAEILGNWNMFVGSQATNYGEDLTRHHDEL| +|| +|+| ||| ||||||||||||||||||++||||hRP.pep DKNKDEKLTKEEILENWNMFVGSQATNYGEDLTKNHDEL300310 320330HRP-iso.pep人RP-iso蛋白序列hRP.pep人hRP蛋白序列(Swissprot Accession No.Q15293)
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hRP-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人hRP-iso蛋白多肽，其特征在于它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于它包含權(quán)利要求1所述的DNA，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人hRP-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于該方法步驟如下(1)將編碼具有人hRP-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hRP-iso蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第1-987位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hRP-iso蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hRP-iso蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hRP-iso蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求7所述的人hRP-iso蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，其特征在于它包括多克隆抗體和單克隆抗體。
10.一種核酸分子，其特征在于它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常下丘腦組織中表達(dá)的新的人hRP－iso蛋白及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測(cè)人hRP－iso核酸序列和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1266899SQ0011169
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者肖華勝, 程志紅, 張新, 陳竺, 韓澤廣 申請(qǐng)人:國(guó)家人類基因組南方研究中心