專利名稱：非同位素聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用于疾病診斷的檢測基因突變的方法。
非同位素聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測基因突變的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用。
這些方法包括以下步驟(1)按常規(guī)方法提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增待檢DNA；(3)經(jīng)高溫或加堿進(jìn)行變性處理；(4)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區(qū)帶。這些方法存在一些缺點(diǎn)一部分基因用傳統(tǒng)的高溫變性法或加堿變性法有效，但有許多基因用這二種方法都無效，導(dǎo)致顯色后出現(xiàn)的區(qū)帶紊亂，模糊不清，且重現(xiàn)性差，片段較大時更是如此，因而檢測靈敏度隨著DNA片段的增大而下降很快(對200bp以下的片段可達(dá)100％，300bp時已低于85％)，故其應(yīng)用受到很大限制。一般在檢測前均要進(jìn)行復(fù)雜、費(fèi)時的條件摸索。
本發(fā)明的目的在于提供一種可廣泛應(yīng)用于各種基因突變的檢測(無論片段大或小)，且區(qū)帶更清晰、靈敏度更高、重現(xiàn)性好、簡便、快速的一種非同位素聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測基因突變的方法。
本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)按常規(guī)方法提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增待檢DNA；(3)變性處理；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區(qū)帶，其特征在于采用的變性方法為按PCR產(chǎn)物變性劑(內(nèi)含0．01～3％SDS、10～50mMEDTA)上樣緩沖液(內(nèi)含95％甲酰胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚藍(lán)、10mM EDTA)=1∶1∶1(體積比)條件下，在90～100℃進(jìn)行變性處理3～5分鐘。
所述變性劑中的SDS可以用以下物質(zhì)中的一種或二種所替代尿素、DMSD(二甲亞砜)、tritonX-100、OP、DTT等。
由于采用了離子鍵極性很強(qiáng)的變性劑，變性時，可通過與單鏈的極性基因發(fā)生相互作用而穩(wěn)定單鏈構(gòu)象，同時提供較大的空間位阻，使其他分子不易與單鏈相互作用，成為穩(wěn)定DNA單鏈構(gòu)象的主要因素，由于這種獨(dú)特的穩(wěn)定作用，可以實(shí)現(xiàn)無論片段大或小，均能獲得區(qū)帶清晰、靈敏度更高、重現(xiàn)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也避免了舊方法復(fù)雜費(fèi)時的條件摸索過程，可以應(yīng)用于各種基因突變的檢測，方法簡單、快速。
實(shí)施例1九例女性性反轉(zhuǎn)者SOX9基因突變檢測(1)常規(guī)法提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增待檢DNA；(3)PCR產(chǎn)物2μl，變性劑2μl(內(nèi)含0．01％SDS、20mMETDA)上樣緩沖液2μl(95％甲酰胺、0．1％溴酚藍(lán)、0．1％二甲苯青及10mMEDTA)放在0．5ml離心管中混勻，沸水浴加熱3～5分鐘后，立即放置冰浴中驟冷3～5分鐘，高速離心5秒、置于冰上；(4)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區(qū)帶，區(qū)帶清晰。
實(shí)施例2，八例骨關(guān)節(jié)病患者軟骨細(xì)胞線粒體DNA基因檢測，步驟同實(shí)施例1，所用變性劑為0．5％尿素、30mMEDTA，區(qū)帶清晰。
實(shí)施例3，六例女性性反轉(zhuǎn)患者SRY基因檢測。步驟同實(shí)施例1，所用變性劑為3％OP、50mMEDTA，區(qū)帶清晰。
權(quán)利要求
1.一種非同位素聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性制檢測基因突變的方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法提取DNA；(2)PCR擴(kuò)增待檢DNA；(3)變性處理；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)銀染法顯示SSCP分析區(qū)帶；其特征在于采用的變性方法為按PCR產(chǎn)物變性劑(內(nèi)含0．01～3％、SDS、10～50mM EDTA)上樣緩沖液(內(nèi)含95％甲酰胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚藍(lán)、10mM EDTA)=1∶1∶1(體積比)條件下，在90～100℃進(jìn)行變性處理3～5分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述方法，其特征在于變性劑中的SDS可以用以下物質(zhì)中的一種或二種所替代尿素、DMSD(二甲亞砜)、tritonX-100、OP、DTT等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非同位素聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測基因突變的方法,是將傳統(tǒng)方法中采用的經(jīng)高溫或加堿進(jìn)行變性處理改為采用離子鍵極性很強(qiáng)的SDS變性劑與上樣緩沖液在90～100℃進(jìn)行變性處理3～5分鐘,實(shí)現(xiàn)無論片段大或小,均能獲得區(qū)帶清晰、靈敏度更高、重現(xiàn)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
文檔編號C12Q1/68GK1288958SQ00113518
公開日2001年3月28日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者朱敏, 譚文斌, 周鋼, 謝慎思 申請人:湖南醫(yī)科大學(xué)