專利名稱：重組的抗人TNFα基因工程抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于中和腫瘤壞死因子α毒性的重組抗人TNFα基因工程抗體本(anti－h(huán)uman tumor necrosis facter－α genetic engineeringantibody)并涉及一種利用分子生物學手段制備抗人TNFα基因工程抗體的方法。
腫瘤壞死因子－α(Tumor necrosis factor α，TNF－α)是由巨噬細胞和活化T細胞產(chǎn)生的一種細胞因子，具有多種重要的生物學活性。由于TNF－α大量釋放而致的炎癥、損傷和感染性休克等，往往癥狀兇險，難以治療，因此其拮抗物的研究受到廣泛高度的重視。已有大量的動物實驗證據(jù)和一些臨床試驗表明，抗TNF－α單／多克隆抗體能夠預(yù)防和治療因TNF－α過量產(chǎn)生而導(dǎo)致的炎癥、損傷等疾病狀態(tài)，但由于利用雜交瘤技術(shù)獲得的抗TNF－α單克隆抗體多為鼠源性抗體，在臨床治療的重復(fù)使用過程中會產(chǎn)生人抗鼠抗體(Humananti－mouse autibody，HAMA)，引起免疫排斥反應(yīng)，影響了人體正常的免疫反應(yīng)，因而限制了抗TNF－α單抗在臨床實踐中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種中和腫瘤壞死因子α毒性具有良好效果的重組抗人TNFα基因工程抗體，它對機體受到過量TNFα毒性的保護具有明顯的預(yù)防作用并優(yōu)于鼠源性單克隆抗體；同時本發(fā)明還提供一種重組抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，該方法生產(chǎn)周期短、操作簡單、成本低。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案以如下方式實現(xiàn)抗人腫瘤壞死因子－α單鏈抗體(mouse anti－TNF－α ScFv)的基因序列如下ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGA CCT GGC CTC GTG AAACCT TCT CAG TCT CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GGC CAC TCCATC AGC AGT GGT TAT TTC TGG AAC TGG ATC CGG CAC TTT CCAGGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG GGC TAC ATA AGT TAC GAC GGTAGC AAT AAG TAC AAC CCA TCT CTC AAA AAT CGA ATC TCC ATCACT CGT GAC ACA TCT GAG AAC CAG TTT TTC CTG ATC TTG AAT TCTGTG ACT TCT GAG GAC ACA GCT ACA TAT TAC TGT GCA AGA GACGAT AAC TGG AAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGC ACC ACG GTCACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCTGGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC GTC ATG ACC CAG TCTCCA TCC TCC CTG GCT ATG TCA GTA GGA CAG AAG GTC ACT ATGAGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT GTT TTA AAT AGC AAC ACT CAAAAG AAC TAT TTG GCC TGG TAC CAG AAG AAA CCA GGA CAG TCTCCT GAA CTT CTG GTA TAT TTT GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGGGTC CCT GAT CGC TTC ATG GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTCACT CTT ACC ATC AGC AGT GTA CAG ACT GAA GAC CTG GCA GATTAC TTC TGTCAG CAA CAT TAT AGG ACT CCG TTC ACG TTC GGC TCGGGG ACA AAG TTG。該基因序列在基因庫(Geneback)中的收錄號為AF252545和AF262753。
上述單鏈抗體的制備方法包括如下主要步驟(1)利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT－PCR)方式獲取所需抗人TNFα可變區(qū)基因序列；(2)利用基因工程手段獲得抗人TNFα單鏈抗體基因序列；(3)利用基因工程手段獲得抗人TNFα單鏈抗體重組表達產(chǎn)物；(4)通過表達產(chǎn)物的純化或變性復(fù)性和純化后獲得具有良好活性的重組抗人TNF α單鏈抗體。
上述的抗人TNFα單鏈抗體基因序列包括全序列和部分序列。
上述的利用基因工程手段包括利用各種原核系統(tǒng)，酵母系統(tǒng)，真菌系統(tǒng)和真核系統(tǒng)表達的抗人TNFα單鏈抗體。
上述的基因全序列和部分序列包括突變體以及與其它的目的基因的融合體。
通過大量體外細胞試驗證實適當劑量的重組抗人TNFα單鏈抗體可刺激體外培養(yǎng)的成纖維細胞產(chǎn)生對TNFα的中和效應(yīng)。特別是本發(fā)明具有中和TNFα毒性的作用，對組織損傷的保護作用顯著，與親本抗體有相同的抗原結(jié)合表位。并具有操作簡單，生產(chǎn)周期短，可批量生產(chǎn)，產(chǎn)量高，成本低，純度高，活性好，質(zhì)量穩(wěn)定，使用安全的特點。在平戰(zhàn)時有廣闊的應(yīng)用前景。
以下結(jié)合具體實施方法和實驗例對本發(fā)明作進一步說明。實施方法1．編碼抗人TNFα可變區(qū)基因的獲得根據(jù)已發(fā)表的抗體基因全序列，設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物，從一株分泌抗人TNFα的小鼠雜交瘤細胞中擴增得編碼抗人TNFα的輕、重鏈基因序列。2．編碼抗人TNFα單鏈抗體基因的獲得用連接肽將輕、重鏈基因拼接成單鏈抗體基因序列。3．抗人TNFα單鏈抗體的重組表達將編碼抗人TNFα單鏈抗體基因序列克隆到大腸桿菌表達載體pBV220上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到表達抗人TNFα單鏈抗體的工程菌。3．抗人TNFα基因工程產(chǎn)物的獲得大腸桿菌表達產(chǎn)物經(jīng)裂菌，層析純化或包涵體分離、變性復(fù)性、經(jīng)過合理組織的多種層析分離手段純化，得到重組的抗人TNFα的基因工程產(chǎn)物。這里的重組抗人TNFα基因工程產(chǎn)物還包括其衍生的各種復(fù)合劑型和緩釋劑型。
實驗例1培養(yǎng)小鼠成纖維細胞L929接種96孔培養(yǎng)板5×104個／孔，ScFv以系列濃度(0．1 ug／ml～5 ug／ml)，與rHuTNF－α(4 ug／ml)等體積混合，37℃予作用1小時或立即加入培養(yǎng)細胞懸液中；結(jié)果顯示ScFv抗體隨其濃度的增高，抑制TNF－α對L929細胞毒性的作用也隨著增強，在4 ug／ml抗體濃度，細胞存活率可達90％以上。細胞周期分析表明僅加TNF－α的陰性對照細胞的細胞周期消失，僅出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰(98．6％)，正常L929培養(yǎng)細胞出現(xiàn)輕微的亞二倍體凋亡峰(1％)，ScFv與其親本抗體E6mAb分別保護的L929細胞G1期、G2期及它們的CV值與正常L929活細胞相比變化不大，且沒有凋亡峰出現(xiàn)，表明此ScFv具有保護L929細胞免受內(nèi)源性或外源性TNF－α細胞毒的作用。
實驗例2由于細胞內(nèi)外環(huán)境的不同，有些在細胞外可以相互作用的蛋白在細胞內(nèi)卻不能相互作用。我們用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測了ScFv與人TNF－α在酵母細胞內(nèi)的相互作用。E6ScFv和人TNF－α基因分別按讀框插入DNA結(jié)合域(DBD)的質(zhì)粒pLexA和表達轉(zhuǎn)錄激活域(TAD)的質(zhì)粒pB42AD，然后共轉(zhuǎn)化酵母EGY48，用Leu和Trp營養(yǎng)缺陷進行篩選。挑選能在選擇培養(yǎng)板上生長的克隆，在原位用X－gal檢測其β－半乳糖苷酶的表達。結(jié)果表明兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的酵母細胞克隆可檢測到β－半乳糖苷酶的表達呈陽性，證明E6ScFv和人TNF－α可在酵母細胞內(nèi)相互作用。
多次系統(tǒng)的實驗都證明抗TNF－α單鏈抗體是一種有效的TNF－α毒性防護劑。
權(quán)利要求
1.一種重組的抗人TNF α基因工程抗體，其特征在于它為抗人腫瘤壞死因子－α單鏈抗體(mouse anti－TNF－α ScFv)，其基因序列如下ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGA CCT GGC CTC GTG AAACCT TCT CAG TCT CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GGC CACTCC ATC AGC AGT GGT TAT TTC TGG AAC TGG ATC CGG CAC TTTCCA GGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG GGC TAC ATA AGT TACGAC GGT AGC AAT AAG TAC AAC CCA TCT CTC AAA AAT CGA ATCTCC ATC ACT CGT GAC ACA TCT GAG AAC CAG TTT TTC CTG ATCTTG AAT TCT GTG ACT TCT GAG GAC ACA GCT ACA TAT TAC TGTGCA AGA GAC GAT AAC TGG AAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGCACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGAGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC GTC ATGACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG GCT ATG TCA GTA GGA CAG AAGGTC ACT ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT GTT TTA AAT AGCAAC ACT CAA AAG AAC TAT TTG GCC TGG TAC CAG AAG AAA CCAGGA CAG TCT CCT GAA CTT CTG GTA TAT TTT GCA TCC ACT AGGGAA TCT GGG GTC CCT GAT CGC TTC ATG GGC AGT GGA TCT GGGACA GAT TTC ACT CTT ACC ATC AGC AGT GTA CAG ACT GAA GACCTG GCA GAT TAC TTC TGT CAG CAA CAT TAT AGG ACT CCG TTCACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組的抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，其特征在于它包括如下主要步驟(1)利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT－PCR)方式獲取所需抗人TNFα可變區(qū)基因序列，該基因序列在基因庫(Geneback)中的收錄號為AF252545和AF262753；(2)利用基因工程手段獲得抗人TNFα單鏈抗體基因序列；(3)利用基因工程手段獲得抗人TNFα單鏈抗體重組表達產(chǎn)物；(4)通過表達產(chǎn)物的純化，或變性復(fù)性和純化后獲得具有良好活性的重組抗人TNFα單鏈抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組的抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，其特征在于所述的抗人TNFα單鏈抗體基因序列包括全序列和部分序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組的抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，其特征在于所述的利用基因工程手段包括利用各種原核系統(tǒng)，酵母系統(tǒng)，真菌系統(tǒng)和真核系統(tǒng)表達的抗人TNFα單鏈抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組的抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，其特征在于所述的基因全序列和部分序列包括突變體以及與其它的目的基因的融合體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組的抗人TNFα基因工程抗體的制備方法，其特征在于所述的重組抗人TNFα單鏈抗體包括其衍生的各種復(fù)合劑型和緩釋劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于中和腫瘤壞死因子α毒性的重組抗人TNFα基因工程抗體及其制備方法,其基因序列在基因庫(Geneback)中的收錄號為AF252545和AF262753,制備的主要步驟包括:利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)方式獲取所需基因抗人TNFα單鏈抗體全序列和部分序列;利用基因工程手段獲得抗人TNFα單鏈抗體重組表達產(chǎn)物;通過對表達產(chǎn)物的純化獲得具有良好活性的重組抗人TNFα單鏈抗體。本發(fā)明具有中和TNFα毒性的作用,對組織損傷的保護作用顯著,其操作簡單,產(chǎn)量、純度高,活性好,使用安全可靠。
文檔編號C12N15/63GK1280190SQ0011387
公開日2001年1月17日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月14日
發(fā)明者陳萍, 鄧健蓓, 韓驊, 藥立波 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學