專利名稱：含有白藜蘆醇細胞的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物有效成份提取中原料物的生產(chǎn)方法，尤其涉及植物細胞培養(yǎng)(克隆)技術(shù)領(lǐng)域。
白藜蘆醇(Resveratrel)化學名為芪三酚，是以葡萄屬植物的一種抗逆物質(zhì)首先被發(fā)現(xiàn)，后來又在其他許多植物(如虎杖、買麻藤、落花生、朝鮮槐、歐洲云杉等)中相繼發(fā)現(xiàn)。自從發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇以來，人們對其分子結(jié)構(gòu)、化學性質(zhì)等方面的特征做了大量研究。特別是發(fā)現(xiàn)在葡萄酒中的營養(yǎng)作用后，對其藥理作用進行了大量研究，結(jié)果認為其很有可能作為一種新藥物來使用。據(jù)文獻報道，白藜蘆醇具有抗菌、抗脂質(zhì)過氧化，預防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、松弛血管、降血脂和抗誘變等作用。尤其是做為天然抗腫瘤劑和誘導SOD的產(chǎn)生，越來越受到人們的重視。目前，關(guān)于白藜蘆醇的研究工作主要集中在藥理作用、提取分離和鑒定、葡萄酒中的含量和白藜蘆醇合成酶的研究，以及外界因素對白藜蘆醇合成的影響等。
白藜蘆醇在多種植物的細胞中存在，一般是通過提取獲得產(chǎn)品。由于各種植物中的含量非常低，其生產(chǎn)受原料和季節(jié)條件的限制，形成規(guī)模產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的困難很大，獲得量非常有限，難以滿足市場需求。
用細胞工程的方法篩選高產(chǎn)細胞系，通過細胞克隆，繼而進行細胞培養(yǎng)獲取有用的天然產(chǎn)物，比從新鮮植物材料中提取更直接、更高產(chǎn)、更穩(wěn)定，且不受自然資源和條件的影響，對于解決天然的次生代謝物的生產(chǎn)問題具有重要意義。目前利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)可以生產(chǎn)生物堿、萜類、甾體、酚類、醌類等許多次生代謝物，做為藥物、香精、色素、調(diào)味品和殺蟲劑等被應用。由于含量低、成本高的問題，曾使細胞培養(yǎng)難以在生產(chǎn)中應用。近年來，通過改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，選擇高產(chǎn)細胞株，極大地提高了植物細胞培養(yǎng)中次生代謝物的含量。最近用固相化技術(shù)和遺傳操作在提高培養(yǎng)細胞中次生代謝物的產(chǎn)量方面也取得了重要結(jié)果，目前已有幾十種植物細胞培養(yǎng)物形成的次生代謝物的含量等于或高于原植物材料。并已有用煙草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)磷酸二酯酶和泛醌，用紫草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素，用人參細胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂甙，用洋地黃細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿等等，都達到了工業(yè)化的生產(chǎn)規(guī)模，用長春花細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌生物堿已達到中試水平。
目前，國內(nèi)外對葡萄細胞培養(yǎng)的研究主要是集中在葡萄花色素的生產(chǎn)，對花色素的形成機理、細胞選育、培養(yǎng)基組成、細胞生長與花青素生成之間的關(guān)系及提取方法做了大量的工作。但是關(guān)于用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)白藜蘆醇的工作還未見有報道。
本發(fā)明的目的是提出一種生產(chǎn)含有白藜蘆醇細胞的方法，就是用細胞培養(yǎng)的方法將含有白藜蘆醇的細胞株大量生產(chǎn)，以解決自然資源缺乏和市場商品緊缺的問題。
本發(fā)明的目的是按以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)。在含有白藜蘆醇的植物體上取材，將獲得的外植體材料進行愈傷組織的誘導培養(yǎng)，把得到的愈傷組織進行單細胞分離，用分離的單細胞進行高產(chǎn)細胞株的誘導篩選；獲得的高產(chǎn)細胞株可以用于三個方面，①用于細胞株保藏，其可以通過愈傷組織誘導和單細胞分離后再次篩選；②通過單細胞分離后，用于細胞懸浮培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞③用于細胞固體培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞，固體培養(yǎng)獲得的細胞也可以經(jīng)單細胞分離后，用于細胞懸浮培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞。
按本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)能得到大量的含有白藜蘆醇的克隆細胞，其不僅能用于白藜蘆醇的生產(chǎn)提取，還可直接用于保健食品和化妝品的添加；具有含量高且穩(wěn)定、不受原料和季節(jié)限制的優(yōu)點，在不依賴自然資源的條件下實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，對于自然資源的保護有著重要意義。本發(fā)明還具有方法簡單、容易實施的特點。
附圖
為本發(fā)明所設計生產(chǎn)含有白藜蘆醇細胞的工藝流程圖。
以下結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明技術(shù)方案的實施要求。
1．取材可以選取含有白藜蘆醇的可組織培養(yǎng)部分為材料，如虎杖、買麻藤、落花生、朝鮮槐、葡萄等的根、莖、葉以及葡萄果實。所取材料經(jīng)清洗、消毒后即可進行愈傷組織的誘導。
2．培養(yǎng)基本發(fā)明通過大量的實驗選擇，確定的基本培養(yǎng)基為MS或／和B5，這是目前較為通用的二種培養(yǎng)基(《植物生物技術(shù)原理與方法》李寶健等著，1992年湖南科學技術(shù)出版社出版)。這二種培養(yǎng)基雖然都能夠適用，但需對其進行改良。首先需要加入有原培養(yǎng)物汁液8-14ml／L；其次需加入有NAA(萘乙酸)0．3-6mg／L和6-BA(6芐基嘌呤)1-6mg／L，這二種激素在細胞培養(yǎng)過程中使用的原則是，從愈傷組織誘導至細胞大量培養(yǎng)期間使用低劑量的NAA(0．3-1mg／L)和高劑量的6-BA(4-6mg／L)，在最終獲得細胞產(chǎn)品的前一步培養(yǎng)中則需改變培養(yǎng)基中激素用量比例，即提高NAA的的濃度(1-6mg／L)降低6-BA的濃度(1-4mg／L)，這樣才能使細胞順利分化，有利于次生代謝物的形成。而這二種改良后的培養(yǎng)基(MS和B5)可以做成固體培養(yǎng)基，也可做成液體培養(yǎng)基，區(qū)別在于是否加有瓊脂。
對于同一細胞株從先期誘導培養(yǎng)到后期生產(chǎn)培養(yǎng)的過程中，能否用這二種培養(yǎng)基(MS和B5)交替轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。通過大量實驗認為一般情況下，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)會使生長受到抑制，繼而出現(xiàn)部分褐化死亡；而在其死亡之前再轉(zhuǎn)接到原始培養(yǎng)基中，會逐漸恢復生長；這說明愈傷組織對其原始培養(yǎng)基具有依賴性，對新環(huán)境的適應能力較差。然而通過多次轉(zhuǎn)接訓練后存活下來的細胞株，其適應環(huán)境的能力明顯提高，同時白藜蘆醇的產(chǎn)生量也顯著提高。
3．單細胞分離是將培養(yǎng)的愈傷組織或細胞團分離成分散的單細胞?？梢圆捎猛ǔ５闹参锛毎蛛x技術(shù)完成。例如，用含有果膠酶(1g／L)的培養(yǎng)液、或是含有甘露醇(0．6mol／L)的培養(yǎng)液、或是含有這二種物質(zhì)的培養(yǎng)液，按1∶10(W／V)的比例加入愈傷組織或細胞團，在25℃條件下黑暗靜置10-16小時，再低速攪拌5-8分鐘，即可獲得分散的細胞懸浮液。其可以用于液體培養(yǎng)進行大量細胞的增殖，也可用100目的網(wǎng)過慮得到分離的單細胞。
4．高產(chǎn)細胞株的篩選就是誘導并篩選出白藜蘆醇產(chǎn)生量高的細胞株，當然這種篩選也包括利用基因工程(導入白藜蘆醇合成酶基因)得到高產(chǎn)細胞株的方法。其誘導通常是采用物理或／和化學的方法在單細胞固體培養(yǎng)過程中完成，包括有光照、激光、同位素輻射、PH值、化學誘導劑、甚至于不同培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)接等等方式，這都是該技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員常用的手段。經(jīng)細胞大量克隆后，檢測白藜蘆醇的產(chǎn)生量，篩選出高產(chǎn)的細胞株，則可進行擴大培養(yǎng)。
5．白藜蘆醇的檢測方法可以參照冀春茹等編《中藥化學實驗技術(shù)與實驗》(P283-287)1986年河南科學技術(shù)出版社出版；王振月等著“脈酸膜中兩個化合物的結(jié)構(gòu)研究”《中草藥》(天津中醫(yī)藥學院)1996年，27(12)714-716；王丹等著“中藥虎杖中白藜蘆醇甙含量測量的研究”《中草藥》1987年，18(11)16-18。
6．大量細胞的生產(chǎn)培養(yǎng)在獲得(白藜蘆醇)高產(chǎn)細胞株后，可以通過固體培養(yǎng)或是液體培養(yǎng)的方法進行不斷地擴大培養(yǎng)，以獲得大量的克隆細胞。如圖所示，其中固體培養(yǎng)可以通過不斷地擴大培養(yǎng)得到最終的細胞產(chǎn)品，完成大量細胞的生產(chǎn)；也可以在固體培養(yǎng)得到一定量的細胞后，經(jīng)分離轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)，用氣升式生物反應器完成大量細胞的生產(chǎn)。而液體(懸浮)培養(yǎng)是在擴大培養(yǎng)到一定量后由氣升式生物反應器完成生產(chǎn)。從誘導培養(yǎng)到最終的大量生產(chǎn)整個過程中的各細胞培養(yǎng)階段，無論是固體培養(yǎng)還是懸浮培養(yǎng)其培養(yǎng)條件均采用常規(guī)手段；溫度為25-30℃，光照12-24h／天，光強1000-5000LX，一個培養(yǎng)周期為3-5周(即在細胞分化前需轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基)；同時從高產(chǎn)細胞株的誘導篩選開始至最后的大量生產(chǎn)，在培養(yǎng)基中可以適量地加入有化學誘導劑，可選擇半乳糖二酸(0-600mg／L)或／和三氯化鋁(0-2mg／L)，以提高細胞中白藜蘆醇的含量。
以下用二個不限定實例來說明本發(fā)明技術(shù)方案的實施。為簡便起見，實例中所用培養(yǎng)基(MS和B5)的具體配方不再細述，詳細配方參見前述文獻。
實例一、①采摘成熟度好、果粒上色充分的葡萄果穗，在流水中沖洗4小時后用5％雙氧水浸泡10分鐘，用無菌水沖洗。配制MS(或B5)固體培養(yǎng)基附加有10ml／L葡萄汁、0．6mg／L的NAA、4．5mg／L的6-BA，分裝滅菌(以后的固體培養(yǎng)基都用此)。
②在超凈臺無菌操作，將葡萄材料切成約0．5cm大小的塊，滅菌清洗后接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在25℃黑暗條件下培養(yǎng)36小時，然后轉(zhuǎn)入光照(2000LX)下培養(yǎng)誘導愈傷組織。3周后將長出的愈傷組織分割，并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。繼代繁殖每2-3周進行一次，應挑選疏松、易碎的愈傷組織。
③取10g新鮮幼嫩的愈傷組織置入100ml單細胞分離培養(yǎng)液中，25℃黑暗靜置14小時。其培養(yǎng)液為0．6mol／L的甘露醇溶液，PH3．5，并加有0．1％(W／V)的果膠酶。低速攪拌6分鐘后，用100目尼龍網(wǎng)過慮，經(jīng)清洗后得到分離的單細胞。
④將單細胞轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進行誘導篩選培養(yǎng)，其培養(yǎng)基內(nèi)增加有誘導劑(三氯化鋁1mg／L和半乳糖二酸300mg／L)。在培養(yǎng)過程中通過各種物理和化學手段對其進行誘變，篩選出白藜蘆醇含量高的細胞株。經(jīng)分離后再進行誘導篩選培養(yǎng)，可重復2-5次，最終確定高產(chǎn)細胞株。
⑤細胞株的保藏過程實際上是不斷地繼代培養(yǎng)過程。
⑥將高產(chǎn)細胞株分割成多塊，轉(zhuǎn)移至含有誘導劑的固體培養(yǎng)基上進行擴大培養(yǎng)，3-5周為一個周期，可以不斷地重復擴大。
⑦將擴大培養(yǎng)的細胞團分割，轉(zhuǎn)移至含有誘導劑的固體培養(yǎng)基上進行大量細胞的生產(chǎn)，其培養(yǎng)基內(nèi)NAA的含量為4mg／L、6-BA的含量為2mg／L；經(jīng)30℃條件下培養(yǎng)3-5周(在細胞分化前)，收集細胞團為細胞產(chǎn)品，可用于白藜蘆醇的提取或直接制成產(chǎn)品。
實例二、①配制B5(或MS)液體培養(yǎng)基附加有葡萄汁12ml／L，NAA 0．4mg／L、6-BA 4．5mg／L、三氯化鋁2mg／L，分裝后滅菌。(以后的液體培養(yǎng)基都用此)。
②將例一中④、⑤、⑥任一步驟最終得到的細胞團經(jīng)分離后，轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)一周，接入量為培養(yǎng)液的1／5(W／V)，此為適應培養(yǎng)。
③在適應培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)懸浮液整體移入5倍量的液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3-5周(細胞分化前)，按此重復1-4次進行擴大培養(yǎng)。
④將擴大培養(yǎng)后的細胞懸浮液移入新鮮的液體培養(yǎng)基中(其中NAA為5mg／L，6-BA為3mg／L、半乳糖二酸600mg／L)，使細胞密度達到105個／ml，置入氣升式生物反應器中生產(chǎn)培養(yǎng)4周(在細胞分化前)，培養(yǎng)結(jié)束后用過慮(或離心)的方法收集細胞產(chǎn)品，可用于白藜蘆醇的提取或是直接制成產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1．一種含有白藜蘆醇細胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，在含有白藜蘆醇的植物體上取材，將獲得的外植體材料進行愈傷組織的誘導培養(yǎng)，把得到的愈傷組織進行單細胞分離，用分離的單細胞進行高產(chǎn)細胞株的誘導篩選；獲得的高產(chǎn)細胞株可以用于三個方面，①用于細胞株保藏，其可通過愈傷組織誘導和單細胞分離后再次篩選；②通過單細胞分離后，用于細胞懸浮培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞；③用于細胞固體培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞，固體培養(yǎng)獲得的細胞也可經(jīng)單細胞分離后，用于細胞懸浮培養(yǎng)獲得大量的克隆細胞。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為MS或／和B5培養(yǎng)基，并添加有原培養(yǎng)物汁液8-14ml／L，NAA 0．3-6mg／L，6-BA 1-6mg／L。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的NAA和6-BA的使用原則為愈傷組織誘導至大量培養(yǎng)期間使用NAA為0．3-1mg／L、6-BA為4-6mg／L，在最終獲得細胞產(chǎn)品的前一步培養(yǎng)中NAA為1-6mg／L、6-BA為1-4mg／L。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的任一種方法，其特征在于，所取的植物體材料為葡萄果實。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于從誘導篩選至最后細胞的大量生產(chǎn)，在培養(yǎng)基中加入有化學誘導劑；可選擇半乳糖二酸0-600mg／L、三氯化鋁0-2mg／L。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，細胞產(chǎn)品的最終生產(chǎn)是由懸浮培養(yǎng)得到的大量細胞通過氣升式生物反應器培養(yǎng)完成。
7．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，細胞產(chǎn)品的最終生產(chǎn)是由固體培養(yǎng)得到的大量細胞通過氣升式生物反應器培養(yǎng)完成。
8．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，細胞產(chǎn)品的最終生產(chǎn)是由不斷擴大的固體細胞培養(yǎng)完成。
全文摘要
一種生產(chǎn)含有白藜蘆醇細胞的方法,本發(fā)明是將含有白藜蘆醇植物體材料通過愈傷組織誘導、單細胞分離、高產(chǎn)細胞株的誘導篩選、擴大培養(yǎng)及大量細胞的生產(chǎn)培養(yǎng),最終得到含有白藜蘆醇的細胞產(chǎn)品。其可以用于白藜蘆醇的生產(chǎn)提取和保健食品及化妝品的添加。本發(fā)明具有含量高且穩(wěn)定、不受原料和季節(jié)限制的優(yōu)點,在不依賴自然資源的條件下實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),對于自然資源的保護有著重要意義。
文檔編號C12N5/04GK1292415SQ0011391
公開日2001年4月25日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者尉亞輝 申請人:尉亞輝