專利名稱：增效蛋白工程菌株的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增效蛋白工程菌株及其用途和構(gòu)建方法，該菌株含有昆蟲病毒增效蛋白全長基因，能在原核生物中復(fù)制。本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)在已知，昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)是由昆蟲病毒基因編碼能顯著提高另一種病毒殺蟲活性的一種功能性蛋白質(zhì)。1998年，美國學(xué)者(Zhong，J.andR.R.Grandos 1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology andMicrobial Control IVth Intematiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-28∶65)已將粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulosis virus簡稱TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角體病毒AcNPV，構(gòu)建了重組病毒工程毒株，并用該毒株與野生型病毒混合使用，可顯著提高Tn的殺蟲效果。然而，這種工程病毒受到其宿主范圍及其毒力的影響，因此在應(yīng)用上有著局限。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有昆蟲病毒增效蛋白基因的重組質(zhì)粒(工程菌株)，該質(zhì)粒的構(gòu)建方法、用途以及由此菌株來構(gòu)建一系列高效表達(dá)載體生產(chǎn)昆蟲病毒增效蛋白。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下一種工程菌株，含有粉紋夜蛾顆粒體增效蛋白基因并能在原核生物體內(nèi)復(fù)制的重組質(zhì)粒pGEM-T/En(寄存于原核生物-大腸桿菌TG1株)，該工程菌種命名為E-coli TG1(pGEM-T/En)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊號為CCTCC M20006。
該工程菌株由下列DNA元件組成(1).粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白全基因；(2).絲狀噬菌體f1復(fù)制起始點(diǎn)；(3).大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(4).氨芐青霉素抗性基因。
用于構(gòu)造TnGV增效蛋白重組載體的原始材料有如下幾種(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)，由美國湯姆·杰弗遜大學(xué)贈送；(2)受體大腸桿菌E.coli TG1菌株，購自QIA-GEN公司；(3)pGEM-T載體，購自Promega公司。
用來擴(kuò)增TnGV增效蛋白基因的載體通過基因工程方法獲得，其構(gòu)建方法是根據(jù)已報道的粉紋夜顆粒體蛾病毒(TnGV)增效蛋白基因序列[Hashimoto，Y.et.al1991，J.Gen.Virol72(11)2645-2651]，以TnGV基因組DNA作模板，設(shè)計引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法擴(kuò)增增效蛋白基因，得到全長約2.9Kb的片段，與pGEM-T載體用T4DNA酶連接后，再轉(zhuǎn)化至公眾普遍易得的大腸桿菌E.coli TG1受體菌，經(jīng)篩選獲得含增效蛋白全長基因片段的克隆，定名為E.coli TG1(pGEM-T/En)，該工程菌株于2000年5月17日送交并保藏于中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號為CCTCC M20006。


圖1為構(gòu)建本發(fā)明的重組質(zhì)粒pGEM-T/En示意圖，圖中KKpnl，BbamH I，SSal I，CCla I，陰影部分表示En-TnGV基因。
以下結(jié)合附圖和具體的實施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，這些實施方案無意于以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求所要求的范圍。(一)En-TnGV基因的PCR擴(kuò)增1.TnGV-DNA的提取取TnGV懸液100μl，加等體積0.04mol/L NaOH堿解液及終濃度為1％的SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶異戊醇(24∶1V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗滌DNA沉淀，自然干燥，將DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8.0)緩沖液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR擴(kuò)增取TnGV-DNA10μl，作10倍稀釋，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司Taq DNA Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱的DNA多聚酶)操作手冊，并參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl，(2)兩引物各2μl，(3)10mmol/L dNTPs(脫氧核苷三磷酸)2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)補(bǔ)去離子水至100μl反應(yīng)體積，(6)加石蠟油覆蓋液面，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件93.5℃變性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循環(huán)30次，最后一次循環(huán)在72.5延伸7min，經(jīng)電泳檢測，得到單一的長約2.9kb的En-TnGV基因全長DNA片段。
(二)En-TnGV基因PCR產(chǎn)物的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖回收PCR擴(kuò)增的En-TnGV基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖制備0.7％的凝膠，將DNA樣品與加樣緩沖液(滇酚藍(lán)0.25％，蔗糖40％)混合，加入點(diǎn)樣孔，電泳結(jié)束后，在長波(256nm)紫外燈確定并切下～2.96KbDNA帶，放入1.5ml離心管中，加入約5倍體積的20mmol/L Tris·Cl(三羥甲基氨基甲烷的鹽酸鹽溶液)-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)(pH8.0)至瓊脂糖塊中，65℃溫育至凝膠塊熔化，加入等體積堿性酚，顛倒數(shù)次混勻后，8,000rpm離心10min，水相用酚∶氯仿∶異戊醇，氯仿∶異戊醇，氯仿∶異戊醇各抽提一次，再加入1/10體積3mol/LNaAc(pH5.2)及2倍體積無水乙醇，混勻后-20℃過夜，次日離心，棄上清，用75％乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后溶于適量TE緩沖液中，-20℃保存。
(三)Dot blot驗證En-TnGV基因(1)En-TnGV基因探針的制備按DIG標(biāo)記及檢測試劑盒操作手冊進(jìn)行，加1μg En-TnGV基因PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加滅菌雙蒸水至16μl，100℃煮沸10min，快速在冰NaCl冰浴，加4μl DIG-High Prime(地高辛標(biāo)記引物)，混勻，37℃放置1-20hr，最后65℃加熱10min終止反應(yīng)。
(2)去除未結(jié)合的DIG-dUTP(地高辛標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸)在上步處理樣品中，加無水冷乙醇(-20℃)80μl，混勻，-20℃放置2hr，12,000rpm離心15min，去上清，加50μl 75％乙醇洗沉淀，自然干燥，加50μl TE緩沖液溶解探針DNA。
(3)預(yù)雜交將TnGV-DNA基因組1μl，點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，室溫干燥后，在變性液(1.5mol/L NaCl-0.5mol/L NaOH)中處理5min，水中漂洗2min，復(fù)性液[1mol/L Tris·Cl(pH7.4)1.5mol/L NaCl]中處理5min，2×SSC液中漂洗2min，室溫晾干，80℃烘膜2hr備用，與探針DNA雜交。將干膜于5×SSC浸濕后，放到雜交袋中，按0.2ml/cm2的量加雜交液，封口并不留氣泡，68℃水浴2hr。
(4)DNA雜交將標(biāo)記好的探針DNA在沸水煮10min后，冰浴，加入雜交液(5×SSC1.5％Blocking reagent0.1％N-Laurol-sarco-sine0.02％SDS)中，混勻，剪開雜交袋，倒出雜交液，注入新的雜交液，重新封口并不留氣泡在袋內(nèi)，68℃保溫8-24hr。
(5)顯色從袋中取出膜，用洗滌液I(2×SSC0.1％SDS)洗10min后，重復(fù)3次→再用洗滌液II(0.1×SSC0.1％SDS)洗15min，重復(fù)2次→在bufl(0.1M馬來酸0.15MnaCl pH7.5)中洗5min→在buf2(含1.5％Blocking reagent的bufl)中輕搖30min→在buf2*，27℃，輕搖30min→用bufl洗15min，重復(fù)2次→在buf3中洗2min，放入20ml新配buf4，避光放置1-8hr，觀察結(jié)果，若出現(xiàn)合適的點(diǎn)就用TE緩沖液50ml沖洗5min。
(四)質(zhì)粒DNA的制備及DNA的限制性內(nèi)切酶消化使用常規(guī)技術(shù)(參見Sambrook等在“分子克隆”的方法，實驗室手冊，冷泉港，1989)培養(yǎng)細(xì)菌并分離質(zhì)粒DNA。
(1)細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增從平板上挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素和卡那霉素抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，至培養(yǎng)物OD600達(dá)到0.6以上。
(2)快速提取質(zhì)粒DNA將培養(yǎng)物移至離心管中，8,000rpm離心5min棄上清，收集菌體，每5ml菌液的菌體加1ml STE(0.1MnaCl，10mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTApH8.0)重懸，8,000rpm離心5min，棄上清，將沉淀重懸于200μl冷溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl pH8.0，10mMEDTA pH8.0)，加入400μl新鮮配制的溶液II
，緩慢顛倒數(shù)次置冰浴幾分鐘，另入300μl冷溶液III(5M醋酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml加蒸餾水至100ml)，倒置管溫和地振蕩10秒鐘混勻內(nèi)容物，置冰上5min，12,000rpm離心5min，吸取上清至另一干凈離心管，加等體積酚∶氯仿∶異戊醇充分混勻，12,000rpm離心2min，吸取水相至另一干凈離心管，加2倍體積的無水冷乙醇，混勻后室溫放置15min，12,000rpm離心10min，倒盡上清，用75％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min后倒出乙醇，管倒置于紙巾上，使殘余乙醇揮發(fā)，加入50μl TE緩沖液溶解核酸沉淀。加入RNase A至終濃度20μg/ml，37℃放置1hr，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定無RNA帶后加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提，吸水相至另一干凈離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入2倍體積無水乙醇，混勻后置-20℃，1小時左右后，12,000rpm離心10min，核酸沉淀用75％乙醇洗滌，自然干燥后加TE緩沖液20uL，置-20℃保存。
(五)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR產(chǎn)物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌體多核苷酸激酶操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)，在滅菌的0.5ml離心管中。
(1)加入En-TnGV基因PCR產(chǎn)物1μg，(2)激酶10×緩沖液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)補(bǔ)加去離子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。加40μl苯酚∶氯仿∶異戊醇振蕩1min，8,000rpm離心2min，再用氯仿∶異戊醇抽提1次，轉(zhuǎn)移上清水相至一干凈離心管，加入1/10體積3M乙酸鈉，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃過夜，12,000rpm離心20min，棄上清，自然干燥，重懸DNA于20uL TE緩沖液。
2.連接En-TnGV基因PCR產(chǎn)物到pGEM-T質(zhì)粒按Promega公司的pGEM-T載體操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗室手冊，冷泉港，1989，在已滅菌干凈的0.5ml離心管中，加入(1)10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，(2)50ng/μl的pGEM-T載體，1μl，(3)約50ng的上述處理樣品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA連接酶1μl，(5)補(bǔ)加去離子水至10μl，混勻后置4℃連接過夜。
3.大腸桿菌TG1菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化從37℃培養(yǎng)16-20hr的新鮮LB平板中挑取Ecoli TG1單菌落，置3mlLB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，再將菌液按1∶100比例接種于適量LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)約3hr(OD600＝0.3-0.4)，將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管，置冰上10min，待培養(yǎng)物預(yù)冷至0℃時，4,000rpm離心10min，收集菌體，倒出培養(yǎng)液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞，置冰上半小時后，4,000rpm離心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞。所制成感受態(tài)細(xì)胞置4℃，并在12～24hr內(nèi)使用。
在100μl E.coli TG1菌株感受態(tài)細(xì)胞中加入8uL待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物DNA(DNA≤50ng)，輕旋以混勻內(nèi)容物，置冰上30min，于42℃水浴中熱休克90s后，迅速移至冰浴中，待細(xì)胞冷卻1-2min后，每管加入900μl SOC培養(yǎng)液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH調(diào)pH值至7.0，15磅20分鐘高壓滅菌。臨用前加入5ml已滅菌的2MMgCl2，20ml已滅菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm溫育45min，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布至含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時后觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。
(六)工程菌株E.coli TG1(pGEM-T/En)的篩選(1)顯色平板在Amp+平板上涂布30μl X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-硫代半乳糖，X-gal20mg/ml溶于二甲基甲酰胺中)和10μl IPTG(100mg/ml)，待平板表面液體被完全吸收后，涂布轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌懸液，37℃放置約1hr，使平板吸收完菌液，再倒置培養(yǎng)12-16小時，白色菌落為陽性，藍(lán)色菌落為陰性。
(2)重組質(zhì)粒pGEM-T/En的酶切鑒定將小量提取的重組質(zhì)粒pGEM-T/En用限制性內(nèi)切酶SalI，BamHI和KpnI單酶切消化，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后觀察，通過與分子量比較DNA片段大小的方法進(jìn)一步鑒定。
權(quán)利要求
1.一種工程菌株E.Coli TG1(pGEM-T/En)，該工程菌株已提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CTCC M20006。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，它攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白全基因，并能夠在原核生物中復(fù)制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，其特征在于它所含重組質(zhì)粒pGEM-T/En是由下列DNA元件構(gòu)成(1).粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白全基因；(2).絲狀噬菌體f1復(fù)制起始點(diǎn)；(3).大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(4)氨芐青霉素抗性基因。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于以TnGV基因組DNA作模板，設(shè)計引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法擴(kuò)增增效蛋白基因，得到全長～2.9Kb的片段，與pGEM-T載體用T4DNA連接酶連接后，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E-coli TG1受體菌，經(jīng)篩選獲得含增效蛋白全長基因片段的工程菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因工程手段構(gòu)建工程菌株:CTCC M20006 EColi TG1(pGEM－T/En)、工程菌株的構(gòu)建方法和工程菌株的用途。該菌株是以TnGV為模板,經(jīng)T
文檔編號C12N1/21GK1331285SQ0011466
公開日2002年1月16日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者孟小林, 徐進(jìn)平 申請人:武漢大學(xué)