專利名稱：篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選轉(zhuǎn)基因動植物的方法，尤其是一種新的篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法。
轉(zhuǎn)基因動植物是新發(fā)展起來的生物高技術(shù)，它可以成為一種生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品；也可以作為新的品種為人類提供優(yōu)質(zhì)的生物產(chǎn)品。
家蠶(Bombyx mori，簡寫為Bm)是一種有用的經(jīng)濟昆蟲。在中國已有幾千年的飼養(yǎng)的歷史，飼養(yǎng)成本低、技術(shù)成熟。蠶體、蠶蛹可以食用，連排泄物蠶沙都能做藥，可見對人體有益無害。蠶生長周期短，繁殖力強，具有很強的蛋白質(zhì)合成功能。
核酶(Ribozyme)是一種具有催化RNA切割反應(yīng)功能的RNA分子，它可以有效地和序列特異地切割病毒基因的mRNA分子，從而阻斷該基因的表達和抑制病毒的復(fù)制和繁殖。
家蠶膿病是由核多角體病毒(簡寫為NPV)感染引起的。當(dāng)家蠶食用了帶有核多角體病毒的病毒會發(fā)膿病而死亡。
本發(fā)明人實驗室針對NPV的即刻早期蛋白(簡寫為IE)基因設(shè)計了聯(lián)合型的核酶，可以分別切割靶序列的三個不同位點(張曉嵐、陳農(nóng)安、祁國榮、陸長德，病毒學(xué)報，1996,12(4):374-380.)。BmNPV IE的mRNA翻譯編碼區(qū)全長1752bp，通過計算機分析發(fā)現(xiàn)-47,208和687三個位點附近的二級結(jié)構(gòu)較為理想，適合作為核酶的切割位點。這些位點不僅處于BmNPV即刻早期基因IE的功能保守區(qū)，而且切點兩側(cè)堿基形成環(huán)狀突起結(jié)構(gòu)，有利于核酶分子的接近。為了提高核酶阻斷BmNPV IE基因表達的效率，我們將三個核酶分子R47、R208和R687串聯(lián)起來形成三聯(lián)體核酶(R426)，并在它的5’和3’端設(shè)計了兩個自剪切的cis-核酶將其在轉(zhuǎn)錄后釋放出來，以避免過長的側(cè)翼序列影響R426生物活性的發(fā)揮。我們構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBNR426。體外切割實驗的結(jié)果表明，該三聯(lián)體核酶在體外能有效地和序列特異地切割病毒即刻早期蛋白基因的mRNA分子。細胞實驗表明，該三聯(lián)體核酶能在細胞內(nèi)表達，并能有效地切割病毒RNA分子，接種NPV病毒的實驗表明，該三聯(lián)體核酶在細胞內(nèi)可以明顯減少細胞內(nèi)核多角體的形成，表達核酶的細胞能使核多角體數(shù)減少約30％(張曉嵐、張峰、祁國榮、陸長德，高技術(shù)通訊1997,7(4):23-27.)。接著，我們又成功地實現(xiàn)了抗NPV核酶基因在家蠶基因組中的整合，在轉(zhuǎn)基因蠶后代中獲得了抗性比對照組高10倍以上的轉(zhuǎn)基因蠶新品種(張峰，陳秀，趙昀，祁國榮，黃君霆，陸長德，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報》1999,31(3):331-333.)，說明核酶在家蠶整體水平也能抑制病毒基因的表達和病毒的復(fù)制、繁殖。
如上所述，家蠶將是一種很好的做轉(zhuǎn)基因動物的材料，可以用作生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，甚至可以不經(jīng)過分離純化制成凍干粉直接服用。然而，以前用蠶作生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品主要是以桿狀病毒作載體的。例如表達人生長激素(Sumathy S et al.ProteinExpression and Purification 1996,7(3):262-268)；草鯉魚生長激素(Ho WK et al.Biochim Biophys Acta 1998 1381(3):331-339)；犬細小病毒VP2蛋白(Choi JY et al.Arch Virol.2000,145(1):171-177)；人激活素C(Kron R et al.J.Virol Methods 1998,72(1):9-14)等，并不用轉(zhuǎn)基因的方法。用桿狀病毒作載體可以在蠶中高表達外源基因，但是也存在一些問題，1)它不是外源基因在蠶中整合的穩(wěn)定表達，難以做到每一批都能控制表達的量。2)用此方法必然也帶進了病毒基因，也一定會表達出病毒的蛋白質(zhì)，這樣會增加分離純化的難度，直接服用也要考慮安全性的問題。因此，用轉(zhuǎn)基因蠶作生物反應(yīng)器可以克服上述問題，而轉(zhuǎn)基因需要發(fā)展一種新的篩選方法，要求它既能有效地從大量的實驗個體中篩選出轉(zhuǎn)基因個體，又不增加產(chǎn)品分離純化的難度和不帶來可能的不安全的問題。
為此，本發(fā)明目的是在上述抗NPV核酶基因在家蠶基因組中整合成功的基礎(chǔ)上提供一種利用核酶的抗病毒作用篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法。該方法方便有效，且采用的篩選基因在方法中不會增加對產(chǎn)品的分離純化要求。
本發(fā)明是利用核酶的抗病毒作用篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法。該種篩選方法的步驟包括1)構(gòu)建表達目的基因與作為篩選基因的抗病毒核酶基因的重組質(zhì)粒。2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入蠶受精卵內(nèi)。3)用病毒攻擊來篩選轉(zhuǎn)基因的個體，有核酶表達的家蠶個體能夠耐受病毒的攻擊而存活下來。4)能夠耐受病毒攻擊的蠶繼代育種，繼續(xù)用病毒攻擊篩選，通過幾代篩選結(jié)合基因鑒定得到轉(zhuǎn)基因蠶。5)測定目的基因在轉(zhuǎn)基因蠶中的表達。
為了研究這一方法，本發(fā)明用熒光素酶基因代表目的基因與抗NPV的核酶的基因重組成表達質(zhì)粒，在這個質(zhì)粒中(見


圖1)，抗NPV IE基因的核酶基因在熒光素酶基因后面，先轉(zhuǎn)錄出熒光素酶，再轉(zhuǎn)錄出核酶。因此，能表達核酶的蠶應(yīng)當(dāng)有熒光素酶基因表達。當(dāng)用這個重組表達質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶卵中，然后當(dāng)蠶卵孵化成蠶后用NPV進行攻擊。凡是有抗NPV的核酶基因表達的蠶具有耐NPV攻擊的能力，能夠存活，無核酶表達的蠶不能存活，即用核酶的抗病毒作用來篩選轉(zhuǎn)基因蠶。經(jīng)過幾輪篩選結(jié)合基因的鑒定得到了轉(zhuǎn)基因蠶。此轉(zhuǎn)基因蠶是能抗NPV攻擊且表達目的基因熒光素酶的轉(zhuǎn)基因新品系。Southern雜交結(jié)果證明核酶基因多拷貝地整合在染色體的不同位點，并且與熒光素酶基因是連鎖的，表明此方法是可行的。采用此方法也可以篩選得到表達其他目的基因的轉(zhuǎn)基因蠶。例如表達人或其他動物的活性蛋白質(zhì)(如生長激素、干擾素、降鈣素、紅細胞生成素、血小板生成素、人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、抗凝血酶等)；抗體(如各種單克隆抗體)；或表達其他病原體的蛋白作疫苗(如人乙型肝炎病毒疫苗、瘧原蟲抗原、豬口蹄疫疫苗等)。用抗NPV的其他基因(例如遲早期基因或晚期基因等)的核酶或抗家蠶其他病毒(例如胞質(zhì)多角體病毒CPV等)的核酶也可以用于篩選其他轉(zhuǎn)基因蠶。也可以將此方法用于篩選其他轉(zhuǎn)基因動植物(例如轉(zhuǎn)基因雞等)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1)能方便而有效地從眾多的實驗蠶中篩選出轉(zhuǎn)基因蠶。2)沒有使用蛋白質(zhì)產(chǎn)物的篩選基因。所采用的篩選基因是核酶基因，其表達產(chǎn)物是RNA而不是蛋白質(zhì)，因而除了目的基因外不會在轉(zhuǎn)基因個體中表達其他蛋白質(zhì)，對于生物反應(yīng)器而言不會因為篩選方法帶入的蛋白質(zhì)而增加對產(chǎn)品的分離純化的要求。對于轉(zhuǎn)基因蠶食物而言，由于核酶是RNA，RNA分子進入人體后很快被降解，用作食物也不會帶來不安全的問題。
本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進一步說明，但不限制本發(fā)明的范圍。
圖1重組表達質(zhì)粒pLuciRz的構(gòu)建圖2 G4代蠶中核酶基因的PCR檢測1從質(zhì)粒中擴增的核酶基因，2對照蠶的PCR檢測，3-32轉(zhuǎn)基因蠶的PCR檢測圖3 G4代蠶中熒光素酶基因的PCR檢測A熒光素酶基因的PCR檢測，BPCR產(chǎn)物的Southern雜交1陽性對照，2對照蠶的PCR檢測，3-9轉(zhuǎn)基因蠶的PCR檢測圖4轉(zhuǎn)基因蠶中熒光素酶基因與核酶基因及IE啟動子的連鎖分析
1質(zhì)粒中擴增的熒光素酶基因陽性對照，2對照蠶中熒光素酶基因的PCR檢測，3-6轉(zhuǎn)基因蠶中熒光素酶基因的PCR檢測(PL1,PL2),7-11轉(zhuǎn)基因蠶中熒光素酶基因與核酶基因連鎖的PCR檢測(PL1,PR2),12-15轉(zhuǎn)基因蠶中熒光素酶基因與IE啟動子連鎖的PCR檢測(PI1,PL2)圖5轉(zhuǎn)基因蠶的Southern雜交鑒定1以熒光素酶基因為探針的Southern雜交，2以核酶基因為探針的Southern雜交實施例1轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建使用熒光素酶報道基因代表目的基因，并用病毒IE基因啟動子帶動熒光素酶基因與核酶基因的表達，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pLuciRz。具體步驟為將發(fā)明人實驗室以前構(gòu)建的帶三聯(lián)體核酶的質(zhì)粒pBNR426用PstⅠ酶切后用Klenow酶削平，再用SalⅠ酶切出三聯(lián)體核酶基因片段(pBNR426參見張曉嵐、陳農(nóng)安、祁國榮、陸長德，病毒學(xué)報，1996,12(4):374-380.)；設(shè)計引物P1和P2，在引物5’端設(shè)計BamHⅠ位點，3’端設(shè)計HindⅢ位點。引物P1和P2序列P15’ TTCGGATCCGATTTGCAGTTCGGGA 3’BamHⅠP25’GCGAAGCTTAGTCGTTTGGTTGTTCA 3’HindⅢ以BmNPV為模板，用PCR擴增出IE啟動子片段，擴增條件為94℃ 5分鐘變性后，94℃ 0.5分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘進行30循環(huán)，再72℃延伸10分鐘。擴增出的IE啟動子片段經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后裝入熒光素酶表達基本質(zhì)粒pGL2Basic(promega公司)中熒光素酶基因前面的BglⅡ和HindⅢ位點，構(gòu)建出由IE啟動子帶動的熒光素酶表達質(zhì)粒pGL2PIE。pGL2PIE用BamHⅠ切開，用Klenow酶補平，再用SalⅠ切開；插入三聯(lián)體核酶基因片段即得到重組表達質(zhì)粒pLuciRz(
圖1)。質(zhì)粒用堿法抽提得到，線形化后用于基因?qū)搿?br> 實施例2重組質(zhì)粒的導(dǎo)入取54A品種家蠶的蛾交配后收集剛產(chǎn)下的蠶卵(產(chǎn)卵后0-2小時)，用電穿孔方法將線性化重組DNA導(dǎo)入蠶受精卵。電穿孔方法的具體做法是同源重組質(zhì)粒pLuciRz經(jīng)ScaⅠ酶線性化后用于導(dǎo)入。收集剛產(chǎn)下的蠶受精卵，在每只電穿孔杯中放入400-500粒，加入500ml含100μg線性化DNA的溶液(0.2mg/ml)混勻，冰浴5分鐘。在電穿孔中(BIO-RADGene PulserⅡ)用電壓500V、電容25pF和電阻200Ω的條件下電擊，移開后幾分鐘再取出蠶受精卵，晾干，酸處理后孵化并統(tǒng)計孵化率。經(jīng)處理的蠶卵的孵化率為50％左右。
實施例3轉(zhuǎn)基因蠶的篩選由于導(dǎo)入基因是IE啟動子帶動的以熒光素酶為報告基因的核酶重組質(zhì)粒，所以G1代家蠶中凡轉(zhuǎn)入基因的蠶個體中會表達核酶。因此從G1代開始用家蠶核型多角體病毒(BmNPV)進行篩選。對54A家蠶進行NPV病毒的試驗表明它的半致死濃度(LC50)為1×106。用4.8×106NPV病毒攻擊時全部死亡。因此，對G1代實驗蠶自二齡起選用4.8×106NPV病毒攻擊，將小片桑葉在4.8×106NPV病毒液中浸泡數(shù)分鐘后晾干，給蠶喂食24小時，能存活的配對繼代。
能抗病毒的G1家蠶個體其子代不一定能抗病毒，因此從G2代開始繼續(xù)用家蠶核型多角體病毒(BmNPV)進行篩選。自二齡起對實驗蠶繼續(xù)用4.8×106NPV病毒攻擊，能存活的配對繼代。對G4代實驗蠶測定各蛾區(qū)蠶抗病毒能力。在進行NPV病毒攻擊時，分別使用4個級別的濃度(單位是NPV病毒顆粒數(shù)/毫升)1級，4.8×107；2級，4.8×106；3級，4.8×105；4級，4.8×104，以蒸餾水為對照。每個級別濃度的NPV病毒攻擊家蠶30條，為了讓每一條蠶食下大致相同數(shù)量病毒，將小片桑葉在不同濃度病毒液中浸泡數(shù)分鐘后晾干，給蠶喂食24小時。分別統(tǒng)計各濃度對應(yīng)的家蠶死亡率，按文獻.方法(趙遠等，蠶業(yè)科學(xué)1996,22(4):219-223)求得各區(qū)家蠶死亡50％時對應(yīng)的NPV濃度，即半致死濃度LC50,G4代實驗蠶11個蛾區(qū)(N1-N11)轉(zhuǎn)基因蠶接種NPV病毒的LC50結(jié)果見表1。
表1G4代轉(zhuǎn)基因蠶對NPV的抗性
*C為對照蠶54A。
其中N4蛾區(qū)抗NPV病毒的能力是對照蠶的19倍，N3蛾區(qū)抗NPV病毒的能力是對照蠶的9倍。選擇NPV抗性最高的N4區(qū)家蠶傳代，以期獲得表達目的基因-熒光素酶和核酶的轉(zhuǎn)基因蠶新品系。
實施例4轉(zhuǎn)基因蠶的鑒定1、蠶后部絲腺DNA的抽提取G4代蠶的五齡蠶后部絲腺放入勻漿器中，加入1ml DNA-ZOL溶液，反復(fù)勻漿數(shù)次，待溶液澄清后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。加入0.5ml無水乙醇，反復(fù)顛倒離心管數(shù)次，可以看到絮狀沉淀產(chǎn)生。用牙簽將絮狀物挑出，用95％乙醇洗滌二次，得到蠶后部絲腺DNA待其干燥后加入適量10mMTris-HCl,pH7.6或ddH2O溶解并測定DNA濃度。2、G4代家蠶熒光素酶基因和核酶基因的PCR檢測合成以下引物熒光素酶的兩特異引物PL1、PL2PL1 5’ CATGGAAGACGCCAAA 3’PL2 5’ CTACAATTTGGACTTTC 3’三聯(lián)體核酶基因兩端的引物PR1、PR2PR1 5’ CCCTGCAGCTAGCCTGA 3’PR2 5’ CCGTCGACGTTTCGTCC 3’在G4代獲得的抗性最強一區(qū)(N4)的家蠶中抽樣40條，分別抽提各蠶的基因組DNA并取1μg作為模板，先用三聯(lián)體核酶基因兩端的引物PR1、PR2進行擴增，擴增條件為94℃ 5分鐘變性后，94℃ 0.5分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘進行30循環(huán)，再72℃延伸10分鐘。經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，除對照組家蠶外，有36條轉(zhuǎn)基因蠶的基因組中均能擴增出陽性條帶，與從質(zhì)粒pLuciRz中擴增出的核酶基因大小相同(258bp)，表明G4代抗性區(qū)的家蠶中90％以上的個體基因組中有核酶基因的整合(圖2)。再用針對熒光素酶的兩特異引物PL1、PL2用同樣的條件進行PCR擴增。經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳分析，除對照家蠶外，凡有核酶基因整合的轉(zhuǎn)基因蠶中均能檢測到熒光素酶基因的整合，陽性率為100％，且產(chǎn)物大小與熒光素酶基因相同(圖3)。表明熒光素酶基因整合后并未發(fā)生重組和斷裂現(xiàn)象。
3、熒光素酶與核酶基因連鎖的分析合成IE啟動子的5’上游引物PI1:5’CGATTTGCAGTTCGGGA 3’。用PCR對IE啟動子與熒光素酶基因及熒光素酶基因與核酶基因的連鎖性進行了鑒定。以熒光素酶基因的一對引物擴增的樣品為對照，分別用IE啟動子的5’上游引物PI1與熒光素酶基因3’下游引物PL2進行擴增，檢查IE啟動子與熒光素酶基因的連鎖關(guān)系；用熒光素酶基因5’引物PL1與核酶基因3’引物PR2進行擴增，檢查熒光素酶基因與核酶基因的連鎖關(guān)系。擴增條件同上。結(jié)果如圖4所示，IE啟動子與熒光素酶基因是連鎖的，而熒光素酶與核酶基因也是連鎖的，表明我們導(dǎo)入的外源基因在整合時并未斷裂。
4、熒光素酶基因與核酶基因的Southern雜交鑒定探針的制備熒光素酶基因探針用隨機六核苷酸引物法制備。將DNA水溶液(25-50μg/ml)于100℃加熱10分鐘后，迅速冰浴冷卻，取其中2μl放入0.5ml離心管中，用于探針制備反應(yīng)。然后加入1μ隨機六核苷酸引物，1μl10×緩沖液(900mM Hepes pH6.6,100mM MgCl2),1μl10×3dNTP(dGTP,dCTP,dTTP各2mM),3μl[α-32P]dATP(3,000Ci/mmol,10μCi/μl),1μl DTT(20mM),1μl Klenow酶(5u/μl)，于37℃反應(yīng)3-4小時。最后，用Sephadex G-50過柱分離收集探針，-20℃保存。核酶基因探針用PCR方法制備，用PR1,PR2二個引物，以pBNR426為模板進行擴增，反應(yīng)中加入[α-32P]dATP。產(chǎn)物用6％PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳(含7M尿素)分離，割膠、浸泡所需的凝膠條帶，乙醇沉淀純化標(biāo)記的DNA。
將G4代五齡蠶的基因組DNA用HindⅢ單酶解后，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳、凝膠照相后用0.5M NaOH,1.5M NaCl變性45分鐘,1MTris.HCl(pH7.0),1.5M NaCl中和15分鐘，小心地置于兩端浸泡于20×SSC中的濾紙上，覆以Hybond-N+尼龍膜、濾紙和10-15cm厚的吸水紙，再壓上500克左右的重物，轉(zhuǎn)移12-24小時。轉(zhuǎn)移后涼干，夾在兩張濾紙之間置80℃烘烤2小時，將固定后的尼龍膜分為兩部分直接進行雜交，一份用熒光素酶探針雜交，另一份用核酶探針雜交。雜交時將轉(zhuǎn)移的尼龍膜裝入塑料袋中，加入10ml預(yù)雜交液(0.5％SDS,5×Denhardt’s溶液，6×SSC,100mg/ml變性鮭魚精DNA)，68℃(預(yù)雜交2-3小時，換以雜交液(預(yù)雜交液+變性的32P標(biāo)記的探針)，68℃雜交過夜。依次在2×SSC,0.5％SDS中于室溫洗5分鐘；2×SSC,0.1％SDS中于室溫洗15分鐘；0.1×SSC 0.5％SDS中于68℃洗60分鐘。吸干膜上水分，用塑料紙包好膜，壓片自顯影。結(jié)果如圖5所示，兩部分基因組DNA均有三條雜交條帶，大小分別為6、8、10kb，表明熒光素酶基因與核酶基因均是多拷貝地整合在家蠶染色體上。
實施例5轉(zhuǎn)基因蠶中目的基因的表達1、對不同齡期家蠶熒光素酶表達活性進行了分析。
將不同齡期的家蠶稱取0.1克后投入液氮中，2分鐘后取出用研缽碾碎，加入100μl細胞提取液，離心后取上清檢測，每50μl上清加入10μl熒光素酶底物，測定熒光光子數(shù)。比較不同齡期家蠶的熒光素酶表達活性。結(jié)果表明，隨著家蠶的發(fā)育，熒光素酶活性逐漸升高，并在五齡第二天達到高峰。
2、對不同組織中熒光素酶活性進行了檢測。
將從五齡第二天家蠶中分離的絲腺、中腸、皮膚、脂肪和血液均按上述方法加以處理，測定不同組織中的熒光素酶表達活性。結(jié)果表明中腸中的熒光素酶活性最高，血液次之，其余組織中熒光素酶的活性很低。
權(quán)利要求
1.一種篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法，其特征在于它是利用核酶的抗病毒作用篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法，其特征在于該方法的步驟包括(1)構(gòu)建表達目的基因與作為篩選基因的抗病毒核酶基因的重組質(zhì)粒；(2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入蠶受精卵內(nèi)；(3)用病毒攻擊來篩選轉(zhuǎn)基因的個體；(4)通過幾代篩選結(jié)合基因鑒定得到轉(zhuǎn)基因系；(5)測定目的基因在轉(zhuǎn)基因蠶中的表達。
3.如權(quán)利要求2所述的篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法，其特征在于所述作為篩選基因的抗病毒核酶基因是抗核多角體病毒的核酶基因。
4.如權(quán)利要求2所述的篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法，其特征在于是用電穿孔方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入蠶受精卵內(nèi)。
全文摘要
一種新的篩選轉(zhuǎn)基因蠶的方法。即用抗病毒的核酶作為篩選基因與目的基因(用熒光素酶基因作代表)一起導(dǎo)入蠶卵,用病毒攻擊的方法篩選轉(zhuǎn)基因的個體,經(jīng)過幾代篩選得到轉(zhuǎn)基因蠶。雜交證明熒光素酶基因與核酶基因整合在蠶染色體中,此轉(zhuǎn)基因蠶能抗NPV攻擊且表達熒光素酶。該篩選方法不僅能有效地篩選出轉(zhuǎn)基因蠶,而且由于用核酶作篩選基因,除目的基因外不表達其他蛋白質(zhì),簡化了分離純化,作食物也不存在不安全問題。
文檔編號C12N15/63GK1318289SQ0011539
公開日2001年10月24日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月14日
發(fā)明者陸長德 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所