專利名稱：一種大片段dna制備乳腺生物反應(yīng)器新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和藥物領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及制備乳腺生物反應(yīng)器的制備方法，尤其是用大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的方法。
乳腺生物反應(yīng)器制藥是80年代末90年代初興起的新興技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)原理是將人藥用蛋白基因轉(zhuǎn)入乳用家畜體內(nèi)，藥用蛋白在家畜乳腺中表達(dá)，進(jìn)而在乳汁中提取蛋白。與細(xì)菌表達(dá)重組蛋白及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)方法相比，該方法有明顯優(yōu)勢(shì)，例如生產(chǎn)的蛋白不但可以表達(dá)較大的蛋白，以復(fù)雜的糖基化進(jìn)行修飾，產(chǎn)生正常的生理活性，而且產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，因而此技術(shù)有著廣闊的市場(chǎng)前景。
自90年以來(lái)乳腺生物反應(yīng)器先后成功表達(dá)了抗胰蛋白酶，纖溶酶原，凝血因子九，血漿白蛋白等藥用蛋白，并打入了藥品市場(chǎng)，現(xiàn)在每年產(chǎn)值近十億美元。
但是隨著該技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，一些技術(shù)難題漸漸顯現(xiàn)出來(lái)。其中最突出的是轉(zhuǎn)基因表達(dá)的位點(diǎn)效應(yīng)，即轉(zhuǎn)基因在基因組中隨機(jī)整合，但只有整合在活化的染色質(zhì)區(qū)才能表達(dá)；這樣只有10-20％的轉(zhuǎn)基因整合動(dòng)物的才會(huì)不同程度的表達(dá)目標(biāo)蛋白，而且表達(dá)量相差顯著，這就大大提高了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成本，使得該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化困難。
為了克服位點(diǎn)效應(yīng)各國(guó)科學(xué)家作了多年的研究，發(fā)現(xiàn)乳蛋白基因的5′和3′調(diào)控區(qū)遠(yuǎn)端存在基因座控制區(qū)(locus control region，簡(jiǎn)稱為“LCR”)或基質(zhì)附著區(qū)(matrix attachment region，簡(jiǎn)稱為“MAR”)[Jew P cell 1992][Kioussis.D,Curr Opin Genet Develop 1997][Blackwood,Science 1998]，這些序列的存在可以克服轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的位點(diǎn)效應(yīng)。但是乳蛋白的LCR序列大多位于基因上下游的幾十KB的范圍內(nèi)，如果用質(zhì)粒來(lái)克隆如此大的DNA片段是不可能的，因?yàn)橘|(zhì)粒的克隆能力在15KB以內(nèi)。
以YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)和P1人工染色體技術(shù)為代表的大片段DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，提供解決了這一難題的可能。這些載體可以克隆長(zhǎng)達(dá)幾百KB的DNA片段，可以一次克隆下乳蛋白基因的上下游遠(yuǎn)端幾十KB的調(diào)控序列。實(shí)驗(yàn)已表明用BAC、YAC載體構(gòu)建的大片段DNA消除了轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的位點(diǎn)效應(yīng)，而且明顯體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)與目標(biāo)蛋白表達(dá)的正相關(guān)性，轉(zhuǎn)基因整合的拷貝數(shù)越多，表達(dá)量越高[Keneth,PNAS 1993]。這些載體不僅克隆能力很強(qiáng)，而且在細(xì)菌中和酵母內(nèi)的同源重組率高[Xiangdong W,Nature Biotechnology 1997]，因而對(duì)BAC、YAC分子同源重組改造方便，可以向YAC中重組引入篩選標(biāo)志，酶切位點(diǎn)等，并可以將目標(biāo)蛋白基因轉(zhuǎn)入YAC轉(zhuǎn)基因載體中或突變YAC中的基因，酵母中成熟的分子克隆技術(shù)促進(jìn)了YAC載體在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的應(yīng)用。
近年來(lái)，大片段DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，從大基因組基因的功能研究到建立疾病模型都有應(yīng)用例[Keneth PNAS 1993]。在90年代中后期大片段DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)漸漸應(yīng)用起來(lái)。
97年-99年日本科學(xué)家Y.Fujiwara等第一次將YAC載體引入乳腺生物反應(yīng)器的研究中，97年用含乳清白蛋白基因的YAC DNA(210KB)轉(zhuǎn)基因，得到了乳清白蛋白表達(dá)量高達(dá)2-3ml/ml。98年又進(jìn)一步對(duì)YAC進(jìn)行酵母內(nèi)同源重組，成功地完成了重組YAC DNA的轉(zhuǎn)基因。目標(biāo)蛋白生長(zhǎng)激素的表達(dá)量可達(dá)0.8mg/ml。
1999年法國(guó)的Marie-Georges研究組成功應(yīng)用了170KB的BAC DNA乳腺表達(dá)了羊乳清白蛋白，表達(dá)量可達(dá)0.8-1mg/ml。
Y.Fujiwara和Marie-Georges的成功提示大片段DNA轉(zhuǎn)基因在乳腺生物反應(yīng)器領(lǐng)域的應(yīng)用將領(lǐng)導(dǎo)乳腺制藥領(lǐng)域的技術(shù)潮流。應(yīng)用該技術(shù)有利于基因表達(dá)調(diào)控的進(jìn)一步深入研究；揭示基因基因定位高效表達(dá)的分子機(jī)理；促進(jìn)乳腺制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
然而，目前的大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)仍存在一些缺點(diǎn)，如由于大片段DNA轉(zhuǎn)基因構(gòu)建過(guò)程的復(fù)雜性和操作過(guò)程的難度大，所以目前世界上還只有兩三個(gè)實(shí)驗(yàn)室作該領(lǐng)域工作；而且只能表達(dá)一些長(zhǎng)度在10kb以內(nèi)較小的目的基因；還只能應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，還沒(méi)有該技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物的先例。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的用大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的方法，該方法具有至少如下一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)1．簡(jiǎn)化了大片段DNA轉(zhuǎn)基因構(gòu)建方法，使其程式化，促進(jìn)了在乳腺制藥工業(yè)的應(yīng)用。
2．將酵母內(nèi)YAC嵌合技術(shù)引入大片段DNA轉(zhuǎn)基因構(gòu)建方法，使得可以表達(dá)長(zhǎng)度10kb-200kb的目的基因的基因組基因，擴(kuò)展了大片段DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用范圍。
3．首次應(yīng)用大片段DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因乳山羊。
本發(fā)明提供了一種用大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的方法，它包括步驟制備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA，其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá)；用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內(nèi)，移植到代孕山羊體內(nèi)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的山羊，大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該目的基因編碼乳鐵蛋白，而且將含乳蛋白基因的大片段直接用于轉(zhuǎn)基因。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該大片段DNA通過(guò)酵母內(nèi)同源重組的方法進(jìn)行改造，從而在該大片段DNA中乳蛋白基因的調(diào)控序列位于目的基因的兩側(cè)并指導(dǎo)目的基因的表達(dá)。一種酵母內(nèi)同源重組的方法改造大片段DNA的具體程序包括步驟用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法調(diào)取乳蛋白基因上下游各一段300-1500bp調(diào)控序列作為同源臂，兩者之間插入要表達(dá)的目的基因構(gòu)建成打靶載體。較佳地，還包括步驟將所述的打靶載體，與含有乳蛋白基因大片段上下游序列及基因自身的完整編碼序列的大分子YAC、BAC、P1克隆進(jìn)行酵母內(nèi)重組，從而將目的基因插入在乳蛋白基因的大片段調(diào)控序列下。
在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，大片段DNA可包括長(zhǎng)度為5-200kb的含目的基因的基因組序列，和位于所述基因組序列兩側(cè)并指導(dǎo)目的基因表達(dá)的長(zhǎng)度為50-200KB的乳蛋白基因的調(diào)控序列。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，所述的乳蛋白基因的調(diào)控序列指乳蛋白基因編碼區(qū)的5′和3′序列，通常包括如下控制乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄的核心序列如TATA盒、GC盒，遠(yuǎn)端基因座控制區(qū)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述的大片段DNA是用酵母內(nèi)YAC嵌合方法制備的。一種具體的用酵母內(nèi)YAC嵌合方法制備大片段DNA的程序包括步驟制備乳腺定位表達(dá)ALA的表達(dá)載體和含目的基因的基因組序列的表達(dá)載體；用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法調(diào)取乳蛋白基因上下游各一小段調(diào)控序列(300-1500bp，較佳地500-1000bp)，和目的基因的頭尾各一小段序列(500-1000bp，較佳地300-1500bp)，用同源重組方式將所述的乳蛋白基因上下游各一小段調(diào)控序列分別插入所述目的基因的頭尾各一段序列的上下游，形成兩個(gè)嵌合載體；嵌合載體與所述的含目的基因的基因組序列的表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，形成目的基因嵌合載體，其中所述的乳蛋白基因上下游各一小段調(diào)控序列位于目的基因的兩側(cè)；將目的基因嵌合載體與乳腺定位表達(dá)乳蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入同一酵母中，兩者重組形成嵌合分子，其中該嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指導(dǎo)目的基因的基因組序列的表達(dá)。
在附圖中，


圖1顯示了含HLF目的基因的大片段DNA，其中在上方標(biāo)出了各酶切位點(diǎn)。
圖2顯示了載體RS-ALA-IL的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示了用酵母同源重組方法制備含IL-11目的基因大片段DNA的過(guò)程。
圖4顯示了載體RS-ALA-IL與含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之間的同源重組，從而獲得含IL-11目的基因和ALA調(diào)控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
圖5顯示了載體RS-FIX2的結(jié)構(gòu)。
圖6顯示了載體RS-FIX1的結(jié)構(gòu)。
圖7顯示了用載體RS-ALA-IL與含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之間的同源重組，從而獲得含IL-11目的基因和ALA調(diào)控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
在本發(fā)明中，“大片段DNA”指長(zhǎng)度大于50kb，較佳地大于100kb，更佳地大于150kb的DNA分子。
適用于本發(fā)明的動(dòng)物包括常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物，尤其是用于畜牧業(yè)和產(chǎn)奶業(yè)的哺乳動(dòng)物，例如牛和羊。更佳地該動(dòng)物是羊，例如莎能乳山羊、波爾羊、普通山羊。
由于本發(fā)明方法具有通用型，因此，適用于本發(fā)明方法的目的基因沒(méi)有特別限制，例如在本發(fā)明的3個(gè)實(shí)施例中就選用了HLF、IL-11、FIX3中不同的蛋白。至于獲得目的基因的途徑，一種較方便的方法就是通過(guò)市售的各種YAC克隆，或者通過(guò)用常規(guī)方法構(gòu)成的YAC克隆，采用PCR法和酶切的方法獲得含目的基因的DNA片段，尤其是基因組片段。
在本發(fā)明中，通常采用YAC和BAC作為轉(zhuǎn)基因載體，由于YAC有著平均700kb、BAC有著200KB左右的DNA裝載能力，因而可以容納人或哺乳動(dòng)物的乳蛋白基因的大片段上下游序列。
更佳地，采用YAC作為轉(zhuǎn)基因載體。與目前大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物采用的質(zhì)粒載體相比，用YAC DNA作為轉(zhuǎn)基因構(gòu)建，有明顯的優(yōu)越性。
1、可以克服整合位點(diǎn)效應(yīng)。
采用質(zhì)粒上的小片段轉(zhuǎn)基因構(gòu)建時(shí)，由于質(zhì)粒的DNA裝載能力有限(只有20kb之內(nèi))，只能克隆較短的乳腺表達(dá)啟動(dòng)序列，這樣轉(zhuǎn)基因構(gòu)建必須整合到轉(zhuǎn)錄活性高的基因組部位，才能得到較高表達(dá)，但是整合是隨機(jī)的，這樣生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的目的基因產(chǎn)物表達(dá)量就很不均一，有的不表達(dá)，有的低表達(dá)，只有極少數(shù)較高表達(dá)。
相反，用YAC載體的大片段轉(zhuǎn)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因時(shí)，由于含有足夠的上下游調(diào)控序列，因而無(wú)論整合在基因組何處，轉(zhuǎn)基因本身序列有形成局部轉(zhuǎn)錄活性單元的能力，這就克服了整合位點(diǎn)效應(yīng)，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)量穩(wěn)定。
2、提高表達(dá)量，穩(wěn)定高效表達(dá)。
許多例子表明，蛋白質(zhì)乳腺表達(dá)時(shí)采用目標(biāo)蛋白基因組DNA(gDNA)的表達(dá)量明顯高于mRNA的表達(dá)量。但在質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)基因時(shí)，對(duì)于gDNA稍大的蛋白(10KB以上)往往只能采用該基因的mRNA了。與此相比，YAC載體不僅可以得到足夠長(zhǎng)度的調(diào)控序列，而且應(yīng)用YAC嵌合和同源重組技術(shù)可以克隆很長(zhǎng)的目標(biāo)蛋白gDNA用于乳腺表達(dá)。
一般來(lái)說(shuō)，采用YAC大片段DNA轉(zhuǎn)基因時(shí)，基因的表達(dá)水平與體內(nèi)的同源基因表達(dá)水平相當(dāng)，這對(duì)于乳腺制藥工業(yè)中在乳腺中大量表達(dá)外源目的基因的目標(biāo)來(lái)說(shuō)，YAC轉(zhuǎn)基因有很好的應(yīng)用前景，質(zhì)粒載體的大片段DNA表達(dá)量都要比體內(nèi)同源基因的水平低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。
3、可以克服異位表達(dá)。
乳腺特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因在乳腺以外的表達(dá)，叫作異位表達(dá)。乳腺中表達(dá)的外源基因產(chǎn)物常常在肝、腎等臟器也有微量的表達(dá)，這嚴(yán)重地影響了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身的健康。而采用YAC載體調(diào)取大片段的調(diào)控序列則可嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性和發(fā)育表達(dá)的時(shí)序性，從而克服異位表達(dá)。
綜上所述，采用大片段DNA轉(zhuǎn)基因可以大大提高乳腺制藥過(guò)程中的成功率，對(duì)于降低成本，穩(wěn)定質(zhì)量具有深遠(yuǎn)的推動(dòng)作用。
在本發(fā)明中，構(gòu)建乳腺表達(dá)載體時(shí)通常有三種方式1、對(duì)于含有乳蛋白調(diào)控序列的目的基因(如人乳蛋白基因)，可以直接制備含人乳蛋白基因的大片段DNA，并以原核注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊。
該方式的優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大片段DNA簡(jiǎn)單，而且目的產(chǎn)物表達(dá)量高。
2、利用同源重組方法，改造乳蛋白基因的大片段DNA，將外源基因(如珍貴的藥用蛋白基因)重組入大片段DNA上，使其位于乳腺表達(dá)基因的上下游調(diào)控序列下，受其調(diào)控。
該方式的優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大片段DNA周期短。
3、利用YAC嵌合方法，將含目的基因的克隆和乳蛋白基因的YAC克隆轉(zhuǎn)入同一酵母中，兩者重組形成嵌合YAC分子，其中嵌合YAC分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指導(dǎo)目的基因大分子基因組基因的表達(dá)。
該方式的優(yōu)點(diǎn)是適用性強(qiáng)，以此方法可以表達(dá)幾乎所有的目的基因。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，其中實(shí)施例1、2、和3分別對(duì)應(yīng)上述的三種制備乳腺表達(dá)載體的方式。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人乳鐵蛋白(HLF)乳腺轉(zhuǎn)基因構(gòu)建人乳鐵蛋白(HLF)乳腺表達(dá)載體構(gòu)建人HLF是在人乳腺中特異性高表達(dá)量蛋白，在人乳中的表達(dá)量可達(dá)1.4克/毫升乳汁，所以其基因本身的啟動(dòng)子即可指導(dǎo)HLF的高效定位表達(dá)，為此用PCR調(diào)取了該基因的YAC克隆，并進(jìn)行了稀少酶切分析，確定該YAC株中含有80kb和120kb的啟動(dòng)序列和下游調(diào)控序列。直接用于乳腺表達(dá)。
一、實(shí)驗(yàn)材料人基因組CHEF YAC文庫(kù)(上海市第二醫(yī)科大學(xué)血研所陳竺院士惠贈(zèng))，脈沖場(chǎng)電泳儀CHEF-Ⅱ，超濾器(Millipore UTK00)，核酸內(nèi)切酶，Taq酶及瓊脂糖酶購(gòu)自Promega公司。
P32CTP同位素標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Promega公司。
二、構(gòu)建過(guò)程1、用PCR和Southern印跡法來(lái)調(diào)取并驗(yàn)證含有人HLF基因的YAC株。
用PCR方法篩選含HLF基因的YAC分子。其中PCR程序?yàn)?5℃5分鐘，94℃30秒，55℃40秒35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。引物為Primer HLF(引物HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′〕，篩人基因組YAC文庫(kù)。經(jīng)多輪篩選得到了含HLF基因克隆YAC克隆Y-HLF。進(jìn)一步的Southern印跡結(jié)果表明該YAC分子為410KB。
2、含HLF的YAC克隆進(jìn)一步酶切分析和HLF基因的定位。
用低熔點(diǎn)瓊脂糖法制備HLF克隆的染色體包塊，分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ,NotⅠ,NruⅠ,MluⅠ和BssHⅡ部分酶切，轉(zhuǎn)膜。pBR322質(zhì)粒用BamHⅠ和PvuⅡ酶切，回收1.2KB的YAC分子左臂序列，以α32P標(biāo)記后與上膜雜交，進(jìn)而得到該克隆的稀有酶切圖譜。以此為基礎(chǔ)，以α32P標(biāo)記引物對(duì)HLF的PCR產(chǎn)物與上膜雜交，確定了HLF基因在該YAC分子的中部，上下游各有100KB和180KB的調(diào)控序列(
圖1)。
3、Y-HLF分子的純化①染色體包塊制備挑取YAC單克隆接種10ml的AHC培養(yǎng)基中，30℃通氣培養(yǎng)過(guò)夜。1500rpm離心5分鐘收集酵母，用10ml 50mM EDTA以同條件離心洗滌兩次，總酵母體積調(diào)整到200ul。加100u的lyticase 20ul，混勻，再加200ul 37℃的融化的2％低熔點(diǎn)瓊脂糖，混勻后灌入模板制成包塊。加入原生質(zhì)球制備液中(50mM EDTA,3％巰基乙醇)，37℃過(guò)夜。更換裂解液(50mM EDTA,100ul/ml蛋白酶k)消化24小時(shí)。
②Y-HLF分子的純化用含YAC分子的酵母染色體包塊，跑脈沖場(chǎng)電泳膠采用1％的超低溶點(diǎn)瓊脂糖。在經(jīng)染色觀察后，切取YAC條帶，在65攝氏度水浴5分鐘，之后加入瓊脂糖酶和其25倍的緩沖液，42攝氏度消化2小時(shí)。
用截?cái)喾肿恿繛?0000的超濾器來(lái)濃縮YAC分子，達(dá)到2ug/ml的濃度，再用注射緩沖液(Tris-Cl,pH8.0,NaCl 100mM,EDTA 0.025mM)，透析4小時(shí)，此時(shí)制備的YAC分子即可用于顯微注射來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
③轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備A、顯微注射將上述純化后的YAC分子，通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入到莎能奶山羊受精卵雄原核內(nèi)，再移植到同步發(fā)情的受體山羊輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。山羊超排、注射、移植以及產(chǎn)仔等試驗(yàn)結(jié)果如下B、轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應(yīng)用PCR的方法(參見(jiàn)“二、構(gòu)建過(guò)程1”，引物是HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的整合檢測(cè)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因的整合率為20％(10/50),PCR+Southern試驗(yàn)證實(shí)了基因的整合。
C、表達(dá)檢測(cè)將性成熟的轉(zhuǎn)基因羊通過(guò)人工催乳，應(yīng)用Western方法檢測(cè)其乳汁中目的蛋白。結(jié)果表明其中有人乳鐵蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例2Y-ALA-IL-11轉(zhuǎn)基因YAC DNA的構(gòu)建在該實(shí)施例中，應(yīng)用同源重組的方法將人白介素IL-11基因重組入含人乳清白蛋白(ALA)基因的YAC中，從而受到ALA基因的啟動(dòng)子和下游調(diào)控序列的控制(圖3)。
一、實(shí)驗(yàn)材料Y-ALA為含有ALA基因的YAC分子(上海市第二醫(yī)科大學(xué)血研所陳竺院士惠贈(zèng))，穿梭載體RS403(帶His 3篩選基因)購(gòu)自Stratagene公司。IL-11基因組基因克隆(由本研究中心篩庫(kù)獲得)。
引物ALA1:5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′ALA2:5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′。
A-I3:5′GCTCCTGGGCTCAAGTG 3′5′CTTTAACCCTTCCCTGTCC 3′A-I4:5′TGACTGTGTATTTTGCATGAC 3′5′TTCAAGAATTCGGTGATGTC 3′二、構(gòu)建過(guò)程(調(diào)取ALA基因的上下游同源臂結(jié)構(gòu))1、構(gòu)建酵母內(nèi)穿梭重組載體PRS-ALA。
通過(guò)PCR反應(yīng)，分別用引物對(duì)ALA1和引物對(duì)ALA2從人基因組DNA中克隆人ALA基因的上下游各700和900bp的ALA-up和ALA-down片段。PCR循環(huán)的條件與擴(kuò)增出的ALA-up和ALA-down片段經(jīng)ApaⅠ+XhoⅠ酶切和EcoRⅠ+SmaⅠ酶切后與酶切后的PRS403載體相連接，形成PRS-ALA載體。
2、將人IL-11基因重組入Y-ALA上，形成表達(dá)IL-11乳腺表達(dá)載體將含有IL-11基因DNA用BamHⅠ和NotⅠ酶切，收取6.0kb的IL-11基因編碼區(qū)(帶有全部外顯子和內(nèi)含子，但不含有其調(diào)控序列)，克隆入PRS-ALA中的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成RS-ALA-IL(圖2)。該載體中AlA-up片段的3′末端位于ALA基因轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)下游25bp處。ALA-down片段的5′位于ALA基因的第四個(gè)外顯子上。
以下為ALA-up,ALA-down和IL-11的測(cè)序結(jié)果，其中粗體為外顯子，正常為內(nèi)含子。ALA-up序列(SEQ ID NO:1)-GTGCCTGGCCTAGATGCTTTCATACAGGCTTTTCAATTATGCATTTTCCTTAAGTAGGAAGTCTTAAGATCCAAGTTATATCGGATTGTTGTAGTCTACGTTCCCATATTCTATTCCTATTTCTGAGCCTTCAGTCATGAGCTACCATATTAAAGAACTAATTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTTGGACAAGTGCCAGCTCTGATCCTGGGACTGTGGCATGTGATGACATACACCCCCTCTCCACATTCTGCATGTCTCTAGGGGGGAAGGGGGAAGCTCGGTATAGAACCTTTATTGTATTTTCTGATTGCCTCACTTCTTATATTGCCCCCATGCCCTTCTTTGTTCCTCAAGTAACCAGAGACAGTGCTTCCCAGAACCAACCCTACAAGAAACAAAGGGCTAAACAAAGCCAAATGGGAAGCAGGATCATGGTTTGAACTCTTTCTGGCCAGAGAACAATACCTGCTATGGACTAGATACTGGGAGAGGGAAAGGAAAAGTAGGGTGAATTATGGAAGGAAGCTGGCAGGCTCAGCGTTTCTGTCTTGGCATGACCAGTCTCTCTTCATTCTCTTCCTAGATGTAGGGCTTGGTACCAGAGCCCCTGAGGCTTTCTGCATGAATATAAATAAATGAAACTGAGTGATGCTTCCATTTCAGGTTCTTGGGGGTAGCCAAA-------以下接IL-11基因ALA5′UTR------IL-11基因(SEQ ID NO:2)-ATGCCTCCCCTCCCCAGCCGCGGGCCCAGCTGACCCTCGGGGCTCCCCCGGCAGCGGACAGGGAAGGGTTAAAGGCCCCCGGCTCCCTGCCCCCTGCCCTGGGGAACCCCTGGCCCTGTGGGGACATGAACTGTAAGTTGGTTCATGGGGAGGGTGGAGGGGACAGGGAGGCAGGGAGGAGAGGGACCCACGGCGGGGGTGGGAGCAGACCCCGCTGAGTCGCACAGAGAGGGACCCGGAGACAGGCAGCCGGGGAGGAGAGCAGCTTCGGAGACAGGAGGCGGCGGAGGAGATGGGCAGAGAGAGACACAGACAGGAGCGGATGGAGGCAGCCAATCAGAGGCGCCGCAGGAGGGACGGGCCAGACAGGGCCCGAGAGGAGCGAGACGCGAGACCGAGCAGGGGCAGGGACGCAGGGACTGGTGCCGGGAGGGAGGTGACCCCCATCGACCCAGGCCCCAGGGAGCCCGCGGGGACCGGGAGACTCCCTGGGATTCCGGCAGAGAGGCTCCGGAGGGAAACTGAGGCAGGGTCCGCGGAGAGCGGAGCAAGCCAGGGAGTAGCGACCCCAGCCGGGGGGAGGAGAGAGACTGGGCGCCGGGGGAAAGCGGGGAGAGCCGGGCAGATGCGGCCGACGGAGGCGCGGACAGACCGACGGCTGGCGGGCCCGGGGGGCGGGCTGGGGGTGTGCGAGGCGCGGGCGGCCGGGGAGCGCTGATTGGCTGGCGGGTGGCCGGGTGGGCGGGGCGGCCGGGGTGGGCTGCGGGGAGCGAGCTCCGGACCCCCGCGCCCCCGGCGCCCCCCGCGCCCCCCGCCGCCAGCTCTCCCGCTCCCGGCGCCCGGCCGGGCCATGGCTCTGCCCCTCTCCGCCCAGGTGCGCTGCGGCCCGGGCTTCTGCCGCCCACCCGGCGGGCTCCTGGGAGGGCGTCTAAGGGGTCTCCCGTGGGAGAGGTCCGTGTCTCCCGGACTCCGTCCTGGGCTTTTGGCTCCTTCCCCTGCTCCCAGCCAGCTCGGGCTCCCGCGGCCCGGGGAGGGGGCAGGTTCTGGCCTGTGCCTCCCCCACCATCCGCGCCCCGGGGCCCAGATTCCGGCGTCCGGGGGCGGACGGGAGACGCCCGGGCCGCGTCTGCTCCGACGGGCGGGGCAGCCAGAGCCAGGGAGGGAGAGGGAAGCCCGCCTGGCCCTGCGACCTGCCCGCGGGCGTTCCACCCTGGGACTTAAGACCTCCAGCTCCATCCTCCCTAAGGCCGGGAGTCCAGGCCCCAGACCCTCCTCCCCGAGACCCAGGAGTCCAGACCCCAGGCCTTCCTCCCTCAGACCTAGGAGTCCAGGCCCCCAGCCTCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGGAGTCCAGACCCCAGTTCCTCCTCCCTCAGACCCGGGAGTCCAGCCCAGGCCCTCCTCTCTCAGACCCGGAGTCCAGCCTGAGCTCTCTGCCTTATCCTGCCCCCAGGCCTGTGGCCAGATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCGAGTTTCCCCAGACCCTCGGGCCGAGCTGGACAGCACCGTGCTCCTGACCCGCTCTCTCCTGGCGGACACGCGGCAGCTGGCTGCACAGCTGCGGAGAGGAGTCTGCGGGCAGCCACTTGGAGGGGTTCTGGGCTCTCAGGTGGCAGAGTGAGGGAGGGGAAGAGTTGGGGGCCTGGCGTGGGGGATGGAGGGAGCCCCGAGGCTGGGCAGGGGCCACCTCACAGCTTTTTTCCCTGCCAGCCCTGCCCACCCTGGCCATGAGTGCAGGGGCACTGGGAGCTCTACAGGTAAGGGCAAGGGAGTGGGCTGGGGACAAGGTGGGAGGCAGGCAGTGAAGGGGGCGGGGAGGATGAGGGGCACTGGTCGGGTGTTCTCTGATGTCCCGGCTCTATCCCCAGGCTGCGAGCGGACCTACTGTCCTACCTGCGGCACGTGCAGTGGCTGCGCCGGGCAGGTGGCTCTTCCCTGAAGACCCTGGAGCCCGAGCTGGGCACCCTGCAGGCCCGACTGGACCGGCTGCTGCGCCGGCTGCAGCTCCTGGTATGTCCTGGCCCCAAGACCTGACACCCCAGACCCCCACCCCTGGCCCCAAAATCCTGTGGCCTGAGTCCTTGAAGCCTGAGACCCCAGACCCGAGTGCAACAGCCCCGCTCTGAGACCCTGACACCCTAACAGCCCGCTCTGAGACCCTGACACCGTAACAGCCCCGCTCTGAGACCCTGACCCTAACAGTCCTGCTCTGAGACCCTGACCCTGCAGTCCCAAGATCCTGTGGCCCTGAGACCCTGAGGCCCTAGACCCCCAAATCCTGCCCAGAAACTTCAAATTCTCACCCAAGACCCTGAGACTCCATCATCCATGACCTCAAAGTCCCCAGATCCCAGCCCCTAAGACCCAAGACCCCATCCTGAAGCCCAAAGCCTTGAGAATTCAAATCCTCACCTCAAGACTTGGAGACCCTGGCCCCATGACATTGAAAACCATGGACCTGGCCAGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAAGTGGATCACCTGAGGTCGGGAGTTCAAGACCAGCCAGACCAACATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCATTACACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCAAAACTCCCTCTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGGAAAAGAAAACCATGGACCTCCAGACCCTGAGACCCCAGGCCCCAGCCCTGAGATCCTGACATCTTAAAGATCCCAGGCCCTAAGATACAAGACCTTGACCCAAAGCCAGCCTTGGGACCCTGGCTGTACAAACCCAAGACCTCCAGGACCTAGACCCCGAGCCCTGAGGCCCTATGTCTCACTCCCAACATCGAAAACCCTGACACCTCAGATCCTGAGCCTGCGCCTGTACGACTCCAAGACCCTCACTTCCAAAGCCAGGCCCAAAGCCCTGAGACCAGAAGACTTCAAACCCTGGTTCTTGGGCCTAACTCCAAAGACCCTGGATCTCAAATTCCAACTTCTAGCTCTGAGACTCCAGCCCTCACCCATGAGTTCCTGAACTTGAACCCAGAGACCCCATCTCTAAGACTTCAGCCTTGAGATCCAGGGCCTGACCCTAGACTCGAGCCCACAGACCTCAGATACTGTCTGTAAAACCCCAGCTCTGGTGGGGAGCAGTGGCTCACTCCTGTAATCCCAAGGCAGGGGAGGCCAAGGCAGAAGGACCTCTTGAGGCCATGAGTTTGAGACAGCCTGGGCAGCATAGCAAGACTCTGTTTCTTAATTATTATTATTATTATTATTTTTTGGAGACAGAGTCTCGCGCTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTGCAATGGTGCCATTTCGGCTTGCTGGAACCTCCGCCTCCTGGGCTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTTCAGGTGCACACTGCCACACCCGGATAATTTTTTTGTATTTTAGTAGACACAGGGTTTCACCGTGTTGCCCAGGCTGGTCACAAACTCCTGAGCTCAGGCCATCCGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGCGCTGGGATAACAGGCGTGACGCCGCGCCTGGCTTCTTAATTGTTCTAACAGCAGCGACAACAACAAAAACCCAGCTCTGAGATTCCAGCCCCGGCGACTCTAACAGTCCCAGGCCCGATCCCTCACCTAGAACCGAGATGCCAGCCCTGACTCCACAGACTTCACCCCCAACCCCCACACTCAGCTCTGGAAGCCCGTCCTGACTCCAGCCTCCATTTTCGGAACCCCACAGCCTGAAGAGCTCCCGGCCTAAACACTTCACCCCACGCGCCACAGTCCCCCTGTGAATATGCAGCCCCGATTCAGCTGCAGCTCCACAGCACCCCTGCCCTGCACCCCCGCTGCACCCCCTACCTGTGACTCACCTCTCTCCTCTCCCCACAGATGTCCCGCCTGGCCCTGCCCCAGCCACCCCCGGACCCGCCGGCGCCCCCGCTGGCGCCCCCCTCCTCAGCCTGGGGGGGCATCAGGGCCGCCCACGCCATCCTGGGGGGGCTGCACCTGACACTTGACTGGGCCGTGAGGGGACTGCTGCTGCTGAAGACTCGGCTGTGACCCGGGGCCCAAAGCCACCACCGTCCTTCCAAAGCCAGATCTTATTTATTTATTTATTTCAGTACTGGGGGCGAAACAGCCAGGTGATCCCCCCGCCATTATCTCCCCCTAGTTAGAGACAGTCCTTCCGTGAGGCCTGGGGGGCATCTGTGCCTTATTTATACTTATTTATTTCAGGAGCAGGGGTGGGAGGCAGGTGGACTCCTGGGTCCCCGAGGAGGAGGGGACTGGGGTCCCGGATTCTTGGGTCTCCAAGAAGTCTGTCCACAGACTTCTGCCCTGGCTCTTCCCCATCTAGGCCTGGGCAGGAACATATATTATTTATTTAAGCAATTACTTTTCATGTTGGGGTGGGGACGGAGGGGAAAGGGAAGCCTGGGTTTTTGTACAAAAATGTGAGAAACCTTTGTGAGACAGAGAACAGGGAATTAAATGTGTCATACATATCCACTTGAGGGCGATTTGTCTGAGAGCTGGGGCTGGATGCTTGGGTAACTGGGGCAGGGCAGGTGGAGGGGAGACCTCCATTCAGGTGGAGGTCCCGAGTGGGCGGGGCAGCGACTGGGAGATGGGTCGGTCACCCAGACAGCTCTGTGGAGGCAGGGTCTGAGCCTTGCCTGGGGCCCCGCACTGCATAGGGCCGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTCTCGCTCTGTTGCCTAGGCTGGAGTGCAGTGAGGCAATCTAAGGTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGATTAGCTGGGATCACAGGTGTGCACCACCATGCCCAGCTAATTATTTATTTCTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTTTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCACACCTGACCCATAGGTCTTCAATAAATATTTAATGGAAGGTTCCACAAGTCACCCTGTGATCAACAGTACCCGTATGGGACAAAGCTGCAAGGTCAAGATGGTTCATTATGGCTGTGTTCACCATAGCAAACTGGAAACAATCTAGATATCCAACAGTGAGGGTTAAGCAACATGGTGCATCTGTGGATAGAACGCCACCCAGCCGCCCGGAGCAGGGACTGTCATTCAGGGAGGCTAAGGAGAGAGGCTTGCTTGGGATATAGAAAGATATCCTGACATTGGCCAGGCATGGTGGCTCACGCCTGTAATCCTGGCACTTTGGGAGGACGAAGCGAGTGGATCACTGAAGTCCAAGAGTTTGAGACCGGCCTGCGAGACATGGCAAAACCCTGTCTCAAAAAAGAAAGAATGATGTCCTGACATGAAACAGCAGGCTACAAAACCACTGCATGCTGTGATCCCAATTTTGTGTTTTTCTTTCTATATATGGATTAAAACAAAAATCCTAAAGGGAAATACGCCAAAATGTTGACAATGACTGTCTCCAGGTCAAAGGAGAGAGGTGGGATTGTGGGTGACTTTTAATGTGTATGATTGTCTGTATTTTACAGAATTTCTGCCATGACTGTGTATTTTGCATGACACATTTTAAAAATAATAAACACTATTTTTAGAATAACAGAATATCAGCCTCCTCCTCTCCAAAAATAAGCCCTCAGGAGGGGACAAAGTTGACCGCTGATTGAGCCTGTCAGGGCTGTGCAC-----以下接ALA-downALA-down(SEQ ID NO:3)ATCCCAGGGAAATGAAGGAAGTCCCTACCCAGGGTTAGACATTACCACATTGGTCCTTTCATATAGAAAGACAACAGGCACAAGCCTTGAGTTTAGAGAACCCACTGGATCCAGGGGTTAGGGGAACTCAGTGCCTTTCTGGGTAATACTTGTCAGCTGTCTCAATCCTTTCCCTGTAACTCCTGCCAGAGTTCCTGGATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGAATTGACTACTGTACTGGTGAATCCTTATTCTATTTTCTATTTCCCCATCCTCCTTCTCCTTACCCCATTAGCCCAGCACCCCTTTCCTCTTACCCTATCTCTTGGTCATTTAATCTAGAATACAGTGTCTGAAACAAAGCTTACCTAGAGACTCAGGTTTCTGTTATTAAGCCTCTCTCGCTCCGCTCCTTGGTAGCAATTTTCCTAATAAGGGGTTGCCTAATGGAGGGCTCAGACCCAGGCCTCCTTTCACTTAGACTTGGACATCTAATTCCACTTGTTTAGTTCTATGCCCTAAAGCAAGCTGTTGGTAACATTGCATCTCTTTTTTAACCCTACAATTTTCTTGGATATTTTTTATGGACTGTATTCCACTTGATGGCTTGTGTCGCTTGACATCAGGCCAGGAATGTCTTTCTGTAATTCTCGTCCACGCTCTTCCACTTCAGCCCTCCTGGGAATGAATGTAAAGATTCAGTCAGCTAACTCACCTTGTCCCCCTTCTCCATTATCAGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAGTGGCTTTGTGAGAAGTTGTGAGTGTCTGCTGTCCTTGGCACCCCTGCCCACTCCACACTCCTGGAATACCTCTTCCCTAATGCCACCTCAGTTTGTTTCTTTCTGTTCCCCCAAAGCTTATCTGTC3．對(duì)含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)進(jìn)行轉(zhuǎn)宿主Y-ALA分子是存在于宿主AB1380中的，由于AB1380中的遺傳標(biāo)記少，不利于同源重組，所以將該YAC分子轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD925宿主菌中，有利于下一步的基因重組。YPD925酵母株可以用-His或-Leu的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記來(lái)篩選重組基因。
過(guò)夜培養(yǎng)YPD925菌體和含Y-ALA的酵母株，第二天各收取1ml菌液混和離心(2500rpm,2min)，用1ml新鮮的YPD重懸，30攝氏度培養(yǎng)6-8小時(shí)，后吸取0.2ml培養(yǎng)物涂篩選平板(-Ura，含有放線菌酮3ug/ml)，培養(yǎng)3天出現(xiàn)菌落。此時(shí)YAC分子已轉(zhuǎn)移到酵母株YPD925中。
4將IL-11基因重組入Y-ALA分子中，構(gòu)建重組YAC ALA-IL。
過(guò)夜培養(yǎng)，Y-ALA菌株100ml，培養(yǎng)物OD值達(dá)到0.5左右時(shí)，離心收集，用水重懸，離心，用RS-ALA-IL載體通過(guò)LiAC法轉(zhuǎn)化Y-ALA菌株，從而讓RS-ALA-IL與Y-ALA之間發(fā)生重組(圖4)。篩選到His+,Ura+和Trp+的轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步用引物對(duì)A-I3和A-I4鑒定，可分別拉出700和1000bp產(chǎn)物的，即為同源重組子YAC-ALA-IL〔或稱為Y-ALA-IL-11〕。
5重組YAC的純化重組YAC的純化同實(shí)施例1。制備的YAC分子即可用于顯微注射來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
A、顯微注射將上述純化后的YAC分子，通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入到莎能奶山羊受精卵雄原核內(nèi)，再移植到同步發(fā)情的受體山羊輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。山羊超排、注射、移植以及產(chǎn)仔等試驗(yàn)結(jié)果如下B、轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應(yīng)用PCR的方法(與本實(shí)施例“二、構(gòu)建過(guò)程1”中的PCR法相同)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的整合檢測(cè)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因的整合率為20％10/50),PCR+Southern試驗(yàn)證實(shí)了基因的整合。
C、表達(dá)檢測(cè)將性成熟的轉(zhuǎn)基因羊通過(guò)人工催乳，應(yīng)用Western方法檢測(cè)其乳汁中目的蛋白。結(jié)果證實(shí)了IL-11的表達(dá)。
實(shí)施例3一、實(shí)驗(yàn)材料Y-ALA、Y-FIX(含有凝血因子9基因的YAC克隆)(上海市第二醫(yī)科大學(xué)血研所陳竺院士惠贈(zèng))，RS403,RS-401(購(gòu)自Stratagene公司)，AB1610酵母〔常用菌株〕。引物ALA1: 5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′ALA2: 5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′FIX1 5′CAAAGGTTATGCAGCGC 3′5′AGCTGACATCATGTCTGGAG 3′FIX2 5′GTCATAATTTCAGAACCCACG 3′5′TGAATTAACCTTGGAAATCC 3′F-A1 5′TGGACATTATTTCCCAGAAG 3′5′TTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′F-A2 5′ATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′GGTAAAATATGAAATTCTCCC 3′二、構(gòu)建過(guò)程1、調(diào)取ALA基因的上下游調(diào)控序列片段。
通過(guò)PCR反應(yīng)，分別用引物對(duì)ALA1和引物對(duì)ALA2從人基因組DNA中擴(kuò)增出人ALA基因的上下游各700和900bp的片段。PCR循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例1。
2、調(diào)取凝血因子9基因的頭、尾片段。
通過(guò)PCR反應(yīng)，分別用引物對(duì)FIX1和引物對(duì)FIX2從人基因組DNA中擴(kuò)增出人FIX基因的頭尾各1KB和1.2KB的片段。PCR循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例1。
3、構(gòu)建重組載體將步驟1中的700bp的ALA上游片段經(jīng)EcoRⅤ和NotⅠ酶切與1KB的凝血因子9基因頭段經(jīng)EcoRⅤ和XhoⅠ酶切，插入RS403相應(yīng)位點(diǎn)中，形成載體RS-FIX1〔圖5〕。
將步驟1中900bp的ALA下游片段(經(jīng)EcoRⅤ和NotⅠ酶切)與1.2kb的凝血因子9基因尾段(經(jīng)EcoRⅤ和XhoⅠ酶切)插入RS401相應(yīng)位點(diǎn)中，形成RS-FIX2〔圖6〕。
4、酵母內(nèi)重組構(gòu)建重組Y-rFIX同時(shí)將RS-FIX1和RS-FIX2用LiAC法轉(zhuǎn)化含Y-ALA的YPD925酵母株，篩取Leu+和His+特性的重組YAC分子(圖7)。進(jìn)一步用引物對(duì)F-A1和F-A2篩選同源重組子，PCR反應(yīng)得到750和850bp條帶即為重組子Y-rFIX。
5、Y-ALA與重組Y-FIX分子發(fā)生YAC嵌合重組提取Y-ALA分子，原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入AB1610，過(guò)夜培養(yǎng)該菌及含Y-rFIX的AB1380菌株，第二天，各取1ml混和離心，后用1ml新鮮的YPD培養(yǎng)液30攝氏度培養(yǎng)4-8小時(shí)，涂篩選平板(-Leu,-Trp,-Ura)，3天后長(zhǎng)出克隆。克隆進(jìn)一步在孢子形成培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，用1ml水來(lái)洗下菌體，用超生波處理，得到孢子液，進(jìn)一步涂于篩選培養(yǎng)基，篩取Trp+、Ura+、Leu+、His-,TK-的酵母株，此株即為Y-ALA-FIX重組YAC株。
電泳結(jié)果表明Y-ALA-FIX重組YAC株長(zhǎng)度為230KB，比Y-ALA樣品長(zhǎng)。
6．按實(shí)施例1類似的方法，提取重組的YAC分子，用于顯微注射。
A、顯微注射將上述純化后的YAC分子，通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入到莎能奶山羊受精卵雄原核內(nèi)，再移植到同步發(fā)情的受體山羊輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。山羊超排、注射、移植以及產(chǎn)仔等試驗(yàn)結(jié)果如下B、轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應(yīng)用PCR的方法(與本實(shí)施例“二、構(gòu)建過(guò)程1”中PCR法相同)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的整合檢測(cè)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因的整合率為20％(10/50),PCR+Southern試驗(yàn)證實(shí)了基因的整合。
C、表達(dá)檢測(cè)將性成熟的轉(zhuǎn)基因羊通過(guò)人工催乳，應(yīng)用Western方法檢測(cè)其乳汁中目的蛋白。結(jié)果證實(shí)了FIX因子的表達(dá)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的方法，其特征在于，它包括步驟制備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA，其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá)；用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內(nèi)，移植到代孕山羊體內(nèi)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的山羊，大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該目的基因編碼乳鐵蛋白，而且將含乳蛋白基因的大片段直接用于轉(zhuǎn)基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該大片段DNA通過(guò)酵母內(nèi)同源重組的方法進(jìn)行改造，從而在該大片段DNA中乳蛋白基因的調(diào)控序列位于目的基因的兩側(cè)并指導(dǎo)目的基因的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在用酵母內(nèi)同源重組的方法改造大片段DNA時(shí)，包括步驟用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法調(diào)取乳蛋白基因上下游各一段300-1500bp調(diào)控序列作為同源臂，兩者之間插入要表達(dá)的目的基因構(gòu)建成打靶載體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟將所述的打靶載體，與含有乳蛋白基因大片段上下游序列及基因自身的完整編碼序列的大分子YAC、BAC、P1克隆進(jìn)行酵母內(nèi)重組，從而將目的基因插入在乳蛋白基因的大片段調(diào)控序列下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該大片段DNA包括長(zhǎng)度為5-200kb的含目的基因的基因組序列，和位于所述基因組序列兩側(cè)并指導(dǎo)目的基因表達(dá)的長(zhǎng)度為50-200KB的乳蛋白基因的調(diào)控序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的乳蛋白基因的調(diào)控序列包括乳蛋白基因編碼區(qū)的5′和3′序列，其上包括如下控制乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄的核心序列TATA盒、GC盒，遠(yuǎn)端基因座控制區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的大片段DNA是用酵母內(nèi)YAC嵌合方法制備的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，用酵母內(nèi)YAC嵌合方法制備大片段DNA時(shí)包括步驟制備乳腺定位表達(dá)ALA的表達(dá)載體和含目的基因的基因組序列的表達(dá)載體；用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法調(diào)取乳蛋白基因上下游各一小段300-1500bp調(diào)控序列和目的基因的頭尾各一小段300-1500bp序列，用同源重組方式將所述的乳蛋白基因上下游各一小段調(diào)控序列分別插入所述目的基因的頭尾各一段序列的上下游，形成兩個(gè)嵌合載體；嵌合載體與所述的含目的基因的基因組序列的表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，形成目的基因嵌合載體，其中所述的乳蛋白基因上下游各一小段調(diào)控序列位于目的基因的兩側(cè)；將目的基因嵌合載體與乳腺定位表達(dá)乳蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入同一酵母中，兩者重組形成嵌合分子，其中該嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指導(dǎo)目的基因的基因組序列的表達(dá)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該目的基因編碼選自下組的蛋白HLF、IL-11、FIX，且該山羊選自下組莎能乳山羊、波爾羊、普通山羊。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的用大片段DNA制備乳腺生物反應(yīng)器的方法,該方法包括步驟:制備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA,其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá);用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內(nèi),移植到代孕山羊體內(nèi),產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的山羊,大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點(diǎn)表達(dá)。用本發(fā)明方法可有效地實(shí)現(xiàn)目的基因在乳腺中的定點(diǎn)、定時(shí)表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1324952SQ0011579
公開(kāi)日2001年12月5日 申請(qǐng)日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者成國(guó)祥, 王凱, 陳建泉, 吳國(guó)祥 申請(qǐng)人:上海中路生物工程有限公司