專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種調(diào)控外源基因(如人乳鐵蛋白)在動物乳腺組織特異性表達(dá)的載體，以及在動物乳腺中特異性表達(dá)外源基因的方法。
動物乳腺組織具有較強(qiáng)的合成蛋白的功能，如能利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因特別是有重要醫(yī)療價值的基因如人促紅細(xì)胞生成素基因，人生長激素基因等轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，就有可能生產(chǎn)出大量的藥用蛋白。人體內(nèi)的許多蛋白的生理活性與翻譯后修飾有關(guān)，通過原核表達(dá)的蛋白通常因為缺少翻譯后修飾而不具備生物活性。以真核細(xì)胞培養(yǎng)來表達(dá)這些蛋白需要較高的成本，以轉(zhuǎn)基因動物來表達(dá)外源蛋白，其產(chǎn)物接近天然即具有較高的生物活性、表達(dá)量高而且成本底。
用顯微注射的方法轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)的基因，其在動物體內(nèi)的基因組的整合及表達(dá)是隨機(jī)的，如果外源基因產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性，外源基因的隨機(jī)表達(dá)或異位表達(dá)就有可能造成轉(zhuǎn)基因動物體的疾病甚至死亡。如促紅細(xì)胞生成素的異位表達(dá)會引起高紅細(xì)胞血癥。
因此，本領(lǐng)域迫切需要在牛和羊等動物的乳腺組織中特異性表達(dá)外源基因的載體和技術(shù)。
本發(fā)明的目的就是提供一種具有乳腺組織特異性的且高效表達(dá)外源基因的載體。
本發(fā)明的另一目的是利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，從而在動物乳腺中大量表達(dá)人乳鐵蛋白。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種乳腺特異性表達(dá)融合基因BLG-HLF，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、人乳鐵蛋白cDNA序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。較佳地，在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和人乳鐵蛋白cDNA序列之間還有一接頭序列；和/或在人乳鐵蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外顯子1之間還有一接頭序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和人乳鐵蛋白cDNA序列之間的接頭序列是CTCGACGACTCTAGAGGATCCA；而在人乳鐵蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外顯子1之間的接頭序列是ATCGTCGAGCTG。
更佳地，牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或人乳鐵蛋白cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和/或牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，它包括步驟將上述的乳腺特異性表達(dá)融合基因，用原位注射入動物乳腺，從而在動物乳腺中的瞬時表達(dá)；獲得混合物形式的人乳鐵蛋白或分離出表達(dá)的人乳鐵蛋白。
較佳地，該方法還包括步驟用一對從mRNA水平檢測人乳鐵蛋白在山羊乳腺中表達(dá)的引物和一對從mRNA水平檢測山羊乳腺內(nèi)源性乳鐵蛋白表達(dá)的引物，通過RT-PCR法檢測乳鐵蛋白在乳腺中的瞬時表達(dá)，其中，人乳鐵蛋白的特異性引物為引物A:5′-5GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3′和引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTAGTG-3′；羊乳鐵蛋白特異性引物為引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′和引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′；將經(jīng)瞬時表達(dá)檢驗的融合基因BLG-HLF顯微注射動物受精卵原核制備轉(zhuǎn)基因動物。
本發(fā)明還提供了另一種生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，它包括步驟(1)將上述的乳腺特異性表達(dá)融合基因BLG-HLF，顯微注射動物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；(2)將步驟(1)中的基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物；(3)從動物乳腺分泌的乳汁中獲得混合物形式的人乳鐵蛋白或分離純化出表達(dá)的人乳鐵蛋白。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法，該動物的基因組整合了所述的融合基因BLG-HLF并且在其乳腺中有人乳鐵蛋白的特異表達(dá)，它包括步驟(1)將上述的乳腺特異性表達(dá)融合基因BLG-HLF，顯微注射動物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；
(2)將步驟(1)中的基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。
本發(fā)明還提供了一種調(diào)控外源基因在動物乳腺中特異性表達(dá)的載體，該載體從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列，且在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和牛乳球蛋白外顯子1之間有多克隆位點(diǎn)，以便引入待表達(dá)的外源基因；用于在細(xì)菌中復(fù)制的自我復(fù)制序列。
在附圖中，


圖1是BLG-HLF融合基因元件構(gòu)成示意圖。
圖2是BLG-HLF融合基因構(gòu)建流程圖。
圖3是BLG-HLF融合基因酶切圖譜。
圖4是牛BLG的5′側(cè)翼序列和外顯子1非編碼序列。
圖5是人乳鐵蛋白全長編碼序列。
圖6是牛BLG外顯子1至外顯子3序列。
圖7是牛BLG外顯子6至3′側(cè)翼序列。
圖8,9是融合基因BLG-HLF羊乳腺瞬時表達(dá)的檢測。
圖10是融合基因BLG-HLF羊基因組的整合檢測。
圖11是轉(zhuǎn)基因羊乳鐵蛋白乳腺表達(dá)的檢測。
乳鐵蛋白是一種多功能的糖蛋白，具有抗菌和抗病毒等作用，是一種有重要價值的醫(yī)用蛋白。在本發(fā)明的一個實施例中，選用人乳鐵蛋白作為研究的外源基因。
本發(fā)明首先提供了一種調(diào)控外源基因在動物乳腺組織特異性表達(dá)的載體。為了使外源基因(人乳鐵蛋白)在動物乳腺中特異表達(dá)，本發(fā)明利用牛乳蛋白基因的乳腺特異表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建了乳腺特異表達(dá)的載體。該載體包括牛乳球蛋白基因的5′側(cè)翼序列，部分外顯子和內(nèi)含子序列，3′側(cè)翼序列。位于5′側(cè)翼序列下游的供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，以及供載體連同插入其上的外源基因在大腸桿菌中復(fù)制的pSP72序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，所構(gòu)建的載體的具有如下序列元件一、包括了牛乳球蛋白基因(BLG)的5′調(diào)控序列(-1216～+45bp)二、包含了牛乳球蛋白基因外顯子1至外顯子3(+48～+1878bp)、外顯子6至外顯子7(+4109～+4723)及3′側(cè)翼序列(734bp)。
在本發(fā)明另一實施例中，還以該特異性表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了表達(dá)人乳鐵蛋白的融合基因BLG-HLF，該融合基因的特點(diǎn)為HLF全長編碼序列cDNA 5′端以BamHⅠ連于BLG的5′調(diào)控序列及外顯子1非編碼序列的下游，3′端以XhoⅠ連于BLG外顯子1編碼序列至3′側(cè)翼序列的上游。該融合基因的HLF cDNA位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，緊鄰BLG的5′-UTR，因而HLF能在BLG啟動子作用下而轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體為融合mRNA，其編碼序列為HLF cDNA，而5′-UTR及3＇-UTR來源于BLG。因HLF cDNA提供了終止密碼，因而只有HLF蛋白被編碼，而BLG不被翻譯。
本發(fā)明的載體/融合基因所包含的調(diào)控序列含有乳腺特異表達(dá)的元件，能保證外源基因在乳腺特異表達(dá)。但該調(diào)控序列只有數(shù)千堿基，外源基因的表達(dá)呈現(xiàn)位置效應(yīng)即外源基因的表達(dá)水平與其在染色體的整合位置有關(guān)。
在本發(fā)明的另一實施例中，將以此載體構(gòu)建能在乳腺特異表達(dá)人乳鐵蛋白的融合基因BLG-HLF轉(zhuǎn)入動物時，從而在動物乳腺中大量表達(dá)人乳鐵蛋白。
適用于本發(fā)明的動物包括哺乳動物，較佳地該動物選自下組羊、牛。
在本發(fā)明中，牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列具有本領(lǐng)域的常規(guī)的含義。此外，牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列宜至少含150bp，較佳地至少200bp。
在本發(fā)明的一個實施例中，這些序列的具體核苷酸序列如SEQ ID NO:1、3、4所示。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 HLF乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建該實施例的基因構(gòu)建過程如圖2所示，該基因構(gòu)建物即為BLG-HLF融合基因，其中調(diào)控序列來源于牛BLG，編碼序列來源于HLF。
pSP72-BLG-HLF的制備1．各部分元件的來源1)牛BLG5′側(cè)翼序列和外顯子1非編碼序列部分用常規(guī)方法構(gòu)建?；蚪M文庫(lambda EMBL3 vector)，以牛BLG啟動子區(qū)的DNA(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)為探針篩選。挑選出含BLG啟動子區(qū)域的陽性克隆。設(shè)計并合成如下引物5′-CACAGGAAAGGGAGGTCTG-3′和5′-CCGCTCGAGGCTGCAGCTGGGGTCAC-3′，用PCR法(94℃,5min；94℃,1min；60℃45s；72℃90s,30個循環(huán))擴(kuò)增BLG5′側(cè)翼序列及外顯子1非編碼部分序列(SEQ ID NO:1，圖4)。PCR產(chǎn)物以XhoⅠ和EagⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK載體的相應(yīng)位點(diǎn)，得質(zhì)粒pBSK-BLG5′。
2)牛BLG外顯子1-3及外顯子6-7和3′側(cè)翼序列PCR擴(kuò)增外顯子1及其鄰近序列，以PCR產(chǎn)物為探針進(jìn)行文庫篩選。挑選出陽性克隆，以陽性克隆噬菌體DNA為模板，用如下引物5′-CCGCTCGAGAAGTGCCTCCTGCTTGCC-3′；和5′-AGCACTCACCATCGATCTTG-3′通過PCR(94℃,5min；94℃,1min；58℃45s；72℃90s,30個循環(huán))擴(kuò)增出外顯子1-3序列(SEQ ID NO:3，圖6)并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以XhoⅠ和ClaⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK載體的相應(yīng)位點(diǎn)得質(zhì)粒pBSK 1-3。
以陽性克隆噬菌體DNA為模板，設(shè)計并合成如下引物5′-CCATCGATGAGCAGTG CCACATCTAGG-3′和5′-ATAAGAATGCGGCCGC GCATGCCAGGCCTT TCTG-3′通過PCR(94℃,5min；94℃,60s；56℃60s；72℃90s,35個循環(huán))擴(kuò)增出BLG外顯子6～7及3′側(cè)翼序列(SEQ ID NO:4，圖7)，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以NotⅠ和ClaⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK載體的相應(yīng)位點(diǎn)得質(zhì)粒pBSK 6-3′。
3)以人中性粒細(xì)胞總RNA為模板，采用如下引物5′-CGGGATCCAATGAAACTTGTCTTCCTGCTG-3′和5′-CCATCGATTTACTTCCTGAGGAATTCACAG-3′通過RT-PCR法獲得HLF編碼序列全長cDNA序列(SEQ ID NO:2，圖5)，并將其克隆入pSP72載體，得質(zhì)粒pSP72-HLF。
2．pSP72-BLG-HLF的構(gòu)建構(gòu)建過程詳見圖2。按圖2所述構(gòu)建得到pSP72-BLG-HLF。
pSP72-BLG-HLF乳腺特異表達(dá)融合基因的酶切圖譜，參見圖3。
在pSP72-BLG-HLF中，HLF與BLG5′接頭及其鄰近序列如下HLF與BLG3′接頭及鄰近序列如下 HLF編碼序列終止密碼 接頭序列 BLG外顯子1-3→外顯子6-3’側(cè)翼序列參見
圖1，在人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體pSP72-BLG-HLF或融合基因BLG-HLF中，各元件的功能如下陰影框部分為BLG的5’側(cè)翼序列，該部分是BLG啟動子，負(fù)責(zé)驅(qū)動外源基因的表達(dá)，保證外源基因表達(dá)是乳腺特異性的?！硎綛LG5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)，5’-UTR與外源基因mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)，為外源基因翻譯編碼形成蛋白提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其詳細(xì)序列參見附圖4和SEQ ID NO:1。
空心框部分為外源基因HLF全長編碼序列。包括翻譯起始密碼及終止密碼子。序列詳見圖5和SEQ ID NO:2。
實心框部分為牛BLG外顯子1至外顯子3，外顯子6～7和3’側(cè)翼序列，其作用是提供轉(zhuǎn)錄終止信號及加PolyA信號。外顯子部分向外源基因提供3’非翻譯區(qū)，內(nèi)含子部分及3’側(cè)翼序列與乳腺特異性高效表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，序列詳見圖6和SEQ ID NO:3，以及圖7和SEQ ID NO:4。
實施例2．pSP72-BLG-HLF在奶山羊乳腺組織中的瞬時表達(dá)本實驗的檢測融合基因pSP72-BLG-HLF在動物乳腺中的表達(dá)情況。
1．融合基因pSP72-BLG-HLF在山羊乳腺中的表達(dá)1)奶山羊的人工誘乳選取健康成年奶山羊，每天肌肉注射苯甲酸雌二醇及黃體酮二次，每次劑量分別為2mg及20mg，共七天。然后分別于第8,10,12,14天肌肉注射利血平0.5mg。
2)融合基因pSP72-BLG-HLF DNA注射及乳腺組織手術(shù)切取在人工誘乳的第三天，將乳山羊在無菌條件下手術(shù)，分離乳腺動脈后，每側(cè)乳腺經(jīng)乳動脈注射pSP72-BLG-HLF質(zhì)粒DNA100μg。人工誘乳第七天及第十四天分別在無菌條件下手術(shù)切取約10克乳腺組織，組織立即放入液氮凍存，供外源基因表達(dá)檢測用。
2．融合基因pSP72-BLG-HLF山羊乳腺瞬時表達(dá)檢測1)人及山羊乳鐵蛋白mRNA特異性PCR檢測引物分析乳山羊(Capra hircus)乳鐵蛋白基因mRNA及人乳鐵蛋白基因(HLF2)mRNA的同源性，分別設(shè)計和合成兩對引物，使之具有專一性。
人HLF2 mRNA特異性引物為引物A:5′-GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3′引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTAGTG-3′羊mRNA特異性引物為引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′
引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′2)檢測方法樣品未催乳山羊乳腺組織，待測山羊(催乳7天)乳腺組織，待測山羊(催乳14天)乳腺組織。
樣品m RNA提取取1克組織加入1ml TRIZOL Reagent，用勻漿器將組織徹底勻漿，室溫靜置5分鐘，加入200μl氯仿，混勻高速離心(12000g)兩分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至離心管，加入500μl異丙醇，振蕩混勻，室溫放置5分鐘。高速離心(12000g)5分鐘，小心棄上清，室溫靜置約15分鐘使RNA恰好干燥，加水溶解。
RT-PCR取5μg樣品m RNA加入反轉(zhuǎn)錄試劑37℃反應(yīng)一小時，使mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,95℃5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，每次取2μl cDNA樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3)檢測結(jié)果(A)先檢測各檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及反應(yīng)體系是否良好。參見圖8，泳道(1)以待測樣品(催乳7天)cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行G3PDH PCR擴(kuò)增，檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及反應(yīng)體系是否良好。
泳道(2)以待測樣品(催乳14天)cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行G3PDH PCR擴(kuò)增，檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及反應(yīng)體系是否良好。
泳道(3)以待測樣品(催乳7天)總RNA為模板進(jìn)行HLF PCR擴(kuò)增，以檢測反應(yīng)體系和樣品mRNA是否污染泳道(4)以待測樣品(催乳14天)總RNA為模板進(jìn)行HLF PCR擴(kuò)增，以檢測反應(yīng)體系和樣品mRNA是否污染PCR結(jié)果表明反應(yīng)體系和樣品mRNA(泳道3,4)均無污染(沒有HLF擴(kuò)增)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及反應(yīng)體系良好(泳道1,2)檢測結(jié)果見附圖8。
(B)待測樣品PCR檢測結(jié)果顯示參見圖9，未催乳山羊人和羊的LF均無擴(kuò)增現(xiàn)象(泳道2,5)；待測樣品(催乳7天)人和羊的LF均有明顯擴(kuò)增現(xiàn)象(泳道1,4)；待測樣品(催乳14天，)羊的LF擴(kuò)增明顯(泳道3)而人的LF擴(kuò)增較弱(泳道6)。這些結(jié)果表明BLG-HLF能在催乳山羊乳腺組織中表達(dá)。
實施例3融合基因pSP72-BLG-HLF轉(zhuǎn)基因山羊的制備1．轉(zhuǎn)基因用質(zhì)粒DNA的制備1)質(zhì)粒pSP72-HLF轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52，液體培養(yǎng)含pSP72-HLF質(zhì)粒的DH52菌株，培養(yǎng)量根據(jù)需要可為100ml-1000ml，然后收集細(xì)菌，用快速抽提法或大規(guī)模抽提法制備pSP72-HLF(詳細(xì)操作參考曼尼安蒂斯主編的分子克隆手冊)。
提取的pSP72-HLF質(zhì)粒用ScaⅠ+PvuⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳得到分子量分別為9.0Kb和100bp的兩個片段，回收9.0Kb條帶用Sephaglass Babndprep(pharmacia biotech)試劑盒純化備用。
2)用顯微注射DNA稀釋液將純化后DNA稀釋至2ug/ml，離心(12000rpm,30min)，分裝，即可作顯微注射用。
2．制備轉(zhuǎn)基因動物將融合基因BLG-HLF通過顯微注射的方法導(dǎo)入到奶山羊受精卵雄原核內(nèi)，然后再移植到同步發(fā)情的受體山羊輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。
實施例4．融合基因pSP72-BLG-HLF轉(zhuǎn)基因山羊基因組整合的檢測1．樣品處理未轉(zhuǎn)基因山羊(
圖10，泳道1)和待測轉(zhuǎn)基因山羊(
圖10，泳道3,4,5,6)，按常規(guī)操作取羊耳(長度小于1厘米)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2．檢測方法1)基因組DNA的快速抽提將羊耳置于1.5ml離心管中，加0.5ml的LysisBuffer(4M Urea power,10mM EDTA(pH8.0),0.5％Sarkosyl(Sigma L5125),0.1MTris-Cl(pH8.0),0.2M NaCl),50μl的蛋白酶K(10mg/ml)置于55℃的雜交爐中振搖過夜。離心(14000rpm)5min，轉(zhuǎn)移上清至一個干凈的離心管中，加入1ml無水乙醇輕輕混合后強(qiáng)烈振搖，用Tip頭輕輕挑起絮狀DNA沉淀，用250-300μl的0.1×TE或雙蒸水重懸DNA，吹打混勻，4℃保存。
2)酶切及電泳取基因組DNA約10微克采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅤ在37℃酶切12小時以上。酶切產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳，1-2V/cm電壓，電泳12小時以上。
變性及中和加入變性液(1.5M NaCl 0.5M NaOH)使膠變性45分鐘(輕搖)，加入中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-Hcl(PH8.0)輕搖中和45分鐘(輕搖)3)轉(zhuǎn)膜將尼龍膜均勻鋪在膠上，上面鋪3MM Waterman吸水紙3張，再鋪紙塔(5-10厘米)，壓上重物，轉(zhuǎn)膜18小時；用5×SSC沖洗膜以去除膜表面的凝膠碎片；在室溫下晾干，80℃固定2小時。
4)探針制備用SacⅠ酶切質(zhì)粒pBLG-HLF，回收1773bp條帶，產(chǎn)量應(yīng)在500ng-1000ng間，采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針。
5)預(yù)雜交及雜交轉(zhuǎn)印膜在預(yù)雜交液(5×SSPE,5×Denhardt′s Solution,0.1％SDS,100μg/ml nonhomologous Salmon sperm blocking DNA,50％Formamide)中42℃預(yù)雜交4小時。將探針加入到預(yù)雜交液中，42℃雜交16小時。
6)洗膜壓片洗片采用Wash Solution(1×SSC,0.1％SDS)65℃洗滌1小時，重復(fù)此步驟，直到本底降到10以下。把洗后的膜用保險膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存兩天。暗室中取出X光片，顯影5分鐘，定影15分鐘，檢查光片上所顯示的結(jié)果，2．檢測結(jié)果結(jié)果見附
圖10，泳道1為陽性對照人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因用DNA；泳道2為陰性對照未轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA；泳道3,4,5,6,7為待測轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因山羊(泳道3,5,6,7)的基因組DNA中有BLG-HLF的整合。
實施例5．轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中人乳鐵蛋白的檢測1．樣品處理收集羊奶，脫脂處理(4000rpm,4℃,20min)，加入等體積的TBS緩沖液(0.1mol/L Tris-堿，0.3mol/L NaCl,0.2mol/L EDTA,PH6.5)，過0.22um濾膜除菌，樣品中加入1×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃煮沸3分鐘，使蛋白變性。
2．檢測方法1)蛋白電泳經(jīng)處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，積層膠4％膠濃度，50V；分離膠7.5％膠濃度，100V。
2)蛋白轉(zhuǎn)印電泳后在80mA電流下進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印2小時，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)印效果。轉(zhuǎn)印膜用Tris-NaCl溶液(0.05mol/LTris-堿，0.15mol/L NaCl,pH7.5)洗去結(jié)合在蛋白上的麗春紅染料后用于雜交抗體。
3)抗體雜交將轉(zhuǎn)印膜放入平皿，加入適量封閉液(10％脫脂奶粉)，以1∶3000的濃度加入第一抗體(鼠抗人乳鐵蛋白抗體)，于平緩搖動的搖床上室溫雜交四小時；雜交結(jié)束，用Tris-NaCl溶液漂洗濾膜3次，每次10分鐘；以1∶2000的濃度加入酶聯(lián)二級抗體，室溫雜交二小時；雜交結(jié)束，用Tris-NaCl溶液漂洗膜3次，每次10分鐘，然后進(jìn)行顯色反應(yīng)。
4)顯色在膜上加入適量底物(堿性磷酸酶用BCIP/NBT)，暗反應(yīng)約20分鐘，就能看到蛋白條帶。
3．檢測結(jié)果結(jié)果見附
圖11，圖中泳道N為陰性對照未轉(zhuǎn)基因山羊乳蛋白；泳道P為陽性對照人乳蛋白；泳道3,5,6,7為待測轉(zhuǎn)基因山羊乳蛋白。
結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因山羊(泳道3,7)的乳汁中有人乳鐵蛋白的特異性條帶顯示。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種乳腺特異性表達(dá)融合基因，其特征在于，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、人乳鐵蛋白cDNA序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和人乳鐵蛋白cDNA序列之間還有一接頭序列；和/或在人乳鐵蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外顯子1之間還有一接頭序列。
3.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于，牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；人乳鐵蛋白cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和人乳鐵蛋白cDNA序列之間的接頭序列是CTCGACGACTCTAGAGGATCCA；在人乳鐵蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外顯子1之間的接頭序列是ATCGTCGAGCTG。
5.一種生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟將權(quán)利要求1所述的乳腺特異性表達(dá)融合基因，用原位注射入動物乳腺，從而在動物乳腺中的瞬時表達(dá)；獲得混合物形式的人乳鐵蛋白或分離出表達(dá)的人乳鐵蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟用一對從mRNA水平檢測人乳鐵蛋白在山羊乳腺中表達(dá)的引物和一對從mRNA水平檢測山羊乳腺內(nèi)源性乳鐵蛋白表達(dá)的引物，通過RT-PCR法檢測乳鐵蛋白在乳腺中的瞬時表達(dá)，其中，人乳鐵蛋白的特異性引物為引物A:5′-5GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3＇和引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTA GTG-3′；羊乳鐵蛋白特異性引物為引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′和引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′；將經(jīng)瞬時表達(dá)檢驗的融合基因BLG-HLF顯微注射動物受精卵原核制備轉(zhuǎn)基因動物。
7.一種生產(chǎn)人乳鐵蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將權(quán)利要求1所述的乳腺特異性表達(dá)融合基因BLG-HLF，顯微注射動物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；(2)將步驟(1)中的基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物；(3)從動物乳腺分泌的乳汁中獲得混合物形式的人乳鐵蛋白或分離純化出表達(dá)的人乳鐵蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該動物選自下組羊、牛。
9.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法，該動物的基因組整合了所述的融合基因BLG-HLF并且在其乳腺中有人乳鐵蛋白的特異表達(dá)，其特征在于，它包括步驟(1)將權(quán)利要求1所述的乳腺特異性表達(dá)融合基因BLG-HLF，顯微注射動物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；(2)將步驟(1)中的基因組中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物；
10.一種調(diào)控外源基因在動物乳腺中特異性表達(dá)的載體，其特征在于，該載體從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列，且在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和牛乳球蛋白外顯子1之間有多克隆位點(diǎn)，以便引入待表達(dá)的外源基因；用于在細(xì)菌中復(fù)制的自我復(fù)制序列。
全文摘要
本發(fā)明利用牛(bovine)的乳球蛋白(BLG)5'側(cè)翼序列、部分外顯子內(nèi)含子序列及3'側(cè)翼序列為乳腺特異表達(dá)的調(diào)控序列。以人乳鐵蛋白(HLF)全長cDNA為編碼序列,構(gòu)建融合基因BLG－HLF,該融合基因可以在催乳山羊乳腺中瞬時表達(dá)。以該融合基因顯微注射山羊受精卵原核,獲得了人乳鐵蛋白乳腺特異高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因山羊。
文檔編號C12N15/63GK1324865SQ0011579
公開日2001年12月5日 申請日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者成國祥, 吳國祥, 陳建泉 申請人:上海中路生物工程有限公司