專利名稱：：一種控制固定化酶空間取向的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及酶和其它功能蛋白質(zhì)分子固定化空間取向(Orientation)的方法。固定化酶是本世紀(jì)六十年代發(fā)展起來的技術(shù)，其原理是通過物理或化學(xué)手段將水溶性酶或限制在局部空間，達(dá)到可反復(fù)使用的目的。主要應(yīng)用形式為各類酶反應(yīng)器、酶傳感器和生物芯片等生物器件等。長期以來，它們在生物工業(yè)、醫(yī)學(xué)及臨床診斷、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)以及基礎(chǔ)研究等方面發(fā)揮了重要作用。固定化酶技術(shù)后來又被用于其它功能蛋白質(zhì)的固定，如免疫芯片、蛋白質(zhì)芯片。經(jīng)典的固定化酶方法主要有物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、凝膠包埋和微膠囊法等。在工業(yè)規(guī)模應(yīng)用水平(如酶反應(yīng)器)，強(qiáng)調(diào)載體廉價并具有大的固定表面積(或比表面積)，但酶活常常損失可觀(可達(dá)90％以上)。然而，在生物傳感器和生物芯片方面，可供固定的面積非常小，如傳統(tǒng)的生物傳感器酶膜面積不到一個平方厘米，新近發(fā)展的蛋白質(zhì)芯片和計算機(jī)生物芯片、微型生物傳感器及生物傳感器陣列等，單只器件有效固定面積為微米水平，甚至向單分子器件發(fā)展，使得傳統(tǒng)的固定化方法難以滿足要求。主要表現(xiàn)在酶或蛋白質(zhì)經(jīng)固定后剩余活力(residualactivity)大量損失和批間制作的重現(xiàn)性差。其主要原因有(1)固定過程中化學(xué)交聯(lián)劑對蛋白質(zhì)造成的化學(xué)損傷，這種情況尤其發(fā)生在大面積的交聯(lián)反應(yīng)和共價結(jié)合反應(yīng)，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生不利于反應(yīng)的變化；(2)當(dāng)被固定的酶蛋白質(zhì)分子表面分布有多個可供交聯(lián)反應(yīng)或共價鍵合的基團(tuán)時，或酶蛋白分子通過靜電吸附固定在載體上時，酶分子固定的方向呈隨機(jī)性，其中不適合的空間取向使酶與底物之間的鄰近定向效應(yīng)受阻，甚至發(fā)生酶活性中心被屏蔽，催化作用減弱。上述原因除造成剩余活力低下以外，還導(dǎo)致制成的生物器件活性不均一，互換性差，即所謂均質(zhì)性差，這是生物傳感器研究和制作生物電子器件中遇到的一個主要問題。因此，如何控制酶或功能蛋白質(zhì)空間沉積方向成為制作高質(zhì)量生物器件的一個關(guān)鍵。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查，學(xué)者們近年來已經(jīng)嘗試了多種解決辦法，歸納起來有共價固定法、巰基引入法和生物素-親和素親合法。共價固定法選擇性地利用酶分子表面遠(yuǎn)離活性中心的特定稀有基團(tuán)(如巰基)進(jìn)行反應(yīng)，使該基團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價鍵合來固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達(dá)到控制其空間取向的目的。但特定稀有基團(tuán)屬于低頻氨基酸，在多數(shù)蛋白質(zhì)分子表面難以尋覓，即使有，位置也不一定合適(CollioudA_etal_Orientedandcovalentimmobilizationoftargetmoleculestosolidsupportssynthesisandapplicationofalight-activatableandthiol-reactivecross-linkingreagent．Bioconjug．Chem．1993，4528；SteinT．a(chǎn)ndGerishG．OrientedBindingofalipid-AnchoredCellProteinontoaBiosensorSurfaceUsingHydrophobicImmobilizationandPhotoactiveCrosslinkingAnal．Biochem．1996，237252)。在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生了巰基引入法，即利用基因定點突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個氨基酸分子引入半胱氨酸，通過其巰基與載體的碘乙?；鶊F(tuán)發(fā)生烷基化反應(yīng)來控制酶分子的空間取向(VigmondSJ．IwakuraM．MizutaniF．a(chǎn)ndKatsuraT．Site-SpecificImmobilizationofMolecularlyEngineeredDihydrofolateReductasetoGoldSurfaces．Langmuir．1994，102870HuangW．etal_Improvingtheactivityofimmobilizedsubtilisinbysite-directedattachmenttosurfaces．Annal．Chem．1997，694601)。但該方法也有明顯不足，須要對蛋白質(zhì)的核酸序列及空間結(jié)構(gòu)有充分了解，蛋白質(zhì)分子表面不能含所要引入的氨基酸殘基，難以預(yù)測引入半胱氨酸后蛋白質(zhì)分子的正?？臻g折疊及構(gòu)象是否受影響，等等。生物素-親和素親合法是將生物素羧化載體蛋白片段融合與酶融合，將融合蛋白定向固定在親和素包被的載體。(MinDJetal_SpecificimmobilizationofinvivobiotinylatedbacterialluciferaseandFMNNAD(P)Hoxidoreductase．Annal．Biochem．1999，270，133)。生物素與親和素或鏈霉親和素有高專一性的、極強(qiáng)的親和力。極端pH值、高的離子強(qiáng)度、甚至促溶劑(如鹽酸胍(3mol／L))都不能破壞這種結(jié)合，因而廣泛用于免疫分析、受體研究、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)分離等。固定效率及穩(wěn)定性都有提高。在此基礎(chǔ)上，本申請作者之一Cass博士等曾經(jīng)采用采用融合蛋白技術(shù)將鏈霉結(jié)合肽與酶結(jié)合，通過鏈霉結(jié)合肽與鏈霉親和素之間的專一性結(jié)合反應(yīng)，以達(dá)到定向固定酶分子的目的，但固定化效率底，酶活損失較大。推測酶分子與鏈霉結(jié)合肽之間的距離太近，兩者構(gòu)象相互影響，而且酶分子對鏈霉結(jié)合肽與鏈霉親和素的結(jié)合反應(yīng)造成較大的空間位阻，不利于固定化。本發(fā)明的目的是提供一種控制固定化酶空間取向的方法，通過融合蛋白的基因操縱技術(shù)，構(gòu)建能定向固定的分子系統(tǒng)，與現(xiàn)有固定化酶方法相比，固定化回收活力高，均一性好，能解決生物分子器件活性不穩(wěn)定和互換性差的問題。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施利用融合蛋白原理，通過基因操縱將酶分子與連接肽以及鏈霉結(jié)合肽融合，構(gòu)建成酶、連接肽和鏈霉結(jié)合肽的融合蛋白分子系統(tǒng)，通過鏈霉結(jié)合肽與固相載體上的鏈霉親和素專一性的結(jié)合、以及連接肽的連接作用，使酶分子固定在載體上。我們特稱這種方法為“錨-鏈”方法?！板^”即鏈霉結(jié)合肽，“鏈”即連接肽?！板^”的作用為定向定點固定，“鏈”的作用是增加酶蛋白與鏈霉結(jié)合肽之間的距離，使各自的構(gòu)象和生物學(xué)活性互不受影響，酶分子通過“鏈”和“錨”的作用被鎖定在鏈霉親和素修飾的載體表面，所有被固定的酶分子具有一致的空間取向，它們的活性中心均自由地朝向外部溶液，保持催化活性狀態(tài)。其步驟是1．基因融合，選擇合適的基因克隆和表達(dá)載體，通過基因操縱，將待固定的酶分子(或其它功能蛋白質(zhì))基因、連接肽(甘氨酸殘基和絲氨酸殘基的多聚體)編碼核苷酸序列和鏈霉結(jié)合肽基因依次拼接，構(gòu)建酶、連接肽和鏈霉結(jié)合肽的融合基因；其中，鏈霉結(jié)合肽含十個氨基酸殘基，分別是絲氨酸、丙氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和兩個甘基酸。該融合基因編碼的融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)為酶-(N)末端-[(甘氨酸-絲氨酸)n]-鏈霉結(jié)合肽，其中10≥n≥3；2．融合基因表達(dá)，將攜帶有融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的受體細(xì)胞(受體細(xì)胞基因組須不含有與融合基因相同的基因)，在選擇性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子，并在合適的液體培養(yǎng)基中表達(dá)出融合蛋白；3．融合蛋白制備，離心培養(yǎng)液、收集洗滌細(xì)胞，提取蛋白粗品，若屬分泌型表達(dá)，則直接從上清液中提取融合蛋白粗品，通過柱層析等方法分離純化融合蛋白，繼而超濾濃縮，4℃保存；4．融合蛋白鑒定，通過SDS-聚丙稀胺凝膠電泳法確定融合蛋白為電泳純，用光吸收法或BIO-RAD試劑盒測定樣品中融合蛋白濃度；5．融合蛋白酶學(xué)分析，進(jìn)行融合蛋白的酶動力學(xué)分析，確定比活力、Km、Kcat等動力學(xué)常數(shù)，比較游離的融合蛋白和野生型酶蛋白的催化動力學(xué)性質(zhì)。如果被固定的是其它功能蛋白質(zhì)(如某種抗體)，則要定量檢測其相應(yīng)的功能；6．融合蛋白的固定，在包被有鏈霉親和素的載體上固定融合蛋白，融合蛋白的酶的活性中心朝向反應(yīng)溶液；7．固定化融合蛋白的性能鑒定。附圖及說明圖1．酶(或其它功能蛋白)固定化空間取向控制的“錨-鏈”分子模型利用融合蛋白原理，通過基因操縱將酶分子與連接肽以及鏈霉結(jié)合肽融合，構(gòu)建成酶、連接肽和鏈霉結(jié)合肽的融合蛋白分子系統(tǒng)，通過鏈霉結(jié)合肽與固相載體上的鏈霉親和素專一性的結(jié)合、以及連接肽的連接作用，使酶分子固定在載體上。其中，“錨”即鏈霉結(jié)合肽，“鏈”即連接肽?！板^”的作用為定向定點固定，“鏈”的作用是增加酶蛋白與鏈霉結(jié)合肽之間的距離，使各自的構(gòu)象和生物學(xué)活性互不受影響，酶分子通過“鏈”和“錨”的作用被鎖定在鏈霉親和素修飾的載體表面，所有被固定的酶分子具有一致的空間取向，它們的活性中心均自由地朝向外部溶液，保持催化活性狀態(tài)；圖2．基因融合策略合成的連接肽(LP)編碼序列l(wèi)p的(+)、(-)鏈經(jīng)退火處理后兩端成PstI酶切位點的粘性末端。質(zhì)粒pASK75克隆有大腸桿菌堿性磷酸酶工程酶(EAP(D101S))基因phoA和鏈霉結(jié)合肽(Streptag，ST)基因st，該兩個基因之間含有一個PstI酶切位點。質(zhì)粒經(jīng)PstI酶解后與lp在T4連接酶的作用下連接，使lp插入到phoA和st中間，得到融合基因phoA-lp-st。該融合基因編碼融合蛋白EAP-LP-ST。融合基因重組子序列中的lp的5’端失去原有的PstI酶切位點，使重組以后的質(zhì)粒pASK75仍然只含有一個PstI酶切位點，該位點在lp和st中間，便于利用酶切進(jìn)一步檢查基因融合正確與否?；蚱魏唾|(zhì)粒的純化都采用QIAGEN公司試劑盒。圖3．融合蛋白的SDS-PAGE電泳照片M為小分子量蛋白質(zhì)電泳標(biāo)準(zhǔn)，S為融合蛋白BAP-LP-ST樣品，電泳方向自上而下，凝膠濃度為濃縮膠，3．9％；分離膠，12％；電流強(qiáng)度，10-15mA；電泳時間80分鐘。圖4．固定化酶的活性比較A為融合蛋白BAP(野生型)-LP-ST，C為融合蛋白BAP-ST，D為融合蛋白，設(shè)置的對照組分別為B1為無鏈霉親和素包被但加入融合蛋白樣品，B2為鏈霉親和素包被但未加入融合蛋白樣品，實驗空白對照，B3既無鏈霉親和素包被，又未加入融合蛋白樣品，只加NBT／BCIP。實驗設(shè)4個重復(fù)。結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述實施例大腸桿菌堿性磷酸酶工程酶(EAP(D101S))的定向固定。1．基因融合(圖2)編碼EAP(D101S)、結(jié)合肽(LP，甘氨酸殘基和絲氨酸殘基的5聚體)和鏈霉結(jié)合肽ST的基因或核苷酸序列分別為phoA、lp和st。含有phoA、和st的克隆表達(dá)載體為細(xì)菌質(zhì)粒pASK75，轉(zhuǎn)化受體細(xì)菌為E．coliSM547。用DNA合成儀分別合成lp的正負(fù)鏈，并使其兩端含有限制性內(nèi)切酶PstI酶切位點，正負(fù)鏈經(jīng)退火形成DNA雙鏈(+)5’-AGCGGCTCT(GGATCT)3GGATCTGCA-3’(-)3’-CGTTCGCCTAGA(CCTAGA)3CCTAG-5’用PstI分別酶切l(wèi)p和含有phoA-st融合基因的的pASK75質(zhì)粒(ZhangXEetal_EngineeringE．colialkalinephosphataseyieldschangesofcatalyticaetivity，resistancetophosphateinhibitionandheatstability，Enzymeandmicrobialtechnology，submitted)。將兩種酶切產(chǎn)物混合，用T4連接酶在14℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到E．coliSM547感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含100ug／ml氨芐青霉素(Amp)40ug／ml和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選指示EAP酶活性的藍(lán)色菌落，提取其質(zhì)粒，通過PstI酶切進(jìn)而用DNA序列分析確定插入序列的正確性；2．融合蛋白的表達(dá)與提取將新鮮轉(zhuǎn)化子細(xì)胞接種到含100ug／mlAmp的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)至600nm處光密度在0．5左右，加入Tetracycline(終濃度為0．2ug／ml(w／v))，總共培養(yǎng)20小時后離心(6000rpm，10min，4℃)收集細(xì)胞，用TMZP緩沖液(100mMTris含1×10-3MMgCl2，1×10-4MNaH2PO4，3．1×10-3MNaN3，和1×10-5MZnSO4，pH7．4)，洗滌細(xì)胞一次，離心棄上清，采用滲透壓冰凍休克法處理細(xì)胞(常規(guī)方法)，使胞間質(zhì)融合蛋白釋放到溶液中，離心(8000rpm，20min，4℃)，收集上清液，4℃保存；3．融合蛋白純化與濃縮采用Q-Sepharose離子交換柱層析法純化融合蛋白，洗脫液為TMZP緩沖液，NaCl濃度梯度為0-0．3mmol／L，流速為1-2ml／min，在280nm和405nm處分別檢測洗脫液的蛋白質(zhì)和酶活性，收集酶活性最高的洗脫組分，在FILTRONTM超濾器濃縮，超濾膜切割分子量為10，000D，融合蛋白濃縮液于-20℃貯存。4．融合蛋白純度和濃度鑒定純度鑒定采用變性SDS-PAGE電泳法，濃縮膠3．9％，分離膠12％，電流強(qiáng)度10-15mA，電泳進(jìn)行80分鐘，常規(guī)的溴酚藍(lán)染色和脫色，結(jié)果見圖3。M為小分子量蛋白質(zhì)電泳標(biāo)準(zhǔn)，融合蛋白樣品泳道顯示一條電泳純蛋白帶，分子量正確。繼而以BSA(牛血清白蛋白)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用BIO-RAD蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定樣品融合蛋白質(zhì)濃度。5．融合蛋白活性檢測及動力學(xué)測定EAP能以pNPP(p-nitrophenolatephosphate)為底物，催化pNPP生成NP(nitrophenolate)，NP在405nm處有吸收峰。反應(yīng)體系為Tris-HCl緩沖液(1．0mol／L，pH10．0)，pNPP母液濃度為20mmol／Ｌ。反應(yīng)時分別加入3份融合蛋白樣品，33份緩沖液和64份pNPP溶液，25℃搖動反應(yīng)1分鐘，于紫外分光光度計或平板讀數(shù)儀405nm處測定光吸收值，確定產(chǎn)生的NP量，并由此檢測酶活存在和計算酶比活(每毫克酶蛋白酶分鐘催化產(chǎn)生的NP摩爾數(shù))。空白對照實驗除用3份緩沖液取代融合蛋白樣品以外，其它條件均同。表1列出了融合蛋白EAP-LP-ST和融合蛋白EAP-ST的酶學(xué)動力學(xué)數(shù)據(jù)。與不含結(jié)合肽的融合蛋白EAP-ST相比，含結(jié)合肽的融合蛋白EAP-LP-ST酶比活和kcat都增加了大約20％，Km降低了40％，kcat／Km提高了1倍。這種變化意味著，鏈霉結(jié)合肽與EAP的直接融合對EAP的空間構(gòu)象有負(fù)面作用，使酶的比活下降，酶與底物親和性下降。在EAP和ST中間插入結(jié)合肽以后，增加了EAP與ST的分子間距離，使兩者互不影響，克服了上述現(xiàn)象。表1融合蛋白EAP-LP-ST和EAP-ST的酶學(xué)動力學(xué)數(shù)據(jù)*U指每毫克蛋白每分鐘水解底物pNPP的umol數(shù)。**kcat值是用二聚體分子量(分子量為94，000D)，由每個活性中心的Vmax值計算出來的。6．融合蛋白的固定化固定化是在包被鏈霉親和素的玻璃載體上進(jìn)行的，通過融合蛋白上的鏈霉結(jié)合肽與載體上鏈霉親和素的專一性結(jié)合使酶蛋白固定在載體上。取用氫氟酸腐蝕成4×6的凹井陣列玻片，每一凹井加入0．5-1．0ul鏈酶親和素(100ug／ml)，于4℃保溫4小時。蒸餾水洗三次，加3％BSA溶液(w／v)封閉4小時。水洗后，在指定的凹井中加入1ul融合蛋白樣品(10ug／ml)，保溫2小時，用蒸餾水洗脫未固定的融合蛋白，固定完畢，4℃貯藏。7．固定化融合蛋白的酶活分析為使反應(yīng)結(jié)果更加明顯，改用NBT(氯化硝基四氮唑藍(lán))／BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸)為BAP的催化底物。在凹井中加入1ulNBT／BCIP試劑(華美公司)，保溫(20-35℃)10分鐘，可見藍(lán)紫色信號出現(xiàn)。圖4中，肉眼觀察反應(yīng)后斑點藍(lán)紫色深度依次為BAP-LP-ST＞BAP-ST＞BAP(野生型)-LP-ST。通過計算機(jī)軟件對各斑點掃描進(jìn)行顏色深度定量，并進(jìn)行t-測驗，結(jié)果表明，A、C和D之間的顏色差異具有顯著性。其中，三者當(dāng)中任意兩個平均差值大于t0．01×SD(8．52)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果可實現(xiàn)定向固定，固定化酶的剩余活力高，均一性好，因此可以成為一種固定化酶的模式方法，以解決生物分子器件活性不穩(wěn)定和互換性差的問題。權(quán)利要求1.一種控制固定化酶空間取向的方法，包括下列步驟A、基因融合，選擇基因克隆和表達(dá)載體，通過基因操縱，將待固定的酶分子編碼基因、連接肽編碼序列和鏈霉結(jié)合肽基因依次拼接、構(gòu)建酶與連接肽和鏈霉結(jié)合肽的融合基因，該融合基因編碼的融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)為酶-(N)末端-[(甘氨酸-絲氨酸)n]-鏈霉結(jié)合肽，其中10≥n≥3；B、融合基因表達(dá)，將攜帶融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞，在選擇性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子，在液體培養(yǎng)基中表達(dá)出融合蛋白；C、融合蛋白制備，離心培養(yǎng)基、收集、洗滌細(xì)胞，提取蛋白粗品，然后分離、純化融合蛋白，濃縮，4℃保存；D、融合蛋白鑒定，確定融合蛋白為電泳純后，用光吸收法或BIO-RAD試劑盒測定樣品中融合蛋白濃度；E、融合蛋白酶活性檢測及動力學(xué)測定；F、融合蛋白的固定化，通過融合蛋白上的鏈霉結(jié)合肽與載體上鏈霉親和素的專一性結(jié)合使酶蛋白定向固定在載體上，其活性中心朝向反應(yīng)溶液；G、固定化融合蛋白的性能鑒定。全文摘要本發(fā)明公開了一種控制固定化酶空間取向的方法。其步驟是通過基因操縱構(gòu)建和表達(dá)酶—連接肽—鏈霉結(jié)合肽融合蛋白,制備融合蛋白純品,超濾濃縮,測定酶動力學(xué);通過鏈霉結(jié)合肽與鏈霉親和素的專一性結(jié)合,使酶分子定向固定在經(jīng)鏈霉親和素包被的固相載體上,其活性中心朝向反應(yīng)溶液。融合蛋白為“錨—鏈”分子系統(tǒng),其中鏈霉結(jié)合肽為“錨”,控制酶分子固定的方向,連接肽為“鏈”,能增加酶與鏈霉結(jié)合肽之間的分子距離,既保持兩者各自空間活動的靈活性,又減小了鏈霉結(jié)合肽與鏈霉親和素的結(jié)合反應(yīng)的空間位阻,從而大大提高定向固定效率。該方法剩余酶活高,均一性好,是定向固定酶分子的一種模式方法,適合于制作高質(zhì)量生物傳感器、生物芯片等生物器件。文檔編號C12N15/63GK1292417SQ0011595公開日2001年4月25日申請日期2000年8月11日優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日發(fā)明者張先恩,安東尼E·G·卡史,邵文海,劉虹,張治平申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所,英國倫敦帝國理工醫(yī)學(xué)院