專利名稱：鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法，屬植物保護(hù)鑒定技術(shù)。
青枯病屬于郎氏假單孢菌(Ralstonia solanacearum)，是一種重要的土傳植物維管束萎蔫病原細(xì)菌，全球分布十分廣泛，特別以熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重，一些溫帶地區(qū)也有受害報道。我國南方及東南亞地區(qū)是世界上青枯病發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，每年因此病損失近十億美元。青枯菌的寄主范圍很廣，據(jù)報道茄科的番茄、煙草、辣椒、茄子、馬鈴薯以及生姜、甘薯、花生和木本植物的油橄欖、桑樹、木麻黃等均是其寄主。美國學(xué)者Kelman(1951)首次系統(tǒng)報道了該病的發(fā)生、發(fā)展及其危害性。此后各國科學(xué)家都從各個學(xué)科開展了對該病的深入研究，經(jīng)過半個多世紀(jì)的努力，人們對該病從病理學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物物理學(xué)以及預(yù)防科學(xué)方面有了深入和統(tǒng)一的認(rèn)識，為防治青枯病的發(fā)生，提高作物產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量有了科學(xué)的依據(jù)。在植物保護(hù)的實驗研究中，青枯菌的接種技術(shù)(也稱作感染方式)也經(jīng)歷了一個較長的研究過程。認(rèn)識到青枯菌是一種土傳病菌，人們首先通過根系感染使植株接觸病菌，使其發(fā)病，觀察其發(fā)病時間遲早和長短、傷害程度，以此評價植株對該病的抵抗能力(抗病性)。通常使用方法有菌液灌根(包括傷根和不傷根)法、浸根法。所使用的菌液濃度則根據(jù)作物的抗病力或不同實驗?zāi)康?，?×106～1×108個菌/毫升不等；為了加快對植株的傷害，又研究出針刺葉脈(或葉腋)法，菌液濃度從1×106～1×107個菌/毫升不等；到目前為止，青枯菌的接菌感染技術(shù)不外乎上述三種。對方法的使用描述得較為詳細(xì)的有美國的G.C.Somodi等發(fā)展的文章《Comparison ofInoculation Techniques for Screening Tomato Genotypes for Bacterial WiltResistance》(番茄不同基因型青枯病抗性篩選的接菌感染技術(shù)比較)(Proceedings of An International Conference Taiwan，28-31 October 1992EditorsG.L.Hartman and A.C.Hayward)(國際會議論文集臺灣1992年10月28日～31日)以及王卉、任欣正發(fā)表的《青枯菌(Pseudomonas solanacearum)在番茄抗、感病品種根部的吸附、侵入和繁殖》。這三種方法一直沿用至今。作物抗青枯病育種工作者在實踐中發(fā)現(xiàn)，三種方法都存在不夠理想的地方。在自然界和生產(chǎn)實踐中，病原菌是從植株根部侵入植物體內(nèi)并由此引起發(fā)病的，根系結(jié)構(gòu)、內(nèi)在在物質(zhì)以及它與病原菌的共扼關(guān)系，可能對病菌的入侵和繁殖有關(guān)系。針刺法僅是在植株的葉片或葉液部位注入病菌，使植株在該部位首先發(fā)病，此方法的嚴(yán)重不足之處，是它不能完全反映出植物的抗病特性，因此，這一方法多用于鑒定青枯菌致病能力和寄主范圍的研究；在作物抗病育種的操作上，多采用菌液灌根、浸根法，它的特點是使植株能按照自然發(fā)生規(guī)律受到感染和發(fā)病。但是由于土壤中微生物種類有近百種，特別是有些土壤病原真菌其致病力遠(yuǎn)比青枯菌強(qiáng)得多，如番茄的立枯病、辣椒的疫病、煙草的黑莖病、茄子花生的枯萎病等，對試驗結(jié)果干擾很大，如何減少其它病原菌的干擾一直是探討的內(nèi)容之一。土壤消毒、水旱輪作等都是有效途徑，但其工作量大，準(zhǔn)備時間長，實際操作時受到限制。加上土壤的物理性狀很難一致，故重復(fù)性差。
本發(fā)明目的就是為了克服和解決現(xiàn)有鑒定植物抗青枯病能力的接菌技術(shù)方法存在針刺法不能完全反映出植物的抗病特性或菌液灌根、浸根法土壤病原真菌對試驗結(jié)果干擾太大，而對土壤消毒、水旱輪作雖可減小干擾，而存在工作量大、時間長、實際操作困難、重復(fù)性差、鑒定準(zhǔn)確性、可靠性差等的缺點和問題，研究發(fā)明一種能完全反映出自然發(fā)病客觀實際，真正能體現(xiàn)作物對青枯病抗病特性而操作上又簡單易行、試驗條件容易控制、試驗重復(fù)性好、鑒定準(zhǔn)確性可靠性高的鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的它是根據(jù)植物和青枯菌在一定的物質(zhì)條件下能夠在水中正常生長的特性，對兩個生物體的生長條件進(jìn)行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通過傷口進(jìn)入根部進(jìn)而繁殖并傷害植株；其關(guān)鍵在于(一)把青枯菌感染植物的接菌操作從在土壤里改為在水中；(二)兩個生物體從培養(yǎng)、生長到發(fā)病的這個時段都受到人工控制，做到條件完全一致；其具體準(zhǔn)備工作和技術(shù)操作流程如下(1)準(zhǔn)備工作如下①準(zhǔn)備一批盛水的容器——水培池，上面配有支撐植株生長的設(shè)施；②配備一批控制生物體生長的儀器如水族箱水泵、控溫儀(包括探頭)、定時器等，如試驗在冬季進(jìn)行應(yīng)配備發(fā)熱絲；③一批適合接菌——4～8片真葉的植株幼苗，一般每個重復(fù)20株；④植物生長營養(yǎng)液，使用時則根據(jù)植物種類的不同進(jìn)行選擇和調(diào)整；⑤達(dá)到一定濃度經(jīng)過活化的青枯菌；⑥環(huán)境條件可作人工控制的建筑物，如溫室、大棚等；(2)技術(shù)操作流程如下①往水培池注入單蒸餾水或經(jīng)過滅菌處理的自來水；②添加MS營養(yǎng)液，最終濃度為10％，每10天左右補(bǔ)充1次營養(yǎng)液；③在支撐板的孔內(nèi)栽上供接菌用的幼苗，使根系接觸營養(yǎng)液至少4厘米；④小水泵開始以10～20分鐘/每小時的泵水增氧，水溫控制在27±1.5℃，室溫28～32℃；⑤植株在上述條件下預(yù)培養(yǎng)3天，注入青枯菌，最終濃度為5×107～1×108個菌/毫升，可根據(jù)試驗需要作調(diào)整；⑥植株在接菌5天后開始表現(xiàn)發(fā)病癥狀，再按常用方法調(diào)查發(fā)病情況至試驗結(jié)束。試驗結(jié)果表明不同作物品種水培法接種青枯菌后的發(fā)病情況與田間的菌液灌根、浸根法表現(xiàn)的抗病特性比較一致。如表1所示。
表1
本發(fā)明的實用性在于(1)采用能夠使供試植株感病的接菌濃度(1×106～1×108個細(xì)菌/毫升)，以及青枯菌增殖的培養(yǎng)方法；(2)采用植株最容易感病的物候期——幼苗4～8片真葉期，實驗條件能滿足植物生長和發(fā)病的要求；(3)所使用的一切儀器、設(shè)備、用具、藥物、試劑，都可以在市場上買得到，而且價錢便宜。比如，做一個容積為140×90×10cm(水深5cm時水的容積為83升)的水培養(yǎng)池(包括有120個盛放植株的圓孔的蓋板)，所用的泡沫板和木板，僅需100元；水族箱小水泵50元/個，控溫儀200元/個，定時器60～120元/個，發(fā)熱絲20元/池，植物營養(yǎng)液約需200元/套(可用多次)，定植杯(插在蓋板孔內(nèi)支撐植株生長的有孔塑料杯)12元/池·120個，培養(yǎng)青枯菌的用具一般從事植保工作的單位都已具備，如無菌操作間或超靜工作臺，30±2℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿或試管，滅菌設(shè)備如手提式高壓滅菌鍋，檢測菌液濃度的分光光度計，比濁管等，再配上照明和控制室溫設(shè)備(如果需要的話)。這樣，總的費用僅需1500元(植保用具除外)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點和有益效果(1)應(yīng)用本發(fā)明方法實施植物抗青枯病鑒定，由于對水質(zhì)作了嚴(yán)格控制，避免了其它有害微生物的干擾，實驗準(zhǔn)確性可靠性高。它克服了土壤接菌時容易發(fā)生的其它病菌引起發(fā)病對實驗準(zhǔn)確性的影響，特別對較大規(guī)模的試驗更是如此；(2)本發(fā)明的方法糾正了針刺接菌法未能完全體現(xiàn)植物抗病特性的不足，讓植株能在模擬自然環(huán)境條件下，在與病菌的共同生活與抗?fàn)幹斜憩F(xiàn)出應(yīng)有的反應(yīng)機(jī)制；(3)本發(fā)明方法是在可以人工控制的情況下進(jìn)行的，實驗重復(fù)性好；同時時間大大縮短，并全年可多次進(jìn)行重復(fù)試驗。以上這些優(yōu)點和有益效果可以從以下實驗數(shù)據(jù)得到證明①植物根系在水中生長必須有充足的氧氣。根據(jù)規(guī)定，水中飽和溶氧量28℃時為7.75毫克/升，29℃時為7.64毫克/升。實驗中，探頭位置為入水深約30毫米時探得通氣8分鐘／小時水中溶氧量為6.80～6.98毫克/升，通氣15分鐘/小時為6.97～7.27毫克/升。每小時通氣10～20分鐘能滿足植物在水中生長的要求；②分別將4～6片真葉的番茄、煙草、辣椒幼苗移栽于MS水培液中，15天后調(diào)查株高凈增長量&#60培養(yǎng)15天后實際高度一培養(yǎng)前高度(10株平均值)&#62番茄為9.7厘米，煙草為3.8厘米，辣椒為6.1厘米，分別是土壤中生長為對照的110、95.8和101％，屬于正常；③液體培養(yǎng)的青枯菌對植物有強(qiáng)致病力，番茄的發(fā)病率分別為99.11％和91.24％，煙草為69.45％和69.20％，辣椒為84.45％和87.50％(4次重復(fù)平均)；④如表1所示的試驗結(jié)果表明，不同作物品種水培法接種青枯菌后的發(fā)病情況與田間表現(xiàn)的抗性比較一致。青枯病發(fā)病率試驗表明，應(yīng)用本發(fā)明方法完全能夠正確反映植物對青枯病的抗病特性，本發(fā)明方法更能反映事實的本質(zhì)，它的準(zhǔn)確性可靠性高、效果好、方法簡單、見效快、成本低。
本發(fā)明的實施方式比較簡單，只要按上面說明書所述的技術(shù)方案——具體的準(zhǔn)確工作和技術(shù)操作流程進(jìn)行逐步操作，便能較好地實施本發(fā)明①其實施過程中，其設(shè)備及材料均可在市場選購選用，例如水族箱水泵可選SUBMERGED LIQUID FILTER，13W；控溫儀(包括探頭)可選上海醫(yī)用儀表廠生產(chǎn)的WMZK-01型溫度指示控溫儀；定時器可選廣東佛山偉力公司生產(chǎn)的GB-60型間歇開關(guān)電器；植物生長營養(yǎng)液可選用的有很多，如N6(Nitch-6尼許培養(yǎng)基)、B5(Burger-5伯格培養(yǎng)基)、Hoagland(霍格蘭營養(yǎng)液)、Moore(摩爾營養(yǎng)液)或以MS(Murasige&Skoog)營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，按不同植物需要作適當(dāng)調(diào)整配料；無菌操作間的滅菌設(shè)備可選用上海醫(yī)用核子儀器廠生產(chǎn)的YXQ·SG41·280A型；檢測菌液濃度的分光度計可選用上?；瘜W(xué)分析儀器廠生產(chǎn)的光波長650納米的7210型；②發(fā)明人經(jīng)過多年的研究和大量試驗，按照說明書所述的技術(shù)操作流程步驟進(jìn)行操作已有很多成功的實施例。如表1所示是其實施試驗結(jié)果之一。試驗證明了本發(fā)明的先進(jìn)性、準(zhǔn)確性高、可靠性高、方法簡單、見效快、成本低。
權(quán)利要求
1.一種鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法，其特征在于它是根據(jù)植物和青枯菌在一定的物質(zhì)條件下能夠在水中正常生長的特性，對兩個生物體的生長條件進(jìn)行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通過傷口進(jìn)入根部進(jìn)而繁殖并傷害植株；其關(guān)鍵在于(一)把青枯菌感染植物的接菌操作從在土壤里改為在水中；(二)兩個生物體從培養(yǎng)、生長到發(fā)病的這個時段都受到人工控制，做到條件完全一致；其具體準(zhǔn)備工作和技術(shù)操作流程如下(1)準(zhǔn)備工作如下①準(zhǔn)備一批盛水的容器——水培池，上面配有支撐植株生長的設(shè)施；②配備一批控制生物體生長的儀器如水族箱水泵、控溫儀、定時器等，如試驗在冬季進(jìn)行應(yīng)配備發(fā)熱絲；③一批適合接菌——4～8片真葉的植株幼苗，一般每個重復(fù)20株；④植物生長營養(yǎng)液，使用時則根據(jù)植物種類的不同進(jìn)行選擇和調(diào)整；⑤達(dá)到一定濃度經(jīng)過活化的青枯菌；⑥環(huán)境條件可作人工控制的建筑物，如溫室、大棚等；(2)技術(shù)操作流程如下①往水培池注入單蒸餾水或經(jīng)過滅菌處理的自來水；②添加MS營養(yǎng)液，最終濃度為10％，每10天左右補(bǔ)充1次營養(yǎng)液；③在支撐板的孔內(nèi)栽上供接菌用的幼苗，使根系接觸營養(yǎng)液至少4厘米；④小水泵開始以10～20分鐘/每小時的泵水增氧，水溫控制在27±1.5℃，室溫28～32℃；⑤植株在上述條件下預(yù)培養(yǎng)3天，注入青枯菌，最終濃度為5×107～1×108個菌/毫升，可根據(jù)試驗需要作調(diào)整；⑥植株在接菌5天后開始表現(xiàn)發(fā)病癥狀，再按常用方法調(diào)查發(fā)病情況至試驗結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明是鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法,它是對兩個生物體的生長條件進(jìn)行人工控制,使青枯菌在水中吸附到植株根系,通過傷口進(jìn)入根部而繁殖并傷害植株。其包括具體準(zhǔn)備工作:準(zhǔn)備水培池;配備一批控制生物體生長的儀器;配備適合接菌植株幼苗;配備營養(yǎng)液,經(jīng)活化青枯菌及溫室等;其操作流程:往水培池注滅菌水→添加營養(yǎng)液→栽供接菌用幼苗→泵水增氧、控溫→注入青枯菌→調(diào)查發(fā)病情況。本發(fā)明重復(fù)性好、準(zhǔn)確性可靠性高、方法簡單、容易操作、時間短、見效快、成本低。
文檔編號C12Q1/18GK1287175SQ0011740
公開日2001年3月14日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者李乃堅, 譚炳安 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)