專利名稱：神經(jīng)系統(tǒng)基因功能行為學(xué)檢測平臺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和動物行為學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用反義核酸技術(shù)所建立的動物行為學(xué)檢測平臺，以及用該平臺檢測哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)基因功能的方法。
以美國為首的“人類基因組計劃”的DNA序列測定部分即將完成。而基因的DNA序列信息僅是基因資源開發(fā)的第一步，更重要的是基因的功能信息，特別是與人類重大疾病和重要生理功能有關(guān)的基因信息，有著巨大的應(yīng)用與開發(fā)價值。一個以基因組功能研究為主要內(nèi)容的功能基因組學(xué)(Functional Genomics)時代即將到來。
我國人類基因組研究近年來已取得重大的進(jìn)展，隨著研究的深入，建立大規(guī)模功能基因篩選系統(tǒng)已成為亟待解決的問題，這對于使我國的人類基因組研究及時轉(zhuǎn)入功能基因組研究階段將發(fā)揮重要的作用。另一方面，隨著人類疾病基因的定位克隆，也需要功能研究來驗(yàn)證。而基因功能方面的研究在國內(nèi)開展還不多，大部分是在細(xì)胞水平上的研究。國內(nèi)外在動物整體和活體水平上開展的功能研究工作就更為罕見。
由于基因的功能常常受到時間(如不同的發(fā)育階段)、空間(如位于不同的組織)和基因相互作用等多種因素的影響，因此要闡明某一基因的功能是非常困難的。目前，本領(lǐng)域還缺乏研究未知基因功能的有效手段。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的研究基因功能的有效方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種確定哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)基因的功能的方法，它包括步驟(1)提供一基因的反義核酸片段，(2)將所述的反義核酸片段定量注射到動物的側(cè)腦室，(3)觀察注射了反義核酸片段的動物的行為，并與對照組動物比較，從而確定該基因的功能。
較佳地，所述動物是實(shí)驗(yàn)小鼠。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，還設(shè)置了用于比較的對照組動物，該對照組動物是側(cè)腦室注射了生理鹽水和/或隨機(jī)序列核酸的動物。
在說明書附圖中，


圖1A和1B分別顯示了對第13號基因(No.13)，在注射反義核酸后進(jìn)行跨格行為和直立行為試驗(yàn)的結(jié)果。
圖2A和2B分別顯示了對第8號基因(No.8)，在注射反義核酸后24小時和48小時進(jìn)行步下行為測試的結(jié)果。
圖3顯示了對第18號基因(No.18)，在注射反義核酸后進(jìn)行甩尾行為測試的結(jié)果。
本發(fā)明的發(fā)明人，經(jīng)過多年研究，建立了以哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的基因功能規(guī)?；芯康膭游镄袨閷W(xué)檢測平臺，將反義核酸技術(shù)與動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，用于大量初步篩選、鑒定新基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動相關(guān)的功能，從而為這些相關(guān)基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的原理在于，將待研究基因的反義核酸片段注射到動物的腦中的特定部位，利用反義核酸與相應(yīng)基因mRNA的結(jié)合作用，抑制相應(yīng)蛋白的表達(dá)。通過觀察實(shí)驗(yàn)動物在行為方面的變化，確定所述基因的功能。
在本發(fā)明方法中，首先是提供感興趣基因的反義核酸序列。所述的感興趣的基因可以是任何已知的基因，也可以是現(xiàn)在未知但將來可能發(fā)現(xiàn)的任何基因。
用于本發(fā)明的這些反義核酸序列可以用人工合成的方法制備。
在本發(fā)明中，對于反義核酸片段的的長度沒有特別的限制，但通常反義核酸片段的長度為10-100bp，較佳地為15-50bp，更佳地為20-25bp。所用的反義核酸片段可以是一種或多種反義核酸片段，如果使用多種反義核酸片段，各反義核酸片段之間可以不存在重迭區(qū)域，也可存在重迭區(qū)域。
反義核酸片段所對應(yīng)的區(qū)域通常是所選取基因cDNA序列的翻譯起始區(qū)或其它區(qū)域。
本發(fā)明的第二步驟是將反義核酸定量注射到動物的腦中的特定部位。在本發(fā)明中，優(yōu)選的注射部位是側(cè)腦室。選擇側(cè)腦室的優(yōu)點(diǎn)在于反義核酸能迅速地流向腦的各部位。
反義核酸片段的注射量通常為0.25-4微克/實(shí)驗(yàn)動物/次，較佳地為0.5-2微克/實(shí)驗(yàn)動物/次，更佳地為約1微克/實(shí)驗(yàn)動物/次。
適用于本發(fā)明的動物可以是哺乳動物，例如嚙齒動物、靈長動物等，較佳地選用的動物是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物，更佳地選用的動物是實(shí)驗(yàn)小鼠。
在本發(fā)明中，為了更好地進(jìn)行比較，宜設(shè)置了用于比較的對照組動物。通常，對照動物是側(cè)腦室注射了生理鹽水和/或隨機(jī)序列核酸的動物。
由于將反義核酸準(zhǔn)確地注射到動物的側(cè)腦室是本發(fā)明的關(guān)鍵步驟之一，因此為了確保注射部位的準(zhǔn)確，宜包括檢測注射部位的步驟。該步驟是在所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后在反義核酸注射部位注入藍(lán)墨水，并做腦切片檢查，以確注射部位的準(zhǔn)確性。注射反義核酸片段的次數(shù)沒有特別限制，通常為1-3次，較佳地為3次。
在本發(fā)明第三個步驟是研究和比較實(shí)驗(yàn)動物的行為?？捎糜诒景l(fā)明的動物行為包括任何可以反映動物腦發(fā)育水平的行為。應(yīng)理解，對于不同的實(shí)驗(yàn)動物，所選用的動物行為可有所不同。例如，對于小鼠而言，代表性的動物行為包括(但并不限于)食物攝取行為、曠場行為、甩尾行為、步下行為。其中，各小鼠的行為學(xué)檢測模型為考察日常代謝能力的攝食量，考察Locomotion activity(移動)的曠場行為，考察疼痛閾值的甩尾試驗(yàn)和考察記憶能力的步下法實(shí)驗(yàn)。
a.食物攝取行為例如可觀察動物的每日攝食量，即每日測定實(shí)驗(yàn)動物(如小鼠)的體重，用代謝籠測定動物每日的攝食量。
b.曠場行為(Open Field Behavior)[陳雙雙，管林初，鮑世民，金玫蕾，四種不同品系小鼠曠場行為和記憶的比較研究，心理科學(xué)1994年第17卷第1期，39-41頁]將實(shí)驗(yàn)小鼠放置于26×16×13cm的長方形實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)，底部均分為6格(2×3)，分別觀察并記錄3分鐘內(nèi)小鼠行走的格數(shù)和直立的次數(shù)。為了減少小鼠剛進(jìn)入新環(huán)境時行為與正常狀態(tài)的差異，參照有關(guān)文獻(xiàn)改進(jìn)為連續(xù)測定4次，每次間隔3分鐘，取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。
c.甩尾行為甩尾行為可用甩尾試驗(yàn)(Tail Flick Latency)[Chapman CR，Casey KL，Dubner R，F(xiàn)oley RH，and Reading AE，Pain measurementan overview.Pain 1985；221-31；3.D.Mitchell and R.F.Hellon，Neuronal and behavioralresponses in rats during noxious stimulation of the tail.Proc.R.Soc.Lond.197(1977)169-194.]進(jìn)行測試用一塊軟布輕輕裹住實(shí)驗(yàn)小鼠的身軀僅露出尾巴，使之不能逃脫又不至于太難受。將鼠尾尖端約1.5em部分浸入53℃的水浴內(nèi)，同時用秒表測出鼠尾從浸入到甩出水面的時間(精確到0.1秒)。連續(xù)做4次，每次之間間隔30秒。取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。
d.步下行為步下行為可用步下法(Step Down Test)[陳雙雙，管林初，鮑世民，金玫蕾，四種不同品系小鼠曠場行為和記憶的比較研究，心理科學(xué)1994年第17卷第1期，39-41頁]進(jìn)行測試實(shí)驗(yàn)裝置為20×20×30cm的透明塑料箱，箱底為金屬電路板，左角放置一個8×8×1.5cm的平臺為安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行訓(xùn)練將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由活動1分鐘，然后將小鼠輕輕趕上小平臺(一般情況下小鼠很快會從平臺上下來)，記錄小鼠從完全登上小平臺到下來時的間隔秒數(shù)(潛伏期)。連續(xù)重復(fù)3次后，再將小鼠趕上小平臺，并箱底的電路板立即通電(50V，0.5mA)。當(dāng)小鼠再次跳下小平臺受到電擊后，即跳回平臺以逃避電擊，此時則視為訓(xùn)練完畢，將小鼠取出放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練后24小時再將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)的小平臺上，箱底的電路板不通電，記錄小鼠從放上小平臺到下來的間隔期秒數(shù)。訓(xùn)練后48小時再同樣記錄一次間隔期時間。為了更好地觀察和評價動物的記憶行為，參照有關(guān)文獻(xiàn)增加了訓(xùn)練次數(shù)和48小時后的觀察。
本發(fā)明人在構(gòu)建了上述小鼠行為學(xué)檢測平臺的基礎(chǔ)上，初篩了最近國際上發(fā)現(xiàn)的未知功能或功能不明確的20個基因，從中分析該行為學(xué)檢測平臺在基因功能篩選中的作用，得到了令人滿意的結(jié)果。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，(比如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件)，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例材料成年大鼠腦cDNA文庫為Gibco公司產(chǎn)品；反義核酸由上海生工公司合成；進(jìn)口Hamilton微量注射器，國產(chǎn)不銹鋼代謝籠、水浴鍋、步下測試儀等。
實(shí)驗(yàn)動物近交系BALB/c小鼠，雄性，20-22g，清潔級，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。
實(shí)施例1反義核酸的設(shè)計與合成以成年大鼠腦cDNA文庫為基礎(chǔ)，利用差異篩選方法建立了一個大鼠腦低豐度表達(dá)基因的cDNA亞庫。結(jié)合隨機(jī)測序與生物信息學(xué)分析，從上述低豐度表達(dá)基因亞庫中挑選出在大鼠腦內(nèi)表達(dá)的20個基因(基因編號1-20)，其中包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、軸突生長及神經(jīng)元活動相關(guān)蛋白等不同類型的基因。
利用生物信息學(xué)方法，在所選取基因cDNA序列的翻譯起始區(qū)或其它區(qū)域挑選長度為20的核苷酸序列，設(shè)計并合成反義核酸。
隨機(jī)序列核酸(scramble)的設(shè)計是將該序列經(jīng)核酸數(shù)據(jù)庫搜尋無同源性序列后所確定。
No.13基因的反義核酸序列5’ctg tgg tcc ata ata gac at 3’隨機(jī)序列核酸序列5’gac tga cat gcg att gag ct 3’實(shí)施例2反義核酸動物活體注射每種反義核酸用10-18只小鼠，生理鹽水對照組和隨機(jī)序列核酸對照組各用10-20只小鼠。將不同基因的反義核酸溶于生理鹽水至終濃度0.25μg/μl，分別定量注入經(jīng)麻醉后的小鼠側(cè)腦室(每次4μl，每1-2天注射1次，共注射3次)，并設(shè)生理鹽水組和隨機(jī)序列核酸組作為對照。
每組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，在反義核酸注射部位注入藍(lán)墨水，并做腦切片檢查，以確認(rèn)注射部位的準(zhǔn)確性。
實(shí)施例3小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)1、小鼠行為的測定方法在該實(shí)施例中，對動物的食物攝取行為、曠場行為、甩尾行為、步下行為進(jìn)行了觀察。
a.食物攝取行為動物的每日攝食量，即每日測定實(shí)驗(yàn)小鼠的體重，用代謝籠測定小鼠每日的攝食量。
b.曠場行為(Open Field Behavior)[陳雙雙，管林初，鮑世民，金玫蕾，四種不同品系小鼠曠場行為和記憶的比較研究，心理科學(xué)1994年第17卷第1期，39-41頁]將實(shí)驗(yàn)小鼠放置于26×16×13cm的長方形實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)，底部均分為6格(2×3)，分別觀察并記錄3分鐘內(nèi)小鼠行走的格數(shù)和直立的次數(shù)。為了減少小鼠剛進(jìn)入新環(huán)境時行為與正常狀態(tài)的差異，參照有關(guān)文獻(xiàn)改進(jìn)為連續(xù)測定4次，每次間隔3分鐘，取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。
c.甩尾行為甩尾行為可用甩尾試驗(yàn)(Tail Flick Latency)[Chapman CR，Casey KL，Dubner R，F(xiàn)oley RH，and Reading AE，Pain measurementan overview.Pain 1985；221-31；3.D.Mitchell and R.F.Hellon，Neuronal and behavioralresponses in rats during noxious stimulation of the tail.Proc.R.Soc.Lond.197(1977)169-194.]進(jìn)行測試用一塊軟布輕輕裹住實(shí)驗(yàn)小鼠的身軀僅露出尾巴，使之不能逃脫又不至于太難受。將鼠尾尖端約1.5cm部分浸入53℃的水浴內(nèi)，同時用秒表測出鼠尾從浸入到甩出水面的時間(精確到0.1秒)。連續(xù)做4次，每次之間間隔30秒。取后3次的數(shù)據(jù)計算平均數(shù)用于統(tǒng)計。
d.步下行為步下行為可用步下法(Step Down Test)[陳雙雙，管林初，鮑世民，金玫蕾，四種不同品系小鼠曠場行為和記憶的比較研究，心理科學(xué)1994年第17卷第1期，39-41頁]進(jìn)行測試實(shí)驗(yàn)裝置為20×20×30cm的透明塑料箱，箱底為金屬電路板，左角放置一個8×8×1.5cm的平臺為安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行訓(xùn)練將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由活動1分鐘，然后將小鼠輕輕趕上小平臺(一般情況下小鼠很快會從平臺上下來)，記錄小鼠從完全登上小平臺到下來時的間隔秒數(shù)(潛伏期)。連續(xù)重復(fù)3次后，再將小鼠趕上小平臺，并箱底的電路板立即通電(50V，0.5mA)。當(dāng)小鼠再次跳下小平臺受到電擊后，即跳回平臺以逃避電擊，此時則視為訓(xùn)練完畢，將小鼠取出放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練后24小時再將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)的小平臺上，箱底的電路板不通電，記錄小鼠從放上小平臺到下來的間隔期秒數(shù)。訓(xùn)練后48小時再同樣記錄一次間隔期時間。為了更好地觀察和評價動物的記憶行為，參照有關(guān)文獻(xiàn)增加了訓(xùn)練次數(shù)和48小時后的觀察。
2、小鼠行為學(xué)檢測平臺的建立根據(jù)所測基因的產(chǎn)物表達(dá)的位置(細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面)，小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的周期為a.(細(xì)胞內(nèi))第1日注射反義核酸；第2日注射反義核酸；第3日注射反義核酸，約3小時后進(jìn)行步下法訓(xùn)練；第4日曠場行為試驗(yàn)，甩尾試驗(yàn)，間隔約2小時后進(jìn)行步下法試驗(yàn)；第5日步下法試驗(yàn)，結(jié)束后在反義核酸注射部位注入藍(lán)墨水，并做腦切片檢查，以確認(rèn)注射部位的準(zhǔn)確性。
b.(細(xì)胞表面)第1日注射反義核酸；第3日注射反義核酸；
第5日注射反義核酸，約3小時后進(jìn)行步下法訓(xùn)練；第6日曠場行為試驗(yàn)，甩尾試驗(yàn)，間隔約2小時后進(jìn)行步下法試驗(yàn)；第7日步下法試驗(yàn)，結(jié)束后在反義核酸注射部位注入藍(lán)墨水，并做腦切片檢查，以確認(rèn)注射部位的準(zhǔn)確性。
3、統(tǒng)計學(xué)分析將實(shí)驗(yàn)組的行為學(xué)特征與對照組比較，并以T檢驗(yàn)法進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計分析[周懷梧，倪永興主編，醫(yī)藥應(yīng)用概率統(tǒng)計，百家出版社，1990年2月。]。
4、結(jié)果在本實(shí)施例中，共進(jìn)行了20種不同基因反義核酸的實(shí)驗(yàn)，每種反義核酸使用10-18只小鼠；對照組為隨機(jī)序列核酸以及生理鹽水，每組10-20只小鼠。隨機(jī)序列核酸組與生理鹽水組在各個行為學(xué)模型上均無顯著差異，與生理鹽水組同為對照組。20種反義核酸及兩種對照組共使用實(shí)驗(yàn)小鼠266只。
初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)T檢驗(yàn)后顯示在20種反義核酸中有14種與對照組在不同的行為學(xué)模型上存在不同程度的差異(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，其中差異非常顯著的(p＜0.001)有5種，具體結(jié)果見表1。表1 T檢驗(yàn)的結(jié)果 sal生理鹽水對照組scrm隨機(jī)序列核酸對照組0無差異*有差異P＜0.05**差異顯著P＜0.01***差異極顯著P＜0.001表2 總結(jié)了與對照組有差異的反義核酸具體與哪些行為學(xué)模型有關(guān)。
表2 反義核酸與行為之間的關(guān)聯(lián)結(jié)果
這14種反義核酸中，與曠場行為中的跨格行為(Step across)有關(guān)的有5種，與曠場行為中的直立行為(Standing up)有關(guān)的有11種，而與跨格和直立均有關(guān)的有4種；與痛覺(甩尾)試驗(yàn)有關(guān)的有5種，與記憶(步下法試驗(yàn))有關(guān)的有2種。
將其中比較典型的No.13、No.8、和No.18基因的測試結(jié)果，分別以
圖1-圖3來表示。在No.13基因的測試中，實(shí)驗(yàn)組的跨格行為和直立行為均明顯少于2個對照組。其中跨格行為p＜0.05，直立行為p＜0.001，差異極其顯著。在No.8基因的測試中，實(shí)驗(yàn)組的步下法結(jié)果明顯少于2個對照組，尤其是24小時測試，與對照組差異極其顯著(p＜0.001)。No.18基因的測試結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組的甩尾時間比對照組的甩尾時間短，且統(tǒng)計結(jié)果為有差異(p＜0.05)。
討論建立整體動物行為學(xué)檢測和功能阻斷相結(jié)合的基因功能篩選方法是“人類基因組”研究中，尋找新基因功能的一個比較有效的篩選策略。本發(fā)明的篩選策略的實(shí)施，能為被測基因與整體功能之間的因果關(guān)系提供重要信息，具有指導(dǎo)基因功能研究向縱深發(fā)展的實(shí)際意義。對于動物整體來說，為了存活，新陳代謝，學(xué)習(xí)記憶，感覺(受)，活動能力，生長、睡眠等都是綜合性指標(biāo)，不管哪些部分生理功能發(fā)生變化，均可能在這幾大類指標(biāo)中反映出來。在此基礎(chǔ)上，其它方面的動物行為學(xué)檢測指標(biāo)還可以增加。得到這些信息能提供一個向縱深研究具體基因功能的整體功能信息平臺，推動各基因功能研究向縱深發(fā)展。同時，動物行為學(xué)檢測平臺的建立，也為轉(zhuǎn)基因動物和基因剔除動物的表型研究這一困惑國內(nèi)外研究工作者多年的難題，提供了技術(shù)方法系統(tǒng)。
利用反義核酸技術(shù)對基因表達(dá)進(jìn)行阻斷，再通過對動物行為的觀察來研究基因功能，是目前國際上的較為流行的實(shí)驗(yàn)方法[Pasternak GW，Standifer KM，Mapping of opioid receptors using antisense oligodeoxynucleotidescorrelatingtheir molecular biology and pharmacology.Trends Pharmacol Sci 1995 Oct；16(10)344-350]。為了提高實(shí)驗(yàn)的效率以利于較大規(guī)模的篩選，作者采用了個體較小，品系眾多，與人類又具有遺傳同源性的小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物；使用Hamilton微量注射器能精確定量并連續(xù)注射，比使用微型滲透壓泵省時還能降低成本。在初篩的20個基因中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有14種與對照組在不同的行為學(xué)模型上存在不同程度的差異，差異非常顯著的有5種，說明了這一動物行為學(xué)檢測平臺的可用性。
實(shí)驗(yàn)小鼠存在很多不同品系[Joan Staats，Standardized Nomenclature forInbred Strains of MiceEight Listing，CANCER RESEARCH 45，945-977，March19851，它們的來源和遺傳背景都有著不同程度的差異，在行為學(xué)上也表現(xiàn)不一[Jeffrey S.Mogil，Sonya G.Wilson，Karine Bon，Seo Eun Lee，Kyungsoon Chung，Pnina Raber，Jeanne O.Pieper，Heather S.Hain，John K.Belknap，Lawrence Hubert，Greg I.Elmer，Jin Mo Chung，Marshall Devor，Heritability of nociception IResponses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception，Pain 80(1999)67-82；8.Jeffrey S.Mogil，Sonya G.Wilson，Karine Bon，Seo Eun Lee，KyungsoonChung，Pnina Raber，Jeanne O.Pieper，Heather S.Hain，John K.Belknap，LawrenceHubert，Greg I.Elmer，Jin Mo Chung，Marshall Devor，Heritability of nociception II′Types′of nociception revealed by genetic correlation analysis Pain 80(1999)83-93]。如果能進(jìn)一步用不同品系重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)而所得結(jié)果類似，就更說明了這一結(jié)果的可信性；反之，如不同品系重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果不同，就為探索什么品系的小鼠比較適合于什么樣的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)提供可能性。
建立功能模型篩選基因功能用動物行為學(xué)作起點(diǎn)，能從整體和活體動物的水平上全面觀察基因的功能；一旦發(fā)現(xiàn)行為學(xué)變化，能比較有意義地指導(dǎo)進(jìn)一步的機(jī)理研究。雖然其本身不是直接研究分子機(jī)理，但能為將來的科學(xué)研究工作提出因果關(guān)系的基礎(chǔ)。在本研究所用的20種反義核酸中，與對照組在不同行為學(xué)模型中存在顯著差異的比例比較高，這說明了初篩的策略是有效的和可行的；另一方面，也促使研究者對這些基因展開進(jìn)一步深入的研究。如No.1和No.8基因在步下法測試中表現(xiàn)顯著性差異，就可以多設(shè)計一些與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的行為學(xué)模型進(jìn)行復(fù)篩，并進(jìn)一步從分子水平上探索這些基因在學(xué)習(xí)記憶中的功能。
實(shí)驗(yàn)動物學(xué)是動物學(xué)中的一個重要分支學(xué)科，如能在基因功能研究方面發(fā)揮作用，將成為連接動物學(xué)和遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)的橋梁。這種交叉又以動物行為學(xué)作為主要的研究方式，將使古老的動物行為學(xué)研究方法加入嶄新的內(nèi)涵，其研究方式也將充滿了現(xiàn)代化的內(nèi)容，不僅為神經(jīng)系統(tǒng)新基因的功能研究提供了一個向縱深發(fā)展的新起點(diǎn)，而且無疑對動物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展也具有相當(dāng)重大的意義。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種確定哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)基因功能的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供一基因的反義核酸片段，(2)將所述的反義核酸片段定量注射到動物的側(cè)腦室，(3)觀察注射了反義核酸片段的動物的行為，并與對照組動物比較，從而確定該基因的功能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述動物是實(shí)驗(yàn)小鼠。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對照動物是側(cè)腦室注射了生理鹽水和/或隨機(jī)序列核酸的動物。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的動物行為選自下組食物攝取行為、曠場行為、甩尾行為、步下行為。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反義核酸的長度為10-100bp。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括(4)檢測注射部位的步驟即在反義核酸注射部位注入藍(lán)墨水，并做腦切片檢查，以確認(rèn)注射部位的準(zhǔn)確性。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反義核酸片段的注射量為0.25-4微克/實(shí)驗(yàn)動物/次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)基因功能的方法,它包括步驟:(1)提供一基因的反義核酸片段,(2)將所述的反義核酸片段定量注射到動物的側(cè)腦室,(3)觀察注射了反義核酸片段的動物的行為,并與對照組動物比較,從而確定該基因的功能。本發(fā)明的神經(jīng)系統(tǒng)基因功能行為學(xué)檢測平臺,是大規(guī)模研究未知基因功能的有力手段。
文檔編號C12Q1/68GK1335407SQ0011951
公開日2002年2月13日 申請日期2000年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月25日
發(fā)明者金玫蕾, 景乃禾, 李葆明, 于雷, 趙國屏 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心