專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)分子伴侶的共分泌制備天然折疊的和分泌的蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種在原核細(xì)胞中表達(dá)后通過(guò)分子伴侶的共分泌制備一種水溶性的，自然折疊和分泌的多肽。原核生物中蛋白質(zhì)的合成，也稱(chēng)作翻譯，發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上。當(dāng)重組DNA在原核宿主生物中表達(dá)時(shí)，通常需要將這一過(guò)程中得到的重組基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜分泌至內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)腔中。然后，分泌的蛋白質(zhì)可通過(guò)例如滲透沖擊從周質(zhì)腔中釋放進(jìn)培養(yǎng)基中。這一方法的缺點(diǎn)是分泌的多肽常常不形成天然的，具有生物活性的構(gòu)型(Hockney，TJBTECH12(1994)456-463)。最近，分子伴侶和折疊催化劑，例如肽基脯氨酸順/反異構(gòu)酶或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Glockshuber等，EP-A0510658)被用于提高天然重組蛋白質(zhì)在體內(nèi)折疊時(shí)的產(chǎn)率(Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.66(1997)197-238)。在某些情況下，這可引起表達(dá)的極大的改善，例如，對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO；Goloubinoff等，Nature337(1989)44-47)，人類(lèi)膠原酶原(Lee&Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852)或來(lái)自大鼠的神經(jīng)元氧化氮合成酶(Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)8428-8432)即屬于這種情況。在這些例子中，來(lái)自大腸桿菌的GroEL/ES或者DnaK系統(tǒng)在胞質(zhì)中被共過(guò)量表達(dá)。當(dāng)重組蛋白質(zhì)被分泌至大腸桿菌的周質(zhì)中時(shí)也對(duì)分子伴侶的共表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。但是，在這種情況下，僅對(duì)分子伴侶的胞質(zhì)過(guò)表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估，以使向周質(zhì)中的分泌最適化(Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.210(1995)524-529；Sato等，Bioehem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264；Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60)。以前在大腸桿菌中的共表達(dá)的實(shí)驗(yàn)集中在折疊-輔助蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI；Glockshuber等，EP-A0510658)或者肽基脯氨酸順/反異構(gòu)酶(Knappik等，Bio/Technology11(1993)77-83；Qiu等，Appl.Environm.Microbiol.64(1998)4891-4896和Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607)或者Skp蛋白質(zhì)(Hayhurst和Harris，ProteinExpr.Purif.15(1999)336-343)。本發(fā)明的目的是提供一種在原核細(xì)胞中表達(dá)后制備一種水溶性的，自然折疊的多肽的方法，這可以一種簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行，不需要費(fèi)力的體外后處理，例如包含體的溶解，還原和復(fù)性。本發(fā)明的目的通過(guò)一種制備含有兩個(gè)或幾個(gè)通過(guò)二硫鍵連接的半胱氨酸的天然折疊的真核多肽的方法，該方法包括a)培養(yǎng)原核細(xì)胞，其中，所說(shuō)的原核細(xì)胞含有一種表達(dá)載體，該載體編碼所說(shuō)的在N-末端含有一種原核細(xì)胞信號(hào)序列的多肽，b)將該多肽分泌至周質(zhì)中或培養(yǎng)基中，c)切割信號(hào)序列，并從周質(zhì)或培養(yǎng)基中分離該多肽。其中，在所說(shuō)的原核細(xì)胞中還表達(dá)一種編碼一種分子伴侶的核酸，并且該分子伴侶被分泌至周質(zhì)中，其先決條件是，培養(yǎng)是在沒(méi)有精氨酸或一種通式ⅠR2-CO-NRR1(Ⅰ)的化合物的存在下進(jìn)行的，其中，R和R1表示氫或一種飽和的或不飽和的支鏈或非支鏈的C1-C4烷基鏈和R2表示氫，NHR1或一種飽和的或不飽和的支鏈或非支鏈的C1-C3烷基鏈。在這一方法中，優(yōu)選該分子伴侶是過(guò)表達(dá)的。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含有SH基團(tuán)的還原硫醇(thiol)試劑被額外加入在用于培養(yǎng)原核細(xì)胞的培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，這進(jìn)一步提高重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。優(yōu)選加入0.1-15mmol/l的硫醇試劑。按照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“硫醇試劑”或者表示具有SH基團(tuán)的還原(還原的)硫醇試劑，或者表示具有SH基團(tuán)的還原硫醇試劑與具有二硫鍵基團(tuán)的氧化硫醇試劑的混合物。優(yōu)選的物質(zhì)為還原的谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱胺，β-巰基乙醇以及類(lèi)似的化合物。這種硫醇試劑可單獨(dú)使用，也可以混合物的形式使用。每分子具有單個(gè)SH基團(tuán)的硫醇試劑例如谷胱甘肽(GSH)特別適用。當(dāng)重組DNA在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)已知諸如谷胱甘肽的硫醇試劑可改善天然折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率(Glockshuber等，EP-AO510658)。本發(fā)明中，分子伴侶是指可防止其它的非天然蛋白質(zhì)在體內(nèi)聚集并促進(jìn)它們的天然構(gòu)型的形成的蛋白質(zhì)(綜述Silver和Way，Cell74(1994)5-6和Cyr等，TIBS19(1994)176-181)。分子伴侶在現(xiàn)有技術(shù)中被用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，防止它們聚集和失活(Buchner等，EP-A0556726A1)。優(yōu)選使用HSP40型的ATP-依賴(lài)性分子伴侶(分子量約為40kDa)或者小熱休克蛋白質(zhì)(sHSP)。DnaJ是一種40kDa的熱休克蛋白質(zhì)，它存在于大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中并且是所謂的Hsp70分子伴侶系統(tǒng)的一部分(Bukau，B.&Horwich，A.，Cell92(1998)351-366)。DnaK(Hsp70)和GrpE也屬于這一系統(tǒng)。特定的蛋白通過(guò)DnaK系統(tǒng)在一種ATP-依賴(lài)性過(guò)程中被折疊成天然構(gòu)型(Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144；Langer等，Nature356(1992)683-689)。這一系統(tǒng)另外還需要ATP將變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊。DnaJ也在不存在DnaK和ATP的情況下防止非天然蛋白質(zhì)的聚集，并介導(dǎo)可折疊狀態(tài)(Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144)。優(yōu)選含有氨基酸1-108的DnaJ的N-末端片段(下文稱(chēng)作J-區(qū)域)的共分泌(Kelley，TIBS23(1998)222-227)。負(fù)責(zé)與DnaK相互作用的J-區(qū)域和一種G/F-富集區(qū)域位于這一區(qū)域中(Wall等，J.Biol.Chem.270(1995)2139-2144)。已有實(shí)驗(yàn)顯示DnaJ在胞液中的共表達(dá)可導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率的提高(Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Techno1.62(1998)1205-1210)。Hsp25(例如來(lái)自小鼠)是一個(gè)小熱休克蛋白質(zhì)的代表(sHsps；Gaestel等，Eur.J.Biochem.179(1989)209-213)，它是一種遍在類(lèi)型的分子伴侶。這些蛋白質(zhì)的分子量在15和30kDa之間。在熱休克過(guò)程中，細(xì)胞中有相當(dāng)量的sHsp聚集(高達(dá)細(xì)胞總蛋白的1％-Arrigo&Landry(1994)，InMorimoto(Ed.)TheBiologyofHeatShockProteinsandMolecularChaperones，ColdSpringHarbourPress，335-373)。與DnaJ蛋白質(zhì)一樣，sHsp具有防止非天然蛋白質(zhì)聚集并將它們保持在可折疊的狀態(tài)的功能(Jakob等，J.Bio1.Chem.268(1993)1517-1520；Ehrnsperger等，F(xiàn)MBOJ.16(1997)221-229)。所有的sHsp具有與真核細(xì)胞的眼睛玻璃體蛋白質(zhì)αA和αB-晶體蛋白同源性的區(qū)域，αA和αB-晶體蛋白自身是sHsp家族的成員(Jakob和Buchner，TIBS19(1994)205-211)。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”是指分泌的蛋白質(zhì)，例如DnaJ和Hsp25的表達(dá)與相應(yīng)的原核宿主生物體中的野生型表達(dá)相比表達(dá)的提高(優(yōu)選至少提高100％)。這種過(guò)表達(dá)可在例如這些基因(蛋白質(zhì)的，分子伴侶的和/或信號(hào)肽的)在強(qiáng)的原核的，優(yōu)選可誘導(dǎo)的，表達(dá)信號(hào)(例如lac或者T7啟動(dòng)子或者它們的衍生物)的控制之下得到。包括重組DNA上的調(diào)節(jié)區(qū)域(啟動(dòng)子和終止子)的用于多肽(蛋白質(zhì))過(guò)表達(dá)的分泌構(gòu)建體優(yōu)選被整合進(jìn)一種載體中，該載體還編碼精氨酸-tRNAAGA/AGG，這在原核細(xì)胞中是罕見(jiàn)的，或者它與編碼這種tRNA的載體共表達(dá)(Brinkmann等，Gene85(1989)109-114)。這能夠使各種蛋白質(zhì)共過(guò)表達(dá)至細(xì)菌的周質(zhì)中以及使這種罕見(jiàn)的tRNAArgAGA/AGG轉(zhuǎn)錄，這導(dǎo)致所需的蛋白質(zhì)在細(xì)菌宿主生物中合成的提高。編碼該多肽和分子伴侶的核酸可被定位在一個(gè)載體或兩個(gè)不同的載體上。本發(fā)明中的原核信號(hào)序列是指一種來(lái)源于原核細(xì)胞的核酸片段，優(yōu)選來(lái)源于格蘭氏陰性細(xì)菌，并保證與該信號(hào)肽結(jié)合的蛋白質(zhì)可穿過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜。結(jié)果，該蛋白質(zhì)位于周質(zhì)中或細(xì)胞上清液中。這種信號(hào)序列通常具有18-30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，描述于，例如，Murphy&BeckwithExportofProteinstotheCellEnvelopeinEscherichiacoli，以及Neidhardt等(editors)Escherichiacoli和Salmonella，SecondEdition，Vol.1，ASMPress，Washington，1996，p.967-978。細(xì)菌信號(hào)序列的切除可發(fā)生在例如一個(gè)Ala-X-Ala序列之后(vonHeijne等，J.Mol.Biol.184(1985)99-105)。細(xì)菌信號(hào)肽酶的結(jié)構(gòu)描述于Paetzel等，Nature396(1998)186-190。優(yōu)選使用通過(guò)位于原核細(xì)胞的周質(zhì)中的蛋白酶從所需的蛋白質(zhì)再次切除的信號(hào)序列?；蛘撸@種蛋白酶可被加入在細(xì)胞上清液中或者加入在分離的蛋白質(zhì)中來(lái)切除信號(hào)序列。本發(fā)明的方法可改善大量的真核蛋白質(zhì)的異源性表達(dá)，例如蛋白酶，干擾素，蛋白質(zhì)激素，抗體或者它們的片段。該方法特別適用于在天然狀態(tài)下含有至少兩個(gè)通過(guò)二硫鍵相連的半胱氨酸的蛋白質(zhì)的異源性表達(dá)，特別是當(dāng)它們不具有在N-末端融合的原核信號(hào)序列，以及在它們的原核表達(dá)過(guò)程中形成了不溶性的包含體的情況下。該方法特別適用于在天然狀態(tài)下含有多于5個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)。這樣一種蛋白質(zhì)是例如一種重組血纖蛋白溶酶原激活物(下文稱(chēng)作rPA，Martin等，Cardiovasc.DrugRev.11(1993)299-311，US-PatentNo.5，223，256)。rPA具有9個(gè)二硫鍵，這9個(gè)二硫鍵在大腸桿菌的還原性胞液中不會(huì)形成。蛋白質(zhì)和分子伴侶在周質(zhì)中的定位是通過(guò)與可穿過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜的信號(hào)肽的“可操縱連接”保證的。為了從大腸桿菌中分離功能形式的分泌性rPA蛋白，將來(lái)自質(zhì)粒pA27fd7(Kohnert等，ProteinEngineering5(1992)93-100)的這種蛋白質(zhì)的基因通過(guò)基因工程方法融合到格蘭氏陰性細(xì)菌的原核信號(hào)序列上，例如融合到來(lái)自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的果膠酸酶(PelB)的信號(hào)序列上。基因融合是通過(guò)克隆進(jìn)載體pET20b(+)(NovagenInc.，Madison，USA)構(gòu)建的。結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)是在T7啟動(dòng)子的控制之下。融合蛋白質(zhì)中存在的信號(hào)序列造成向周質(zhì)中的分泌。信號(hào)序列在分泌的過(guò)程中或之后被位于內(nèi)膜中的肽酶切割。然后分泌的蛋白質(zhì)可在周質(zhì)中折疊。在這一空間中的氧化條件促使二硫橋的形成(WulfingundPluckthun，Mol.Microbiol.12(1994)685-692)。在周質(zhì)中DnaJ，J-區(qū)域或者Hsp25的同時(shí)共過(guò)表達(dá)促使功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率提高約5-10倍(表1)。下文通過(guò)實(shí)施例，出版物，序列表和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，權(quán)利要求限定保護(hù)范圍。所描述的方法應(yīng)被認(rèn)為是舉例性的，即使在改動(dòng)之后仍描述本發(fā)明的主題。序列表簡(jiǎn)要描述SEQIDNO1顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ的部分序列，它編碼由OmpA信號(hào)序列和DnaJ以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)，它是從pINⅢompA3-dnaJ擴(kuò)增的。SEQIDNO2顯示OmpA-DnaJ融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO3顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-J-區(qū)域的部分序列，它編碼由OmpA信號(hào)序列和J-區(qū)域以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)，它是從pINⅢompA3-dnaJ擴(kuò)增的。SEQIDNO4顯示OmpA-J-區(qū)域融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO5顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-hsp25的部分序列，它編碼由OmpA信號(hào)序列和Hsp25以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)，它是從pINⅢompA3-hsp25擴(kuò)增的。SEQIDNO6顯示OmpA-Hsp25融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO7顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-ScFvOx的部分序列，它編碼由PelB信號(hào)序列和ScFvOxazolon以及調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，終止子)組成的融合蛋白質(zhì)，它是從pHEN-ScFv或者pINⅢompA3擴(kuò)增的。SEQIDNO8顯示PelB-scFvoxazolon融合多肽的氨基酸序列。SEQIDNO9顯示表達(dá)質(zhì)粒pET20b(+)-rPA的部分序列，它編碼由PelB信號(hào)序列和rPA組成的融合蛋白質(zhì)。SEQ-IDNO10顯示PelB-rPA融合多肽的氨基酸序列。附圖簡(jiǎn)要描述圖l顯示周質(zhì)和胞液中表達(dá)的DnaJ用50μg/ml的胰蛋白酶進(jìn)行限制水解的Western印跡，以檢測(cè)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位和天然折疊。分子量標(biāo)準(zhǔn)加在左邊和右邊。作為對(duì)照，對(duì)純化的DnaJ(左)進(jìn)行了同樣的處理，但使用6.25μg/ml胰蛋白酶。圖2顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ。圖3顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-J-區(qū)域。圖4顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-hsp25。圖5顯示表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-ScFvOx。圖6顯示表達(dá)質(zhì)粒pET20b(+)-rPA.綜述對(duì)于DnaJ，J-區(qū)域和Hsp25在大腸桿菌中的周質(zhì)過(guò)表達(dá)，將編碼這些蛋白質(zhì)的DNA通過(guò)基因工程技術(shù)與大腸桿菌的外膜蛋白質(zhì)A(OmpA)的信號(hào)序列融合，并將該融合體在1ac-1pp啟動(dòng)子的控制之下在大腸桿菌中在一個(gè)重組質(zhì)粒上表達(dá)。結(jié)果，DnaJ和Hsp25的多肽鏈被轉(zhuǎn)移至原核宿主生物體的周質(zhì)中并在其中進(jìn)行天然折疊。它們的定位和DNAJ的天然折疊通過(guò)使用胰蛋白酶的限制水解和通過(guò)Western印跡來(lái)顯示。實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pINⅢompA3-dnaJ的構(gòu)建分子遺傳技術(shù)基于Ausubel等(Ed.)，J.Wiley&Sons，1997，Curr.ProtocolsofMolecularBiology。寡核苷酸得自以下公司MWGBiotech，EbersbergorGIBCOLifeSciences，Eggenstein，GER。編碼DnaJ，GeneBankAccessionNo.M12565，的基因通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ被克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pINⅢompA3(Ghayreb等，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。被克隆的PCR片段的序列通過(guò)雙脫氧測(cè)序方法檢測(cè)(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，F(xiàn)bersberg)。將得到的質(zhì)粒命名為pINⅢompA3-dnaJ。在周質(zhì)中表達(dá)的DnaJ的序列不同于野生型蛋白，不同點(diǎn)為該多肽序列的開(kāi)始為Gly-Ile-Pro而不是Met，因而具有一個(gè)2個(gè)氨基酸的N-末端延伸。因而，DnaJ是在lac-lpp啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子被IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)。實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-dnaJ的構(gòu)建將來(lái)自質(zhì)粒pINⅢompA3-dnaJ的編碼lac-lpp操縱子，信號(hào)序列，dnaJ基因和該操縱子的終止子的區(qū)段通過(guò)PCR擴(kuò)增(SEQIDNO1)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ進(jìn)行切割并克隆進(jìn)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI線性化的載體pUBS520。將得到的質(zhì)粒命名為pUBS520-pIN-dnaJ(圖2)。實(shí)施例3表達(dá)質(zhì)粒puBS520-pIN-J-區(qū)域通過(guò)使用QuikChange誘變系統(tǒng)(Promega，Mannheim，DE)將兩個(gè)終止密碼子插入在質(zhì)粒puBS520-pIN-dnaJ的核苷酸324之后，從而僅使最初的108個(gè)氨基酸被表達(dá)。通過(guò)雙脫氧測(cè)序(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Ebersberg)確定突變的區(qū)域的序列，并通過(guò)Western印跡和用抗-DnaJ抗體檢測(cè)測(cè)定截短的蛋白質(zhì)片段的表達(dá)。將形成的質(zhì)粒命名為puBS520-pIN-J-區(qū)域(圖3)。實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒pINⅢompA3-hsp25的構(gòu)建將編碼Hsp25，GeneBankAccessionNo.L07577，的基因通過(guò)限制性酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pINⅢompA3(Ghayreb等，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。通過(guò)雙脫氧測(cè)序檢測(cè)克隆的PCR片段的序列(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，F(xiàn)bersberg)。將得到的質(zhì)粒命名為pINⅢompA3-hsp25。在周質(zhì)中表達(dá)的Hsp25的序列不同于野生型蛋白質(zhì)的序列，其不同點(diǎn)為該多肽序列的開(kāi)始為Gly-Ile-Leu而不是Met，因而在N-末端具有2個(gè)氨基酸的延伸。因而，Hsp25是在lac-lpp啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子被IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)。實(shí)施例5表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-pIN-hsp25的構(gòu)建將來(lái)自質(zhì)粒pINⅢompA3-hsp25的編碼lac-lpp操縱子，信號(hào)序列，hsp25基因和該操縱子的終止子的區(qū)段通過(guò)PCR擴(kuò)增(SEQIDNO5)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ進(jìn)行切割并克隆進(jìn)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ線性化的載體pUBS520。將得到的質(zhì)粒命名為pUBS520-pIN-hsp25(圖4)。實(shí)施例6表達(dá)質(zhì)粒pUBS520-ScFvOx的構(gòu)建對(duì)一種不具有伴侶分子性能的針對(duì)半抗原oxazolon的單鏈Fv片段(ScFvOxazolon；Fiedler和Conrad，Bio/Technology13(1995)的共表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，作為負(fù)對(duì)照。將來(lái)自質(zhì)粒pHFN-ScFvOx的編碼lac啟動(dòng)子的區(qū)域、信號(hào)序列pelB和scfvox基因通過(guò)PCR擴(kuò)增。來(lái)質(zhì)粒pINⅢompA3的編碼lpp終止子的區(qū)域在第二個(gè)PCR中擴(kuò)增。在下一個(gè)PCR中將這兩個(gè)片段融合。將以這種方式形成的PCR產(chǎn)物(SEQIDNO7)用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ切割并克隆進(jìn)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ線性化的載體pUBS520中。將得到的質(zhì)粒命名為pUBS520-ScFvOx(圖5)。實(shí)施例7表達(dá)質(zhì)粒pET20b(+)-rPA的構(gòu)建將來(lái)自質(zhì)粒載體pA27fd7(Kohnert等，ProteinEngineering5(1992)93-100)的rPA的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和BamHI切割并克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pET20b(+)(NovagenInc.，Madison，USA)。該質(zhì)粒編碼一種融合蛋白質(zhì)，它是由PelB的信號(hào)序列和rPA組成的，并且rPA向周質(zhì)中的分泌通過(guò)雙脫氧測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)(LiCorDNA-Sequencer4000，MWGBiotech，Ebersberg，DE)。將該構(gòu)建體命名為pFT20b(+)-rPA(SEQIDNO10)(圖6)。rPA在質(zhì)粒中在T7啟動(dòng)子的控制之下進(jìn)行表達(dá)，在大腸桿菌菌株BL21(DF3)中的T7-RNA-聚合酶是在lacUV5啟動(dòng)子的控制之下。通過(guò)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。在周質(zhì)中表達(dá)的rPA不同于由Kohnert等描述的血纖蛋白溶酶原激活物，其不同點(diǎn)在于第二個(gè)氨基酸(Ser)被Ala替換。實(shí)施例8rPA大腸桿菌周質(zhì)中的功能性表達(dá)將靜止過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Studier&Moffat，J.MoLBiol.189(1986)113-130)，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共表達(dá))，過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-J-區(qū)域(J-區(qū)域的共表達(dá))，過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-hsp25(Hsp25的共表達(dá))，過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-ScFvOx(ScFvOx的共表達(dá))，過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520或者過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，它含有pET20b(+)和pUBS520(對(duì)照培養(yǎng))，以1∶50的比率稀釋在100mlLB-培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml，F(xiàn)lukaChemica，Neu-Ulm，GER)，并在24℃和170rpm下振蕩。在生長(zhǎng)3小時(shí)后，將5ml的培養(yǎng)物等份試樣加入10mlLB培養(yǎng)基中，該LB培養(yǎng)基中含有上述量的氨芐青霉素和卡那霉素和5mMGSH(Fluka，GER)并將它們用1mMIPTG(AppliChem，Darmstadt，GER)誘導(dǎo)。將細(xì)胞再在24℃和170rpm下振蕩21小時(shí)，并在測(cè)定OD600后取出1ml樣品。將這些1ml的細(xì)胞樣品在2mlEppendorf反應(yīng)管中，按照J(rèn)acobi等(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)的方法的改良方法進(jìn)行分級(jí)。詳細(xì)地說(shuō)，將500μl的分級(jí)緩沖液(150mMNaCl(RothGmbH)，50mMTris/HCl(RothGmbH，5mMFDTA(Biomol)和1mg/ml多粘菌素B硫酸鹽(Sigma)，pH7.5)加入細(xì)胞團(tuán)粒中，在10℃在一個(gè)Eppendorf熱振蕩器上在1400rpm振蕩1小時(shí)，然后在14000rpm在一個(gè)冷卻至10℃的Eppendorf微離心器上離心15分鐘，形成一個(gè)含有可溶性周質(zhì)蛋白質(zhì)的級(jí)分(上清液)和一個(gè)殘留級(jí)分(團(tuán)粒)?；旧习凑誚erheijen等Thromb.Haemostasis48(1982)266-269)的方法測(cè)定rPA的活性。將所有的在細(xì)胞抽提物中測(cè)定的rPA濃度對(duì)OD600=1的細(xì)胞懸液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以校正在不同的緩沖液中測(cè)定時(shí)發(fā)生的誤差。結(jié)果示于表1。表1分子伴侶的共表達(dá)在大腸桿菌周質(zhì)中在發(fā)酵培養(yǎng)基中5mMGSH的存在下對(duì)rPA形成的影響<tablesid="table1"num="001"><table>共表達(dá)的蛋白質(zhì)rPA(ng/ml*OD600)刺激因子0.030±0.00129DnaJ0.197±0.01929J區(qū)域0.339±0.00716Hsp250.053±0.00227ScFvOxazolon(對(duì)照)0.041±0.00313</table></tables>培養(yǎng)是在5mMGSH的存在下進(jìn)行的。實(shí)施例9通過(guò)pINⅢompA3表達(dá)的DnaJ的周質(zhì)定位的測(cè)定制備原生質(zhì)球，以改善通過(guò)pINⅢompA3-dnaJ分泌至周質(zhì)中的DnaJ的周質(zhì)定位和正確折疊。該含有pINⅢompA3-dnaJ的大腸桿菌XLI藍(lán)色細(xì)胞是從含有100pg/ml氨芐青霉素(Sigma，Deisenhofen)的LB培養(yǎng)基(1LLB培養(yǎng)基含有l(wèi)0gBacto-tryptone(DifcoFactories，Detroit，Michigan，USA)，5g酵母(DifcoFactories)和5gNaCl(RothGmbH，Karlsruhe))，在37℃和200rpm培養(yǎng)并在2.75小時(shí)后用1mMIPTG誘導(dǎo)(OD600約0.5)的靜止預(yù)先培養(yǎng)物以1∶50的比例稀釋后得到的。在誘導(dǎo)劑的存在下生長(zhǎng)3小時(shí)后，通過(guò)離心收集細(xì)胞(Eppendorf微離心，5000rpm，5分鐘)。將一個(gè)含有一種用于細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)DnaJ的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株作為對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)3小時(shí)。從離心后得到的細(xì)胞團(tuán)粒按照下述方法制備原生質(zhì)球?qū)⑾鄳?yīng)與QD600為1的等量的2ml細(xì)菌按照Thorstenson等，J.Bacteriol.179(1997)5333-5339的方法進(jìn)行分級(jí)。將以團(tuán)粒形式聚集的原生質(zhì)球溶解在含有100mMNaCl的30μl50mMTris/HCI，pH8.0的溶液中，作為對(duì)照，將原生質(zhì)球溶解在相同的緩沖液中，但加入0.1％Triton-X-100(Amresco，Solon，Ohio，USA)。對(duì)于隨后的用胰蛋白酶限制水解來(lái)說(shuō)，將15μl的各個(gè)原生質(zhì)球制劑(含有或不含有Triton-X-100)與2μl的1mg/ml胰蛋白酶(RocheDiagnosticsGmbH，GER)和23μl的含有100mMNaCl的50mMTris/HCl，pH8.0混合，并在20℃溫浴。在0，5和30分鐘后，取出8μl樣品，與2μl4mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑和3μlSDS-PAGE加樣緩沖液(4％甘油(Sigma，Deisenhofen)，0.5％SDS(ICN)，2％巰基乙醇(Sigma)，0.0625MTris/HCl，pH6.8和溴酚蘭(Sigma))混合，并沸煮5分鐘。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，將2μg純化的DnaJ(2μg／μl)與lμl100μg/ml胰蛋白酶和含有100mMNaCl的14μl50mMTris/HCl，pH8.0混合，在20℃下溫浴，并在所述的時(shí)間結(jié)束水解。將水解的產(chǎn)物按照Lammli等，Nature227(1970)680-685)所述的SDS-PAGE進(jìn)行分離。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(RioRadLaboratories，Munich)(Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods10(1984)203-207；Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1979)267-271)。將該膜用TBS-5％奶粉(Glucksklee，NestleFrankfurt)封閉過(guò)夜，然后用TBS5％奶粉中的抗-DnaJ抗體反應(yīng)2小時(shí)。在TBS中洗滌5分鐘的三個(gè)洗滌步驟之后，將它們用TBS-5％奶粉中的額外的抗體(抗兔-IgG過(guò)氧化物酶，AmershamLifeSciences，Braunschweig)溫浴1.5小時(shí)，并在用TBS緩沖液洗滌5次。使用AmershamCompany的ECLWestern印跡測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示。由于在原生質(zhì)球制備后分泌的分子伴侶是蛋白酶敏感性的，這表明它位于內(nèi)膜的周質(zhì)側(cè)。相反，細(xì)胞內(nèi)DnaJ在原生質(zhì)球制備后仍為蛋白酶保護(hù)的。由Triton-X-100造成的原生質(zhì)球的通透化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DnaJ被胰蛋白酶消化。在周質(zhì)中表達(dá)的DnaJ的切割類(lèi)型與純化的天然的DnaJ的相同。因而這表明周質(zhì)中表達(dá)的產(chǎn)物在這一空間中是天然形式的。參考文獻(xiàn)Arrigo&Landry(1994)InMorimoto(publ.):TheBiologyofHeatShockProteinsandMolecularChaperones(熱休克蛋白質(zhì)和分子伴侶的生物學(xué))，ColdSpringHarbourPress，335-373Ausubel等(publ.)CurrentProtocolsinMolecularBiology(當(dāng)代生物學(xué)方法)，J.Wiley&Sons,1997Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60Brinknann等，Gene(基因)85(1989)109-114Bukau，B.&Horwich，A.，Cell(細(xì)胞)92(1998)351-366Cyr等，TIBS19(1994)176-181)Ehrnsperger等，F(xiàn)MBO1.16(1997)221-229EP-A0510658EP-A0556726Fiedler和Conrad，Bio/Technology13(1995)1090-1093Gaestel等，Eur.J.Biochem.(歐洲生物化學(xué)雜志)179(1989)209-213Ghayreb等，F(xiàn)MBOJ.3(1984)2437-2442Goloubinoff等，Nature(自然)337(1989)44-47Hayhurst和Harris，ProteinExpr.Purif．15(1999)336-343Hockney，TIBTECH12(1994)456-463Jacobi等J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)272(1997)21692-21699Jakob等，J.Biol．Chem.268(1993)1517-1520Jakob和Buchner，TIBS19(1994)205-211Kelley，TIBS23(1998)222-227Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods10(1984)203-207Knappik等，Bio/Technology11(1993)77-83Kohnert等，ProteinEngineering(蛋白質(zhì)工程)5(1992)93-100Lammli等，Nature227(1970)680-685Langer等，Nature356(1992)683-689Lee&Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852Martin等，Cardiovasc.DrugRev.11(1993)299-311Murphy&Beckwith:ExportofProteinstotheCellEnvelopeinEscherichiacoliNeidhardt等(publ.)Escherichiacoli和Salmonella，SecondEdition，Vol.1，ASMPress，Washington，1996，5.967-978Paetzel等，Nature396(1998)186-190Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊)210(1995)524-529Qiu等，Appl.Fnvironm.Microbiol.64(1998)4891-4896Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)8428-8432Sato等，Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607Schroder等，EMBOJ.12(1993)4137-4144Silver和Way，Cell(細(xì)胞)74(1994)5-6Studier&Moffat，J.Mol.Biol.189(19&6)113-130Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.(應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù))66(1997)197-238Thorstenson等，J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志)179(1997)5333-5339Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)科學(xué)院院刊)79(1979)267-271US-Patent(美國(guó)專(zhuān)利)No.5，223，256Verheijen等Thromb.Haemostasis48(1982)266-269Wall等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)270(1995)2139-2144WulflngundPluckthun，Mol.Microbiol.(分子微生物學(xué))12(1994)685-692Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Technol.(微生物發(fā)酵雜志)62(1998)1205-1210序列表<110>霍夫曼拉羅奇有限公司<120>通過(guò)分子伴侶的共分泌制備天然折疊的和分泌的蛋白質(zhì)的方法<130>案號(hào)20381<140><141><150>EP99114811.5<151>1999-07-29<160>10<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>1881<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>CDS<222>(392)..(1591)<400>1taggcgtatcacgaggccctttggataaccagaagcaataaaaaatcaaatcggatttca60ctatataatctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatt120tttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgcct180tcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatg240gagattaactcaatctagctagagaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgt300gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggat360tcactggaactctagataacgagggcaaaaaatgaaaaagacagctatcgcg412MetLysLysThrAlaIleAla15attgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccggaatt460IleAlaValAlaLeuAlaGlyPheAlaThrValAlaGlnAlaGlyIle101520ccagctaagcaagattattacgagattttaggcgtttccaaaacagcg508ProAlaLysGlnAspTyrTyrGluIleLeuGlyValSerLysThrAla253035gaagagcgtgaaatcagaaaggcctacaaacgcctggccatgaaatac556GluGluArgGluIleArgLysAlaTyrLysArgLeuAlaMetLysTyr40455055cacccggaccgtaaccagggtgacaaagaggccgaggcgaaatttaaa604HisProAspArgAsnGlnGlyAspLysGluAlaGluAlaLysPheLys606570gagatcaaggaagcttatgaagttctgaccgactcgcaaaaacgtgcg652GluIleLysGluAlaTyrGluValLeuThrAspSerGlnLysArgAla758085gcatacgatcagtatggtcatgctgcgtttgagcaaggtggcatgggc700AlaTyrAspGlnTyrGlyHisAlaAlaPheGluGlnGlyGlyMetGly9095100ggcggcggttttggcggcggcgcagacttcagcgatatttttggtgac748GlyGlyGlyPheGlyGlyGlyAlaAspPheSerAspIlePheGlyAsp105110115gttttcggcgatatttttggcggcggacgtggtcgtcaacgtgcggcg796ValPheGlyAspIlePheGlyGlyGlyArgGlyArgGlnArgAlaAla120125130135cgcggtgctgatttacgctataacatggagctcaccctcgaagaagct844ArgGlyAlaAspLeuArgTyrAsnMetGluLeuThrLeuGluGluAla140145150gtacgtggcgtgaccaaagagatccgcattccgactctggaagagtgt892ValArgGlyValThrLysGluIleArgIleProThrLeuGluGluCys155160165gacgtttgccacggtagcggtgcaaaaccaggtacacagccgcagact940AspValCysHisGlySerGlyAlaLysProGlyThrGlnProGlnThr170175180tgtccgacctgtcatggttctggtcaggtgcagatgcgccagggattc988CysProThrCysHisGlySerGlyGlnValGlnMetArgGlnGlyPhe185190195ttcgctgtacagcagacctgtccacactgtcagggccgcggtacgctg1036PheAlaValGlnGlnThrCysProHisCysGlnGlyArgGlyThrLeu200205210215atcaaagatccgtgcaacaaatgtcatggtcatggtcgtgttgagcgc1084IleLysAspProCysAsnLysCysHisGlyHisGlyArgValGluArg220225230agcaaaacgctgtccgttaaaatcccggcaggggtggacactggagac1132SerLysThrLeuSerValLysIleProAlaGlyValAspThrGlyAsp235240245cgcatccgtcttgcgggcgaaggtgaagcgggcgagcatggcgcaccg1180ArgIleArgLeuAlaGlyGluGlyGluAlaGlyGluHisGlyAlaPro250255260gcaggcgatctgtacgttcaggttcaggttaaacagcacccgattttc1228AlaGlyAspLeuTyrValGlnValGlnValLysGlnHisProIlePhe265270275gagcgtgaaggcaacaacctgtattgcgaagtcccgatcaacttcgct1276GluArgGluGlyAsnAsnLeuTyrCysGluValProIleAsnPheAla280285290295atggcggcgctgggtggcgaaatcgaagtaccgacccttgatggtcgc1324MetAlaAlaLeuGlyGlyGluIleGluValProThrLeuAspGlyArg300305310gtcaaactgaaagtgcctggcgaaacccagaccggtaagctattccgt1372ValLysLeuLysValProGlyGluThrGlnThrGlyLysLeuPheArg315320325atgcgcggtaaaggcgtcaagtctgtccgcggtggcgcacagggtgat1420MetArgGlyLysGlyValLysSerValArgGlyGlyA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