專利名稱：一種植酸酶基因及其克隆的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種植酸酶基因及其克隆，屬于生物工程領域，特別涉及到無花果曲霉(A.ficuum)As3.324編碼PYHA型植酸酶的基因及其克隆。
植物中總磷的60％-90％以植酸的形式存在，這些磷不能被人和單胃動物所利用，食物尤其是集約化畜牧業(yè)的飼料中需添加礦物質(zhì)磷，這一方面是礦物質(zhì)原料的浪費，另一方面未消化的植酸排出體外，造成土質(zhì)和水質(zhì)環(huán)境的磷污染。植酸還有強烈的抗營養(yǎng)作用，它能螯合礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，影響人及動物對微量礦物質(zhì)元素的吸收，抑制蛋白質(zhì)尤其是消化酶系的生物學活性。植酸酶能催化水解植酸，釋放游離肌醇、磷酸及多磷酸中間產(chǎn)物。利用植酸酶對植酸的水解作用，能夠提高人或單胃動物對植物性食品或飼料中磷的利用率，解除植酸的抗營養(yǎng)作用，而且有利于環(huán)境保護。植酸酶廣泛存在于微生物特別是真菌中，但目前只有少數(shù)來自于不同微生物的植酸酶基因被測序克隆。無花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶屬于PHYA型植酸酶，其酶學性質(zhì)特別是在pH2.5和pH5.5處有兩個酶活性高峰，適合于在人或動物胃腸中作用。目前，野生型微生物包括無花果曲霉As3.324的產(chǎn)植酸酶水平較低，以至于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的植酸酶成本很高。
本發(fā)明提供了無花果曲霉(A.ficuum)As3.324編碼PHYA型植酸酶的基因phyAI序列及其相應的氨基酸序列。提供了含有As3.324植酸酶基因phyAI的克隆載體pUC19/phyA I和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)細胞JM109/pUC19/phyA I。利用本發(fā)明成果，可以構建植酸酶基因工程菌，提高微生物發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的水平，降低植酸酶生產(chǎn)成本；還可用于植物尤其是經(jīng)濟農(nóng)作物的基因轉(zhuǎn)化，達到改善農(nóng)作物品質(zhì)的目的。
本發(fā)明以無花果曲霉(A.ficuum)NRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作參考，設計并合成兩條寡核苷酸引物，提取As3.324基因組DNA為模版，PCR方法合成phyAI，并對PCR產(chǎn)物測定核苷酸序列。將phyAI和克隆載體PUCl9分別用限制性內(nèi)切酶切割，形成互補的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成phyAI克隆載體pUC19/phyAI。熱激法將這個克隆載體導入感受態(tài)E.coli JM109，成為含有pUC19/phyAI的大腸桿菌細胞JM109/PUC19/phyAI。
無花果曲霉(A.ficuum)As3.324植酸酶基因phyAI核苷酸序列如下 其中 為轉(zhuǎn)錄起始密碼， 為轉(zhuǎn)錄終止密碼， 框線中序列為植酸酶活性位點編碼序列，小寫字母表示內(nèi)含子序列。
根據(jù)以上核苷酸序列，推測A.ficuum As3.324植酸酶蛋白的氨基酸序列如下
441 LGRCT RDSFV KGLSF ARSGG461 DWAEC FAphyA I的結構基因全長1515bp，+46-+156的111個核苷酸為內(nèi)含子序列，其中含有真菌內(nèi)含子的特征保守序列，Donor序列GTATGC，Lariat序列GCTGAC，Acceptor序列CAG。phyA I共編碼467個氨基酸，N端的19個氨基酸為信號肽，信號肽的切割位點在第19位氨基酸Gly之后，在phyA I編碼的氨基酸序列中存在10個潛在的N-糖基化位點，81-88位氨基酸為植酸酶的活性位點保守序列RHGARYPT?？寺≥d體pUC19/phyA I中含有phyA I全序列。受體大腸桿菌細胞JM109/pUC19/phyA I中含有克隆載體pUC19/phyA I。
phyA I是首次被提取、測序和克隆的無花果曲霉(A.ficuum) As3.324的植酸酶基因。因其所編碼的植酸酶適合作用于在人和單胃動物的胃腸中作用，所以該基因的克隆可用于構建表達植酸酶的基因工程菌，提高微生物發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的水平，降低植酸酶生產(chǎn)成本；還可用于植物尤其是經(jīng)濟農(nóng)作物的基因轉(zhuǎn)化，達到改善農(nóng)作物品質(zhì)的目的。
以下是本發(fā)明的最佳實施例實施例1Aficuum As3.324植酸酶基因phyA I的PCR擴增和測序用馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)A.ficuum As3.324，30℃振蕩培養(yǎng)24小時后收集菌體，液氮研磨菌體，以氯化芐為提取液提取As3.324基因組DNA。以A.ficuumNRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作參考，設計并合成兩條PCR引物如下
F15’-AGGTGGGATGAAGGGGTTAT-3’R15’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’PCR反應條件如下Template1μlLA Taq 0.5μldNTP8μl2×GCIbuffer25μlF1(20pmol/μl) 1μlR1(20pmol/μl) 1μlddH2O up to 50μl94℃ 1′ 4℃PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用回收試劑盒D301CA(TaKaRa公司產(chǎn)品)回收約1.5Kb的DNA片斷，對該DNA片斷用Sanger鏈終止法測定其核苷酸序列，為無花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶基因phyA I。
實施例2phyA I與克隆載體PUC19的重組phyA I和克隆載體PUC19分別用EcoR I/Pst雙酶切。酶切條件如下
Eppendorf AEppendorf BddH2O 9μl ddH2O 13μl10×H 2μl 10×H 2μl0.1％BSA 2μl 0.1％BSA2μlPCR片段(1μg/μl) 5μl 質(zhì)粒PUC19(1μg/μl) 1μlEcoR I 1μl EcoR I 1μlPst I 1μl Pst I 1μl37℃酶切3小時，電泳后分別回收兩個目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接條件如下ddH2O6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μlPUC19(0.05μg/μl)1μl10×T4DNA連接酶Buffer 1μlT4DNA連接酶(1U/μl) 1μl16℃連接1小時，電泳檢測連接產(chǎn)物，回收其中約4.2Kb片段為含有phyA I的克隆載體pUC19/phyA I，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
實施例3克隆載體pUC19/phyA I轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109加入60μl解凍的感受態(tài)E.coli JM109和10μl連接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分鐘，加入37℃的LB培養(yǎng)基930μl，37℃震蕩培養(yǎng)1小時。菌液與4μlIPTG及40μlX-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑選白色菌落做PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)1.5Kb特異帶者為陽性轉(zhuǎn)化菌落，為含有pUC19/phyA I的大腸桿菌JM109/pUC19/phyA I。從JM109/pUC19/phyA I中提取質(zhì)粒，以PUC19的測序通用引物測定外源插入序列phyA I的核苷酸序列，與實施例1所述PCR測序結果一致。
權利要求
1.一種植酸酶基因，phyAI，其特征在于它是無花果曲霉(A.ficuum)As.3324編碼PHYA型植酸酶的基因。
2.根據(jù)權利要求1所述植酸酶基因phyAI的核苷酸序列 466 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG496 ACTCCCTTCG GAGAGCAGGA GCTGGTCAAC526 TCCGGCGTCA AGTTCTACCA GCGATACGAA556 TCGCTCACAA GAAACATTGT CCCGTTCATC586 CGATCCTCAG GCTCCAGCCG CGTGATTGCC616 TCTGGCAATA AATTCATCGA GGGCTTCCAG646 AGCACTAAGC TGAAGGATCC TCGTGCCCAG676 CCCGGCCAAT CGTCGCCCAA GATCGACGTG706 GTCATTTCAG AGGCCAGCAC ATCCAACAAC736 ACTCTCGATC CGGGCACCTG CACCGTTTTC766 GAAGATAGCG AATTGGCCGA TGACATCGAA796 GCCAATTTCA CCGCCACGTT CGTCCCCTCC826 ATTCGTCAAC GTCTGGAGAA CGACTTGTCT856 GGCGTGTCTC TCACGGACAC AGAAGTGACC886 TACCTCATGG ACATGTGCTC CTTCGACACC916 ATCTCCACCA GCACCGTCGA CACCAAGCTG946 TCCCCCTTCT GTGACCTGTT CACCCATGAA976 GAATGGATCA ACTACGACTA CCTCCAGTCC1006 CTGAACAAAT ACTACGGCCA TGGCGCAGGT1036 AACCCGCTCG GCCCGACCCA GGGCGTCGGC1066 TACGCTAACG AGCTCATCGC CCGTCTCACC1096 CACTCGCCTG TCCACGATGA CACCAGCTCC1126 AACCACACAT TGGACTCCAA CCCGGCTACT
3.根據(jù)權利要求1所述植酸酶基因phyAI的克隆載體PUC19/phyAI。
4.根據(jù)權利要求3所述克隆載體PUC19/phyAI的大腸桿菌(E.coli)受體細胞JM109/PUC19/phyAI。
全文摘要
本發(fā)明是一種植酸酶基因及其克隆,屬于生物工程領域。本發(fā)明提供了一種來自于無花果曲霉(A.ficuum)As3.324編碼PHYA型植酸酶的基因phyAI,提供了phyAI序列及其相應的氨基酸序列。提供了含有phyAI的克隆載體pUC19/phyAI和含有這種載體的E.coli細胞JM109/pUC19/phyAI。本發(fā)明可用于構建植酸酶基因工程菌,提高微生物發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的水平;還可用于農(nóng)作物的基因轉(zhuǎn)化,達到改善農(nóng)作物品質(zhì)的目的。
文檔編號C12N15/55GK1350060SQ00123168
公開日2002年5月22日 申請日期2000年10月24日 優(yōu)先權日2000年10月24日
發(fā)明者張苓花, 安利佳, 袁曉東, 包永明, 王運吉 申請人:大連理工大學, 大連輕工業(yè)學院