專利名稱：：一種新型低溫堿性蛋白酶、制造方法、應用和產(chǎn)生該蛋白酶的微生物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新型低溫堿性蛋白酶、制造方法、應用和產(chǎn)生該蛋白酶的微生物，特別是涉及一種源于一種新的黃桿菌屬未知種菌株(保藏號CCTCCM200014)、在中溫至低溫度條件具有低活化能和高酶活性比的新型低溫堿性蛋白酶，其制造方法及其在去污劑、發(fā)制品(人發(fā))、海洋抗氧化活性多肽等領域中的應用和產(chǎn)生該低溫堿性蛋白酶的菌株。堿性蛋白酶作為一種改進合成洗滌劑去垢性的必要成分已為世人共知。但在過去的10年中，世界洗滌領域發(fā)生了根本性的改變。全球洗衣正向著低溫、節(jié)水型發(fā)展，傳統(tǒng)的洗滌劑用酶(主要是堿性蛋白酶)在較低溫度下所表現(xiàn)出的清潔能力已難以滿足消費者的需求，所以需要在低溫區(qū)域具有明顯相對活性優(yōu)勢的酶。目前已知的洗滌劑用商品低溫堿性蛋白酶包括ProperaseCT(GENENCOR國際公司，美國)、Savinase4．0T低溫堿性蛋白酶(NOVO公司，丹麥)等品牌，氧化穩(wěn)定性洗滌劑堿性蛋白酶為MaxapemCX(GENENCOR國際公司，美國)。其中Savinase4．0T低溫堿性蛋白酶在pH10．1條件下，最適反應溫度55℃、20℃時相對活性約為15％。ProperaseCT低溫堿性蛋白酶在pH10條件下，最適反應溫度50－55℃、20℃時相對活性約為42％。MaxapemCX堿性蛋白酶在最適條件下于20mMH2O2中可穩(wěn)定60分。可見，在各自推薦的最適條件下，在低溫區(qū)蛋白酶的相對活性較低，所以這些酶的低溫活性區(qū)和對氧化劑的穩(wěn)定性仍然沒有令人完全滿意。眾所周知，以東方人人發(fā)為材料生產(chǎn)發(fā)制品，尤其假發(fā)制品，需首先專一性破壞其表面鱗質(zhì)層再以氧化手段脫色、造型。然而人發(fā)鱗質(zhì)層的基礎成分是各種天然氨基酸組成的硬性角蛋白質(zhì)，一般情況下，它既不溶于水、稀的酸和堿，也不為普通蛋白酶所分解。故多年來發(fā)制品制造業(yè)均采用濃酸法脫鱗生產(chǎn)工藝，但酸法水解存在諸多缺點，例如胱氨酸、色氨酸等被破壞后形成黑色不溶物沉積在頭發(fā)表面并伴有惡臭產(chǎn)生而嚴重污染環(huán)境；并使頭發(fā)鱗質(zhì)層中的結(jié)晶區(qū)(肽鏈排列比較密集)被過度破壞而傷至皮質(zhì)層，使色發(fā)成品抗拉強度降低，造成色發(fā)成品的檔次較低，產(chǎn)品質(zhì)量合格率＜50％?，F(xiàn)有的對人發(fā)角蛋白質(zhì)最有效的商品酶是角蛋白酶，但試驗結(jié)果，角蛋白酶對人發(fā)表面鱗質(zhì)層缺乏滿意的作用專一性，易將其徹底水解成低聚肽和芳香族游離氨基酸，而無法實際應用。另外，為了進一步加強海洋生物資源可持續(xù)利用，近年來應用海洋資源非食用部分中生物活性物質(zhì)生產(chǎn)醫(yī)藥保健品也是當務之急。海洋抗氧化活性肽系從海洋甲殼類動物提取的特定物質(zhì)(膠原蛋白N端組織)，有確定的抗紫外線氧化、清除活性氧自由基的能力，對預防日光中紫外線對頭發(fā)、皮膚損傷和促進放療病人恢復有增強免疫的重要作用。但由于海洋生物資源的多樣性，使得該領域研究極為復雜，長期以來都希望找到具有專一底物范圍的新型蛋白酶，以通過酶解手段大量制備抗氧化活性肽。應用市售537酸性蛋白酶(水解條件50℃、pH3)、AS1398中性蛋白酶(水解條件50℃、pH7)、胰蛋白酶(水解條件37℃、pH8)、2709堿性蛋白酶(水解條件40℃、pH9．5)等商品酶在各自推薦的最適條件下試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均對已選定作用底物缺乏專一性在酸性至弱堿性范圍內(nèi)，提取的活性物質(zhì)易變性、沉淀或不為相應蛋白酶所水解；在堿性范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物多為游離氨基酸而無特定生物活性。本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術存在問題，提供一種能適應于中溫至低溫條件、氧化穩(wěn)定型的低溫堿性蛋白酶、所述蛋白酶的制造方法和在去污劑、發(fā)制品(人發(fā))生產(chǎn)、海洋抗氧化活性多肽生產(chǎn)等領域的應用以及產(chǎn)生該低溫堿性蛋白酶的微生物。產(chǎn)酶微生物本發(fā)明提供的能夠產(chǎn)生新的低溫堿性蛋白酶的新型微生物是由海產(chǎn)貝類樣品中分離的黃桿菌(Flavobacterium)屬未知種菌株YS9412－130，該菌株于2000年6月30日保藏于中國武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏號為M200014。本發(fā)明的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130的形態(tài)學及細菌學特性按照本發(fā)明提供的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130是一種與泥色黃桿菌(Flavobacterium)在細菌學上密切相關的菌株。然而所述菌株在一些特性方面明顯地不同于其它的已知菌株，其被認為是一個新的菌株。形態(tài)學及細菌學特性如下<tablesid="table3"num="003"><table>項目特性大小形態(tài)桿狀，0．6－0．7×2．3μm運動性+革藍氏染色-含有結(jié)晶紫的洋菜培養(yǎng)基+37℃生長+適宜生長溫度5－20℃適宜生長pH6－9耐鹽性+鞭毛染色+菌落形成全緣、扁圓、表面光滑產(chǎn)生色素黃色至略呈橘黃色脲酶試驗+吲哚產(chǎn)物+H2S試驗-淀粉試驗-糖產(chǎn)酸試驗-由NO3到NO2+腸道培養(yǎng)基無色菌落有指示劑的蛋白胨培養(yǎng)基示pH上升甲基紅試驗</table></tables><tablesid="table4"num="004"><table>伏一普二氏(VP)試驗-明膠液化試驗-脂酶活性試驗-半固體穿刺培養(yǎng)表面生長，示嗜氧從海洋環(huán)境分得+G+C摩爾％65</table></tables>參考Bergey′S的系統(tǒng)細菌學手冊(William和Wilkins，Vol．2，1986)，將所述的具有上述細菌學特征的細菌的系統(tǒng)特征與其它的菌株比較如下本發(fā)明提供的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130在由葡萄糖產(chǎn)酸和脲酶試驗、吲哚產(chǎn)物試驗方面沒有表現(xiàn)出與泥色黃桿菌相同的特征。然而，本發(fā)明菌株YS9412－130由低溫生長并在此溫度條件下時產(chǎn)生色素最顯著等等其它細菌學特征可以明顯地看出菌株YS9412－130是一種嗜低溫細菌，是與泥色黃桿菌密切相關的黃桿菌屬未知種菌株，而且該菌株與其它的已知菌株不同。因此這種菌株被認為是一種新的菌株。此外，屬于所述的菌株通過自發(fā)或者誘導突變而得到的且使產(chǎn)酶能力改進的突變體可以作為產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的細菌。為了制備這些突變體，可以使用常規(guī)的方法，例如紫外輻射或者用誘變劑(如N－甲基－N′－硝基－N－亞硝基胍(NTG))對原始菌株誘導人工突變后，將培養(yǎng)物接種到含有酪蛋白的瓊脂培養(yǎng)基中，從在菌落周圍形成較大清晰環(huán)帶的菌落中選擇具有最好產(chǎn)酶能力的突變株。而且可以通過在合適的宿主細胞中表達該酶基因，得到產(chǎn)生本發(fā)明低溫堿性蛋白酶的工程菌株。黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130的培養(yǎng)及低溫堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130的培養(yǎng)和低溫堿性蛋白酶的生產(chǎn)是在需氧條件下，培養(yǎng)于能使上述菌株生長并產(chǎn)生所述低溫堿性蛋白酶的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)溫度通常為5－37℃，優(yōu)選為5－25℃，更優(yōu)選為18－20℃。理想的初始培養(yǎng)pH為6－7，培養(yǎng)期限間微生物的適宜生長pH為6－9，優(yōu)選為6．7－7．5，pH的調(diào)節(jié)可以通過培養(yǎng)基消毒后加入合適的諸如磷酸緩沖液之類緩沖液進行調(diào)節(jié)到所需pH值。培養(yǎng)時間通常獲得最大的蛋白酶活性一般為20－60小時，優(yōu)選為30－40小時。所述需氧的條件，可以例如使用發(fā)酵罐或搖瓶培養(yǎng)來實現(xiàn)，當采用容量發(fā)酵罐培養(yǎng)時，必須進行人工通氣，通氣速率類似于常規(guī)大容量發(fā)酵罐采用通氣速率，例如1∶0．4－1∶2(V／V／分)。所述培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無機鹽等以及其它必要的營養(yǎng)物質(zhì)。無論是合成培養(yǎng)基還是天然的培養(yǎng)基都可使用，只要含有上述成份的。本發(fā)明的培養(yǎng)基中適合的碳源，只要是可使本發(fā)明菌株正常生長的碳源，其它并無特殊限制，從菌株增殖考慮，合適的碳源為碳水化合物，諸如蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、密糖、木糖、糖漿、甘油和可溶性淀粉之類的糖類，或者諸如谷粒、麥芽、大米和高梁之類的含糖類的物質(zhì)，優(yōu)選為甘露糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖及糖漿，所述碳源物質(zhì)可以單獨使用或二種以上配合使用(其配合比例任選)，加入培養(yǎng)基中的碳源如糖類以葡萄糖的當量計算其濃度可以在較大范圍內(nèi)變化，通常為0．5－10％(W／V)，優(yōu)選為5－8％(W／V)。所述培養(yǎng)基中氮源為有機氮化合物，常用的氮源為大豆粉，棉子粉、花生粉、酪蛋白、玉米浸液、酵母提取物，尿素、蛋白胨、白蛋白、豆餅粉、豆渣等，優(yōu)選為大豆粉、花生粉、酪蛋白。這些氮源物質(zhì)可單獨使用或二種以上配合使用(其配合比例任選)。所述氮源在培養(yǎng)基中添加濃度隨所選氮源種類以及培養(yǎng)基中除氮源以外其它培養(yǎng)基成份不同而各異，當使用氮源含量較高的氮源如大豆粉一般為1－5％(w／v)，優(yōu)選為2－3％(w／v)。所述無機鹽可以使用如鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋅等磷酸鹽或磷酸氫鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽，乙酸鹽。優(yōu)選為鉀、鈉、鈣、鎂的磷酸鹽或磷酸氫鹽及乙酸鹽。這些無機鹽可單獨使用或二種以上配合使用(其配合比例任選)。此外，可根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中還可適當添加消泡劑、植物油，表面活性劑、維生素類、血液或血液成份。粗酶的提取發(fā)酵液用離心機1000－4000，優(yōu)選3000轉(zhuǎn)／分鐘離心分離或如板框過濾，取所得上清液加入30％－75％飽和度硫酸銨或硫酸鈉沉淀酶蛋白；或每容積加入0．8－1．4容積的有機溶劑(諸如乙醇或丙酮等)作為沉淀劑，一般為95％(V／V)－96％(V／V)的工業(yè)用有機溶劑，例如工業(yè)用酒精或丙酮；或進行超濾截留2萬～7萬分子量范圍的組份；也可用薄膜蒸發(fā)器在35－40℃真空(640毫米汞柱左右)濃縮3－4倍。然后真空冷凍干燥，也可噴霧干燥得粗酶粉，根據(jù)需要可進一步純化。酶的純化發(fā)酵液用離心機4000轉(zhuǎn)／分離心分離，取上清液用30％－65％飽和度的硫酸銨分級沉淀，在10℃以下放置過夜。用離心機4000轉(zhuǎn)／分離心40分鐘，棄上清液，沉淀用預冷蒸餾水或適宜的緩沖液溶解得清液。將清液置4℃下用三(羥甲基)氨基甲烷－鹽酸緩沖液(PH7．2)透析24小時，取透析液上陰離子層析柱，以緩沖液洗滌平衡1～2小時，然后用0－1MNaCl·三(羥甲基)氨基甲烷－鹽酸緩沖液線性梯度洗脫，分部收集活性峰組份。合并活性峰組份，加65％飽和度的硫酸銨在4℃下放置過夜，離心棄上清液，用預冷蒸餾水溶解沉淀得清液，將此清液置4℃下用PH7．4磷酸緩沖液透析24小時，取清液上經(jīng)緩沖液平衡的分子篩柱(如SephaCryls－200)，然后用緩沖液洗脫，分部收集活性峰組份，真空冷凍干燥得純化酶。低溫堿性蛋白酶活性測定方法(Folin－酚試劑法)。將1ml適當稀釋的低溫堿性蛋白酶溶液(約20u／ml)在20℃恒溫水浴中預熱3－5分鐘，然后再將1ml預熱的2％(W／V)酪素溶液(pH10、50mM的硼砂－氫氧化鈉緩沖體系)加入到此溶液中，恒溫反應10分鐘后，加入2m10．4mol／L三氯乙酸溶液使反應終止。沉淀在40℃水浴中放置10分鐘以上，然后用2號濾紙過濾。取1ml濾液，分別加入5ml0．4mol／L的碳酸鈉、1ml用水稀釋2倍的福林試劑(磷鎢酸與磷鉬酸的混合物)，40℃下顯色20分鐘以上，冷至室溫，然后用分光光度計于波長680nm，10mm比色皿測定其吸光度。1ml液體酶在1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸定義為1個酶活力單位，以u／ml表示。低溫堿性蛋白酶本發(fā)明提供的新型低溫堿性蛋白酶是通過上述在合適的包含碳源、氮源及無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130或所述菌株其突變體、變體獲得；所述酶也可以通過重組DNA技術獲得。本發(fā)明提供的低溫堿性蛋白酶具有以下的理化性質(zhì)。(1)酶的基因以pUC19質(zhì)粒做載體、末端半補齊技術，構(gòu)建該酶的基因文庫，并從中篩選出陽性克隆。取重組質(zhì)粒，用核酸自動測序儀進行DNA序列的測定，基因序列為ATGACTGATCAGCGCAAAGGCAGCGATGCCGAACCCACCACGCACTTCGGTTTCAAAAATGTTCCGGAAAGCCAGAAAGCGGAAAAAGTCGCTGAGGTGTTCCATTCCGTAGCGGGCAAATATGACCTGATGAACGACGTTCTGTCGGGCGGCATGCACCGCCTGTGGAAGCGTTTCACCATCGAGCTGTCGGGCGTTCGCCCTGGCAACAAAGTGCTGGACATCGCAGGCGGCACGGGCGATCTGGCACGCAAGTTCTCGCATCTGGTCGGTCCAACCGGTCAAGTGGTGCTGGCCGACATCAACGCCTCGATGCTCAAGGTTGGCCGAGACCGCCTTTTGGACAAAGGCGTGGCGGGCAATATCGAATTTGTTCAGGCCGACGCTGAAAAGCTGCCGTTCCCGGACAACTACTTTGATTGCGTGACCATCGCTTTCGGCCTGCGCAATGTGACCCACAAAGAAGACGCCCTGCGTTCGATGCTGCGCGTGCTCAAGCCAGGGGGTCGCCTGCTGGTGCTGGAATTCTCCAAGCCGACCAATGCCCTGATGTCCAAGGTCTACGACGCCTATTCGTTCGCGTTCATGCCGATGGTTGGCAGCTCGTCCTCAACGACCCGGAAAGCTACCGCTACCTGGCCGAATCGATCCGCATGCACCCGAATCAGGAAACCCTGAAATCGATGATGGTCGAAGCCGGTTTTGACCGCGTGACGTACCACAACATGACCTCGGGCATTGTTGCCCTGCATCGCGGCATCAAGCCCTGA根據(jù)已測定的上述基因序列，用PC／GENE軟件將本發(fā)明所獲的低溫堿性蛋白酶與不同來源克隆得到的堿性蛋白酶進行氨基酸一級結(jié)構(gòu)同源性比較，本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶與絲氨酸蛋白酶有不同程度的同源性，大約為25－40％，而與其它已知的堿性蛋白酶無同源性。已知絲氨酸蛋白酶分為胰蛋白酶(trypsin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶Y(carboxypeptidaseY)三個家族，每個家族成員不僅在初級結(jié)構(gòu)上(如活性中心絲氧酸殘基周圍的氨基酸序列高度保守)具有同源性，而且三維結(jié)構(gòu)也十分相似。用[3H]DFP(二異丙基磷酰氟)鑒定本發(fā)明酶的活性中心氨基酸為絲氨酸，比較其與上述三種絲氨酸蛋白酶家族活性中心絲氨酸周圍的氨基酸順序，結(jié)果顯示該酶絲氨酸周圍的保守序列不同于已知的三個家族。因此，本發(fā)明所獲的低溫堿性蛋白酶屬于一個新的絲氨酸蛋白酶家族，為一新型低溫堿性蛋白酶。(2)酶的作用溫度和底物特異性本發(fā)明低溫堿性蛋白酶在40℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，所以在低溫下能有效地降解蛋白質(zhì)類，諸如蛋白污漬(奶、血、草汁)或肽及酪蛋白、血紅蛋白、白蛋白、肉蛋白質(zhì)、魚蛋白質(zhì)、大豆蛋白質(zhì)和人發(fā)鱗質(zhì)層角蛋白等蛋白質(zhì)。(3)分子量、等電點本發(fā)明酶基因編碼由792個核苷酸組成，分子量為32986Da，等電點為7．26。通過SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測得該酶的表觀分子量34，000±2，000。通過等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳測得該酶的等電點為7．5。(4)最適反應溫度、pH及穩(wěn)定范圍采用上述Folin－酚試劑法測定所述的低溫堿性蛋白酶活性，通過預先調(diào)整的pH緩沖體系，測定了不同pH對酶活性的影響(結(jié)果見圖1)。由圖可見該酶的有效pH穩(wěn)定范圍大約在5－11(不同pH條件下，20℃保溫24小時后于pH10測該酶的活性)；最適反應pH為9．5－10．5(20℃，反應時間10min)。通過上述相同的測酶活性方法，測定了不同溫度對酶活性的影響(結(jié)果見圖2)。由圖可見該酶的有效溫度穩(wěn)定范圍大約在40℃以下(不同溫度條件下，pH10保溫10min后于20℃測該酶的活性)；最適反應溫度為35℃(pH10，反應時間10min)。(5)酶與常規(guī)試劑的配伍性①金屬離子對低溫堿性蛋白酶活性的影響采用Folin－酚試劑法測定所述的低溫堿性蛋白酶活性，將下列影響因子按表1中所示濃度加入到此緩沖溶液中，研究了各種常見配伍金屬離子對本發(fā)明的酶活性的影響，結(jié)果見表1。表1．常見金屬離子對酶活性的影響*<tablesid="table5"num="005"><table>名稱濃度mM相對酶活保留率％不含金屬離子0100Cu2+559．7Hg2+54．2Pb2+554．8Ca2+5104Mg2+5106Mn2+598Ni2+596Co2+552Fe3+599Zn2+545．5K+5100Na+5100Ag+58．4</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常溫反應60min。②配伍化學試劑對酶活性的影響采用Folin－酚試劑法測定所述的低溫堿性蛋白酶活性，將下列影響因子按表2中所示濃度加入到此緩沖溶液中，研究了常見各種化學試劑對本發(fā)明的酶活性的影響，結(jié)果見表2。表2．化學試劑對酶活性的影響*<tablesid="table6"num="006"><table>名稱濃度相對酶活保留率(％)不含配伍試劑0100乙醇1％(V／V)95硼砂1％(W／V)100戊二醛1％(V／V)45尿素1％(W／V)95聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯(吐溫80)0．1％(W／V)91</table></tables><tablesid="table7"num="007"><table>聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯(吐溫40)0．1％(W／V)93乙二醇苯醚0．1％(W／V)91KH2PO41％(W／V)100Na2HPO41％(W／V)100Na2SO30．1％(W／V)90NaBO31％(W／V)100三羥甲基氨基甲烷(Tris)1mM109十二烷基硫酸鈉(SDS)0．1mM77直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)500ppm75</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常溫反應60min。③抑制物質(zhì)對酶活性的影響采用Folin－酚試劑法測定所述的低溫堿性蛋白酶活性，將下列影響因子按表3中所示濃度加入到此緩沖溶液中，研究了各種常見抑制物對本發(fā)明酶活性的影響(見表3)。結(jié)果甲苯磺酰氟(PMSF)強烈抑制該酶活性，說明本發(fā)明的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。但同時該酶也能被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制，因此可以認為本發(fā)明蛋白酶屬一種新的特殊絲氨酸蛋白酶。而一般絲氨酸蛋白酶可不被EDTA所抑制。表3．常見抑制物對酶活性的影響*<tablesid="table8"num="008"><table>名稱濃度mM相對酶活保留率％不含抑制物0100大豆蛋白抑制劑193對汞苯甲酸PCMV1100白蛋白酶抑制劑1100胰蛋白酶抑制劑196PMSF10．6EDTA13．6</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常溫反應60min。④穩(wěn)定劑(增稠劑)對酶活性的影響采用Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，將下列影響因子按表4中所示濃度加入到此緩沖溶液中，研究了常見各種增稠劑對本發(fā)明的酶的影響，結(jié)果見表4。表4．常見增稠劑對酶活性的影響*<tablesid="table9"num="009"><table>名稱濃度％(W／V)相對酶活保留率％不含增稠劑0100丙三醇198．6乙二醇195聚乙二醇192．2聚乙烯醇197甘露醇173．3海藻酸鈉191．5糊精1100．3阿拉伯膠199．1烷基酚聚氧乙烯醚(乳化劑OP)170．8明膠199．6瓊脂196．3橄欖油197．8胰蛋白胨190．1</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常溫反應60min。(6)酶穩(wěn)定性本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶能夠滿足至少下列條件之一①按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，25℃下在含過氧化氫(H2O2)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活性不低于95％。②按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，25℃下在含1％(W／V)過硼酸鈉(NaBO3)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖溶夜pH10，Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活性不低于90％。③按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，25℃下在含直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，LAS500ppm、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活不低于65％。④按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，25℃下在含過硫酸鈉(Na2SO3)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活不低于90％。⑤按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，10℃下在含5％(W／V)NaCl緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10、Ca2+5mM)中放置12小時后剩余酶活不低于70％。⑥按Folin－酚試劑法測定所述的蛋白酶活性，25℃下在含2％(V／V)乙醇緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10、Ca2+5mM)中放置12小時后剩余酶活不低于70％。特點與效果(1)本發(fā)明的產(chǎn)酶菌株及其突變體是很容易處理的常溫生長型新菌株，能有效地生產(chǎn)出本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶與其它化學試劑、酶類、氧化劑、抑制劑配伍是穩(wěn)定的且有效反應溫度較低。因此，用本發(fā)明蛋白酶處理蛋白質(zhì)或者多肽(例如人發(fā)、魚肉、水溶性糖蛋白等)，生產(chǎn)其它水溶性更好的多肽或者游離氨基酸較為經(jīng)濟。(2)本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶在與常用的陰離子表面活性劑如直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)和／或烷基硫酸鹽(AS)等配伍時，比常規(guī)堿性蛋白酶更穩(wěn)定，甚至在常規(guī)酶易失活或活性極低的苛刻條件下，本發(fā)明的蛋白酶仍可應用。例如，不僅可以在含有釋氧漂白劑的環(huán)境中使用，可以在水硬度指標超過250ppm甚至天然海水的條件下使用，而且在小于10℃的環(huán)境下也可以正常使用。(3)本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶為一種耐堿性對低溫區(qū)適應性好、氧化穩(wěn)定型洗滌劑蛋白酶。與目前已有的ProperaseCT(GENENCOR國際公司，美國)及Savinase4．0T(NOVO公司，丹麥)等商品低溫堿性蛋白酶相比，對低溫區(qū)有突出的適應性和抗氧化穩(wěn)定性(見圖3、圖4)，圖3是不同低溫酶對溫度的適應性比較圖例，圖4是不同堿性蛋白酶在氧化劑中的穩(wěn)定性比較圖例。用于洗滌劑組合物中能有效地降解標準“污布”上的蛋白質(zhì)(見圖6)，圖6表示不同酶在去污劑中穩(wěn)定性，可以增加其去垢性。低溫區(qū)洗滌效果明顯優(yōu)于市售蛋白酶，本發(fā)明低溫堿性蛋白酶在洗滌劑或去污劑中使用量一般為0．0001－1．0％(wt)即可。(4)本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶具有酶解人發(fā)鱗質(zhì)層專一性，水解進程易控制在鱗質(zhì)層的非結(jié)晶區(qū)，能極大程度的保護人發(fā)皮質(zhì)層。與傳統(tǒng)的“酸法脫鱗”技術相比，“酶法脫鱗”工藝極大的減少了環(huán)境污染，其排放污水中總懸浮物含量(mg／L)減少88．2％、化學耗氧量(COD，mg／L)減少90％。色發(fā)成品合格率大于95％。(5)本發(fā)明的低溫堿性蛋白酶能特異性水解海洋動物蛋白以制備海洋抗氧化活性多肽(具有抗氧化防曬和增強免疫功效)具有專一性。與市售常規(guī)蛋白酶相比，該酶僅對甲殼類動物肝胰腺組織有專一性，并在＜10℃條件下(保證酶解底物不致于因溫度關系而失去生物活性)表現(xiàn)出足夠的酶解活性。生產(chǎn)的活性肽為含精氨酸、脯氨酸等幾種氨基酸的短肽，分子量范圍主要在800Dal、pH4－9介質(zhì)中有良好的溶解性。在相同濃度條件下，活性肽對O－2。的清除能力與超氧化物歧化酶(SOD)相似。能顯著減輕地塞米松對免疫細胞的抑制作用，同時可以促進免疫細胞的活性。以濃度3％的條件測定其HPF(防曬系數(shù))值約為35。本發(fā)明提供的新的黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130及由它產(chǎn)生的低溫堿性蛋白酶具有很高的經(jīng)濟價值?？蓮V泛應用于以下方面(并不限于下列方面)日用化工業(yè)化學合成洗衣粉、液體洗滌劑、化妝品、牙膏、洗浴液和脫毛劑等。食品加工業(yè)肉類加工、制備海洋抗氧化活性肽等。輕工產(chǎn)品加工業(yè)纖維加工、羊毛加工、皮革脫毛和人發(fā)(假發(fā)制品)前處理等。此外，本發(fā)明的蛋白酶還可以用于飼料加工、光學鏡頭的清洗及臨檢用生化試劑等。本發(fā)明用下列實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于下列實施例。實施例1產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)及低溫堿性蛋白酶的生產(chǎn)20℃下將本發(fā)明黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130在500ml含有0．6％(V／V)甘露糖、2．4％大豆粉、0．02％NaH2PO4、0．2％K2HPO4、0．06％Ca(AC)2的培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)55小時(用1M氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到6－7)，然后可在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并分泌所述的低溫堿性蛋白酶。4℃下以1000G離心此培養(yǎng)物，獲得含有本發(fā)明酶的上清液。上清液中的酶的活性大約為5000u／ml(用上述Folin－酚試劑法測定)。實施例2低溫堿性蛋白酶的純化將在實施例1．中獲得的培養(yǎng)物的上清液再用30％－65％飽和度的(NH4)2SO4分級沉淀，離心收取沉淀。將沉淀溶解在20mM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)－鹽酸(HCl)緩沖液(pH6．5，含2mMCaCl2)中，并對此緩沖液透析24小時。在所述pH條件下，將透析液過二乙氨乙基一瓊脂糖(DEAE－SepharoseFF)陰離子交換層析柱，用0－0．5MNaCl·Tris－HCl緩沖液(20mM，pH6．5)梯度洗脫，收集活性組分再經(jīng)SephacrylS－200凝膠過濾洗脫、收集所述的低溫堿性蛋白酶。然后進行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，經(jīng)考馬斯亮蘭染色為單一條帶，激光灰度掃描結(jié)果，樣品純度大于95％。實施例3在氧化劑中的穩(wěn)定性比較按照下列條件和方法研究了本發(fā)明酶對氧化劑的穩(wěn)定性。將H2O2(20mM)溶解于濃度50mM、pH10．0并含有1000ppmCa2+的硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液中，將本發(fā)明酶和其它市售堿性蛋白酶(2709、CW302)分別加入到此緩沖液，調(diào)整各初始酶活性大約為20u／ml于25℃恒溫不同時間。在20℃下定期檢測剩余酶活性(以開始時活性保留率為100％)，結(jié)果見圖4。與市售常規(guī)酶相比，本發(fā)明酶在氧化劑中具有良好的穩(wěn)定性。實施例4在去污劑溶液中的穩(wěn)定性與比較按照下列條件和方法研究了本發(fā)明酶在市售去污劑(國標普粉，徐州合成洗滌劑廠生產(chǎn))中的穩(wěn)定性。將去污劑(1000ppm)溶解于濃度50mM、pH10．0并含有1000ppmCa2+的硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液中，將此酶和其它市售堿性蛋白酶(2709、CW302)分別加入到此緩沖液，調(diào)整各初始酶活性大約為20u／ml于25℃恒溫不同時間。在20℃下定期檢測剩余酶活性(以開始時活性保留率為100％)，結(jié)果見圖5，圖5是各種蛋白酶在去污劑中穩(wěn)定性比較。與市售常規(guī)洗滌用酶相比，本發(fā)明酶在市售去污劑中具有顯著的穩(wěn)定性。實施例5在合成洗衣粉中的去污性能與比較用實施例1相同的方式獲得的培養(yǎng)物的上清液，經(jīng)超濾膜濃縮、冷凍干燥制備出此酶的粗制品。將得到的粗制品酶加入到基礎洗滌劑(“白貓”洗衣粉)中，以相同的酶含量(50nM)、不同的洗滌溫度進行去污性能試驗。試驗采用“標準污布”在一個模擬的洗滌系統(tǒng)中進行，其中織物／洗滌液大約為5g／L，每種酶在規(guī)定條件下獨立試驗兩次，結(jié)果取平均值。通過測定污布洗滌后的白度變量ΔR(ΔR=加酶洗滌污布白度值－基礎洗滌劑污布白度值)，比較去污效果；以市售Properes(洗滌用低溫堿性蛋白酶，美國GENENCOR公司生產(chǎn))和CAP(國產(chǎn)洗滌用堿性蛋白酶，浙江德清生化總公司生產(chǎn))作為檢測去污性對照(見圖6)，圖6不同溫度下各種蛋白酶的洗滌效能。試驗結(jié)果表明與市售常規(guī)洗滌用酶相比，本發(fā)明酶的加入增加了市售洗衣粉的去污有效性能，且低溫區(qū)效果明顯好于對照洗滌用蛋白酶。其它試驗條件渦輪式去污機，攪拌速度100轉(zhuǎn)／min。瑞士產(chǎn)“EMPA－117人工污布”、不欲浸泡洗滌，洗滌時間20min、洗滌后水沖洗時間20min；基礎洗滌劑添加量2．0g／L、洗滌液pH10．0、洗滌溫度20℃、水硬度150ppmCa2+。施例6用于假發(fā)制品(人發(fā))酶法“脫鱗”效果試驗用實施例1相同的方式獲得的培養(yǎng)物的上清液，經(jīng)超濾膜濃縮后加入丙三醇2．5％(W／V)、Ca(Ac)21．0％(W／V)、糊精0．5％(W／V)，制備液體濃縮酶。將此液體濃縮酶按5％(V／V)濃度溶解于50mM、pH9并含有1000ppmCa2+的硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液中，25℃條件下進行人發(fā)“脫鱗”試驗。試驗中頭發(fā)／酶解液大約為80－100g／L，酶解時間7－9小時。通過測定水解產(chǎn)物中主要組成氨基酸量(結(jié)晶區(qū)主要以胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸的殘基為代表；非結(jié)晶區(qū)主要以脯氨酸殘基為代表)，比較酶法“脫鱗”效果(控制水解反應集中在鱗質(zhì)層的非結(jié)晶區(qū))；以傳統(tǒng)酸法技術(硫酸+次氯酸鈉法)在推薦的最適條件作為對照(圖7)，圖7酸法與酶法脫鱗效果試驗與比較。試驗結(jié)果表明與傳統(tǒng)采用的酸法“脫鱗”相比，本發(fā)明的酶具有“脫鱗”專一性，且應用酶法“脫鱗”不僅可提高產(chǎn)品收率而且消除了生產(chǎn)過程對環(huán)境的污染。實施例7酶法制備“海洋抗氧化活性多肽”試驗海洋抗氧化活性肽系從海洋甲殼類動物提取的特定物質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后分離的活性產(chǎn)物，有確定的抗紫外線氧化損傷、清除活性氧自由基和免疫增強劑的作用。用實施例1相同的方式獲得的培養(yǎng)物的上清液，經(jīng)超濾膜濃縮、冷凍干燥制備出此酶的粗制品。將得到的粗制品酶以含量5％(W／W相對于作用底物)的比例加入到含特定提取物質(zhì)的硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液中(pH8．5、濃度50mM并含有1000ppmCa2+)，25℃條件下進行“海洋抗氧化活性多肽”制備試驗。試驗中底物濃度約2－5％(W／V)，酶解時間10－12小時。在不同的水解時間，通過測定水解產(chǎn)物對O－2。的清除能力或抗紫外線(UV)的HPF值，比較酶法制備效率；以市售537酸性蛋白酶(水解條件50℃、pH3)、AS1398中性蛋白酶(水解條件50℃、pH7)、胰蛋白酶(水解條件37℃、pH8)在各自推薦的最適條件作為對照(圖8)，圖8為多肽抗氧化效果與比較圖。試驗結(jié)果表明與市售酶相比，本發(fā)明的酶具有制備“海洋抗氧化活性多肽”的專一性。權利要求1．一種黃桿菌(Flavobacterium)屬未知種菌株YS9412－130，該菌株保藏在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為M200014。2．一種低溫堿性蛋白酶，其特征在于由黃桿菌屬未知種菌株YS9412－130產(chǎn)生的低溫堿性蛋白酶。3．根據(jù)權利要求2的低溫堿性蛋白酶，其特征在于酶的基因序列為ATGACTGATCAGCGCAAAGGCAGCGATGCCGAACCCACCACGCACTTCGGTTTCAAAAATGTTCCGGAAAGCCAGAAAGCGGAAAAAGTCGCTGAGGTGTTCCATTCCGTAGCGGGCAAATATGACCTGATGAACGACGTTCTGTCGGGCGGCATGCACCGCCTGTGGAAGCGTTTCACCATCGAGCTGTCGGGCGTTCGCCCTGGCAACAAAGTGCTGGACATCGCAGGCGGCACGGGCGATCTGGCACGCAAGTTCTCGCATCTGGTCGGTCCAACCGGTCAAGTGGTGCTGGCCGACATCAACGCCTCGATGCTCAAGGTTGGCCGAGACCGCCTTTTGGACAAAGGCGTGGCGGGCAATATCGAATTTGTTCAGGCCGACGCTGAAAAGCTGCCGTTCCCGGACAACTACTTTGATTGCGTGACCATCGCTTTCGGCCTGCGCAATGTGACCCACAAAGAAGACGCCCTGCGTTCGATGCTGCGCGTGCTCAAGCCAGGGGGTCGCCTGCTGGTGCTGGAATTCTCCAAGCCGACCAATGCCCTGATGTCCAAGGTCTACGACGCCTATTCGTTCGCGTTCATGCCGATGGTTGGCAGCTCGTCCTCAACGACCCGGAAAGCTACCGCTACCTGGCCGAATCGATCCGCATGCACCCGAATCAGGAAACCCTGAAATCGATGATGGTCGAAGCCGGTTTTGACCGCGTGACGTACCACAACATGACCTCGGGCATTGTTGCCCTGCATCGCGGCATCAAGCCCTGA酶的作用溫度和底物特異性所述酶在40℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，能在低溫下有效地降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)；分子量理論計算所述酶基因編碼由792個核苷酸組成，分子量為32986Da；SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測得酶的表觀分子量34，000±2，000；等電點理論計算等電點為7．26，等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳測得該酶的等電點為7．5。最適反應溫度35℃；有效穩(wěn)定溫度40℃以下；最適pH9．5－10．5；pH穩(wěn)定范圍5－11；與常規(guī)試劑配伍初始酶活2000u／ml，常溫反應60min。<tablesid="table1"num="001"><table>名稱濃度相對酶活保留率％無任何試劑配伍0100Cu2+5mM59．7Hg2+5mM4．2Pb2+5mM54．8Ca2+5mM104Mg2+5mM106Mn2+5mM98Ni2+5mM96Co2+5mM52Fe2+5mM99Zn2+5mM45．5K+5mM100Na+5mM100Ag+5mM8．4乙醇1％(v／v)95硼砂1％(w／v)100戊二醛1％(w／V)45尿素1％95聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯(吐溫80)0．1％(w／v)91聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯(吐溫40)0．1％(w／v)93乙二醇苯醚0．1％(w／v)91KH2PO41％(w／v)100NaHPO41％(w／v)100Na2SO30．1％(w／v)90NaBO31％(w／v)100三羥甲基氨基甲烷(Tris)1mM109十二烷基硫酸鈉(SDS)0．1mM77直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)500ppm75大豆蛋白抑制劑1mM93對汞苯甲酸PCMV1mM100</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>白蛋白酶抑制劑1mM100胰蛋白酶抑制劑1mM96PMSF1mM0．6EDTA1mM3．6丙三醇1(W／V)98．6乙二醇1(W／V)95聚乙二醇1(W／V)92．2聚乙烯醇1(W／V)97甘露醇1(W／V)73．3海藻酸鈉1(W／V)91．5糊精1(W／V)100．3阿拉伯膠1(W／V)99．1烷基酚聚氧乙烯醚(乳化劑OP)1(W／V)70．8明膠1(W／V)99．6瓊脂1(W／V)96．3橄欖油1(W／V)97．8胰蛋白胨1(W／V)90．1</table></tables>4．一種由黃桿菌屬未知種菌株YS－9412－130產(chǎn)生的低溫堿性蛋白酶的制造方法，該方法包括(1)發(fā)酵培養(yǎng)在需氧條件下，將本發(fā)明的黃桿菌屬未知種菌株YS－9412－130培養(yǎng)于能使所述菌株生長并產(chǎn)生所述低溫堿性蛋白酶的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度5－37℃，pH為6－9，培養(yǎng)時間20－60小時；(2)酶的提取發(fā)酵液以1000－4000G離心或過濾得上清液，加入30％－75％飽和硫酸銨或硫酸鈉，或乙醇或丙酮之類有機溶劑進行沉淀，或超濾截留2萬－7萬分子量范圍的組分；或用薄膜蒸發(fā)器在35－40℃，640毫米汞柱左右真空下濃縮3－4倍；然后真空冷凍干燥或噴霧干燥得粗酶粉；(3)酶的純化將上述沉淀用預冷蒸餾水溶解得清液，將清液置緩沖液中透析24小時，透析液上陰離子層析柱層析，用0－1MNaCl緩沖液線形梯度洗脫，收集活性組分，加65％飽和度的硫酸銨在4℃下放置過夜，離心棄上清液再用預冷蒸餾水溶解沉淀得清液，取清液上經(jīng)緩沖液平衡的分子篩柱，用緩沖液洗脫，收集活性峰組分，再進行真空冷凍干燥得純化低溫堿性蛋白酶。5.根據(jù)權利要求4的制造方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為18－20℃，pH為6．7－7．5，時間30－40小時。6.根據(jù)權利要求4的制造方法，其中所述培養(yǎng)基中的所述碳源為甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖及糖漿；所述氮源為大豆粉、花生粉、酪蛋白；所述無機鹽為K、Na、Ca、鎂的磷酸鹽或磷酸氫鹽或乙酸鹽。7.一種根據(jù)權利要求2－3的低溫堿性蛋白酶用于制備海洋抗氧化活性肽。8.一種根據(jù)權利要求2－3的低溫堿性蛋白酶用于假發(fā)制品、酶法脫鱗的前處理。9.一種根據(jù)權利要求2－3的低溫堿性蛋白酶用作洗滌組合物、其用量為0．0001－1．0％。10.一種根據(jù)權利要求2－3的低溫堿性蛋白酶用于去污劑組合物質(zhì)，使用量為0．0001－1．0％。11.一種根據(jù)權利要求2－3的低溫堿性蛋白酶用于化妝品、脫毛劑、去皮革脫毛、纖維和羊毛加工、飼料加工、生化試劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的黃桿菌屬末知種菌株YS9412—130,保藏在中國武漢CCTCC,保藏號為M200014。由該菌株或其突變體產(chǎn)生的新型低溫堿性蛋白酶,該蛋白酶在低溫條件下具有低活化能和高活性比,能有效降解蛋白類;酶基因編碼由792個核苷酸組成,與絲氨酸蛋白酶有不同程度的同源性,但不同于已有絲氨酸蛋白酶家族,為一種新生型絲氨酸蛋白酶家族,它廣泛應用于洗滌領域,制備抗氧化活性肽、發(fā)制品、飼料加工品等。文檔編號C12N15/57GK1280186SQ0012340公開日2001年1月17日申請日期2000年8月15日優(yōu)先權日2000年8月15日發(fā)明者孫謐,王躍軍,張云波申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所