專利名稱：骨形態(tài)發(fā)生蛋白重組腺病毒及其激發(fā)骨生成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)重組腺病毒，以及用所述腺病毒刺激骨生成的方法。
骨骼在哺乳動(dòng)物中起著支架作用。由于種種原因，骨頭會(huì)受到損傷，例如骨折和腫瘤破壞等。因此需要開(kāi)發(fā)有效地刺激骨生成的方法以及相關(guān)材料和設(shè)備。
目前臨床上，仍在采用從病人身體的某個(gè)部位采集骨組織，然后植入需要修復(fù)的部位的方法。這種方法使病人必須承受額外的手術(shù)痛楚。而在一些情況下，病人本身不能提供足夠的骨組織供修復(fù)部位之用。
同時(shí)，在本發(fā)明之前，運(yùn)用傳統(tǒng)基因工程方法產(chǎn)生的BMP(BoneMorphogenetic Protein)刺激骨生成都是按下述方法進(jìn)行利用基因重組技術(shù)在體外生成BMP(主要在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))→用蛋白分離技術(shù)純化BMP蛋白→BMP蛋白混入固體載體(如膠原蛋白海綿)→植入病人或動(dòng)物體內(nèi)以刺激生骨。
然而，在上述方法中存在著如下缺點(diǎn)(1)BMP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低，因而制備蛋白成本高昂。
(2)BMP蛋白置入體內(nèi)后會(huì)被迅速酶解/降解，從而失去活性，因而要達(dá)到體內(nèi)生骨所需的劑量極高(文獻(xiàn)報(bào)道都在毫克級(jí))。這與缺點(diǎn)(1)相加造成更高的成本。
(3)由于需要固體載體，因此必須進(jìn)行外科手術(shù)予以植入。此外，植入部位必須有物理空間允許固體載體放入。這限制了上述方法的應(yīng)用，并且對(duì)病人也造成了一定的痛楚。
因此，本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)迫切需要新的有效、方便和/或價(jià)廉的刺激骨生成的方法及其相關(guān)材料和設(shè)備。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的有效、方便和/或價(jià)廉的刺激骨生成的方法。較佳地，該方法對(duì)病人造成的痛楚小于現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明的另一目的是提供用于所述方法的材料。
本發(fā)明的再一目的是提供用本發(fā)明方法形成的骨或骨組織前體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種復(fù)制缺陷型的病毒，該病毒編碼表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白，并且所述的病毒選自腺病毒、腺伴隨病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。較佳地，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白選自BMP-2、BMP-4、BMP-7。更佳地，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白是BMP-2。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)細(xì)胞，它表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白。較佳地，該間充質(zhì)細(xì)胞是用本發(fā)明上述的的病毒轉(zhuǎn)化的。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)以刺激骨頭生長(zhǎng)的接種物，該接種物含有本發(fā)明上述的間充質(zhì)細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外產(chǎn)生骨或骨組織前體的方法，它包括步驟在適合細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)細(xì)胞，使其在體外分化成骨組織前體或骨母細(xì)胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種在體內(nèi)刺激骨生成的方法，它包括步驟將本發(fā)明上述的接種物植入需要骨生成的部位。
附圖中，


圖1顯示了重組腺病毒Adv-BMP2的構(gòu)建過(guò)程。
圖2顯示了在體外Adv-BMP2在間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。
圖3顯示了在體外Adv-BMP2影響下，細(xì)胞增殖與時(shí)間的關(guān)系。
圖4顯示了在體外Adv-BMP2影響下，細(xì)胞增殖與Adv-BMP2劑量的相關(guān)性。
圖5顯示了受Adv-BMP2感染的間充質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中堿性磷酸酶活性升高。
圖6顯示了受Adv-BMP2感染的間充質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)15-20天，有鈣離子沉淀的發(fā)生。
圖7顯示了在用本發(fā)明方法處理的小鼠中，新骨組織在大腿肌肉中生成的情況。其中圖7A是無(wú)任何處理；圖7B是注射未處理過(guò)的細(xì)胞；圖7C是注射Adv-βgal處理過(guò)的細(xì)胞；圖7D是注射Adv-BMP2處理過(guò)的細(xì)胞。
圖8是對(duì)用本發(fā)明方法刺激生成的小鼠肌肉內(nèi)新骨的組織學(xué)檢查的照片。
圖9顯示了在用本發(fā)明方法處理的兔子脊柱部位新骨生成的情況。
圖10是對(duì)用本發(fā)明方法形成的兔子新骨進(jìn)行組織學(xué)檢查的照片。
圖11顯示了在用本發(fā)明方法處理的豬脊柱椎體間新骨生成的情況。圖中，實(shí)心箭頭用Adv-BMP2轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞造成上下椎體融合；空心箭頭用Adv-βgal轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞不造成上下椎體融合(無(wú)變化)。
圖12是對(duì)用本發(fā)明方法形成的豬新骨進(jìn)行組織學(xué)檢查的照片。其中，
圖12A顯示組織學(xué)檢查可見(jiàn)在椎體之間形成了新的骨組織；
圖12B顯示了正常錐體之間的軟體組織。
發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于采用基因轉(zhuǎn)移(基因治療)的手段，將BMP基因轉(zhuǎn)入間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。利用間充質(zhì)細(xì)胞作為制備工廠持續(xù)性地產(chǎn)生BMP蛋白。當(dāng)轉(zhuǎn)入BMP基因的間充質(zhì)細(xì)胞被置入體內(nèi)后，間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的BMP蛋白可以刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞自分泌刺激(autocrine)或者使受者體內(nèi)其他的間充質(zhì)細(xì)胞旁分泌刺激(paracrine)，從而使間充質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)育生成新骨。
如本文所用，“骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)”包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的任何成員，目前BMP基因家族逐步發(fā)現(xiàn)了14-15個(gè)相似基因，它們都具有刺激骨頭生成的功能。任何BMP蛋白都可用于本發(fā)明。較佳地，骨形態(tài)發(fā)生蛋白選自BMP-2、BMP-4、BMP-7。更佳地，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是BMP-2。
如本文所用，“復(fù)制缺陷型病毒”指作為載體的病毒感染細(xì)胞后，不能自我復(fù)制。
如本文所用，“間充質(zhì)細(xì)胞”指各種具有分化發(fā)育成骨細(xì)胞、骨前體細(xì)胞的細(xì)胞，它包括各種干細(xì)胞、前體細(xì)胞和普通的間充質(zhì)細(xì)胞。
任何在本領(lǐng)域中用作載體的病毒都可用于本發(fā)明，尤其是是已經(jīng)在基因治療領(lǐng)域中使用的病毒，如腺病毒、腺伴隨病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。較佳地這些病毒是復(fù)制缺陷型病毒。
本發(fā)明適用于所有的哺乳動(dòng)物，其中包括(但并不限于)人、狗、貓、羊、牛、馬、豬、老虎等。本發(fā)明可用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
在本發(fā)明中，首先構(gòu)建含BMP基因的載體。這可以用常規(guī)方法完成。
在構(gòu)建了含BMP基因的載體(如病毒)后，可用常規(guī)技術(shù)將含BMP基因的病毒和間充質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合，即利用病毒載體將BMP基因?qū)腴g充質(zhì)細(xì)胞。這是本發(fā)明極為重要的一步。用間充質(zhì)細(xì)胞作為BMP基因的受體細(xì)胞，不僅可以產(chǎn)生自分泌刺激和旁分泌刺激效應(yīng)。同時(shí)又能在體內(nèi)外持續(xù)地產(chǎn)生BMP蛋白和效應(yīng)，從而提供優(yōu)異的刺激骨生成的效果。
獲得了轉(zhuǎn)入BMP基因的間充質(zhì)細(xì)胞之后，便可進(jìn)一步培養(yǎng)可獲得更多的細(xì)胞，或者冷凍備用，或者直接將其用于刺激骨生成。
刺激骨生成的方式有兩大類。一類是利用體外組織工程。用本發(fā)明的上述的轉(zhuǎn)入BMP基因的間充質(zhì)細(xì)胞，可以在通過(guò)常規(guī)的體外培養(yǎng)技術(shù)而生成組織。已表明，本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中可分化發(fā)育成成骨母細(xì)胞(osteoblast)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，已經(jīng)顯示了在體外形成了骨及骨組織前體。
另一類是直接在臨床上應(yīng)用。它包括制造一種用于植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)以刺激骨頭生長(zhǎng)的接種物，它含有本發(fā)明上述的導(dǎo)入了BMP基因的間充質(zhì)細(xì)胞。一種接種物的例子就是含導(dǎo)入了BMP基因的間充質(zhì)細(xì)胞的混懸液。然后，通過(guò)例如直接注射或手術(shù)方式，將所述的接種物植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)需要骨生成的部位，以刺激骨生成，從而形成新骨。本發(fā)明在臨床上的應(yīng)用范圍可涵蓋骨外科、整形外科和神經(jīng)外科，以及所有臨床上應(yīng)用骨組織、骨生成、骨融合的場(chǎng)合。
具體地，本發(fā)明有如下具體應(yīng)用場(chǎng)合1、臨床上常見(jiàn)有骨折后不能愈合的病例。Adv-BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞可用于直接注射入骨折不愈部位，產(chǎn)生自分泌刺激和旁分泌刺激效應(yīng)促進(jìn)骨折愈合。
2、骨科與整形外科的臨床治療上經(jīng)常要從病人身上的某個(gè)部位截取骨骼，用于其它的手術(shù)部位。本發(fā)明方法可以省卻此截取骨骼手術(shù)，減少病人痛苦，尤其對(duì)在體能上已不能再承受額外手術(shù)的病人，提供新的治療機(jī)會(huì)。
3、本發(fā)明還可用于在骨科與整體外科的骨腫瘤手術(shù)后，缺失部位的重新填合生長(zhǎng)新骨。
4、本發(fā)明可用于體外組織工程。在體外生成骨或骨組織的前體結(jié)構(gòu)，植入體內(nèi)后迅速成骨。
5、骨科脊椎融合手術(shù)。傳統(tǒng)方法使用鋼板固定或自體骨。本方法可用注射法省卻手術(shù)造成脊椎融合。
6、所有其它使用骨組織，促使骨組織生成的場(chǎng)合，都可使用本發(fā)明方法。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)不須在體外表達(dá)和分離純化BMP蛋白，從而省卻了工廠化制備BMP的過(guò)程和成本。
(2)接受基因轉(zhuǎn)移的間充質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)外能持續(xù)地產(chǎn)生BMP蛋白而維持持續(xù)的生物活性作用，從而避免了以往BMP蛋白植入體內(nèi)后迅即消化失活的問(wèn)題。
(3)基因轉(zhuǎn)移后的間充質(zhì)細(xì)胞可以用直接注射或手術(shù)的方法植入體內(nèi)，從而消除了必須使用固體載體的障礙，因而減少了臨床應(yīng)用的限制。此外，對(duì)病人造成的痛楚小于現(xiàn)有技術(shù)。
(4)擔(dān)當(dāng)基因轉(zhuǎn)移的腺病毒因其自身的抗原性可引發(fā)受者體內(nèi)的免疫反應(yīng)，最終予以清除。因此，避免了基因轉(zhuǎn)移后的間充質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)無(wú)限制地刺激生骨的后果。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例(1)構(gòu)建攜帶BMP-2基因的重組腺病毒人BMP-2基因來(lái)自ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。用分子克隆手段將人BMP-2基因插入表達(dá)質(zhì)粒PAC中形成質(zhì)粒PAC-BMP2。在此質(zhì)粒中，BMP-2基因受巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(cytomegalovirus，early gene promoter/enhancer)的控制。用XhoI將PAC-BMP2切割成線狀。
將純化制備的腺病毒/5型(adenovirus type 5)用蛋白酶K消化(56℃，過(guò)夜)，以降解病毒蛋白外殼釋放出病毒的基因組DNA。用ClaI內(nèi)切酶對(duì)腺病毒的基因組DNA進(jìn)行消化(37℃，60分鐘)，從而產(chǎn)生一大，一小兩個(gè)DNA片段。用瓊脂電泳法分離這二個(gè)片段然后收獲大的DNA片段稱為ClaI大片段。
用lipofectamine將XhoI切割后的PAC-BMP2和腺病毒ClaI大片段共轉(zhuǎn)染(co-transfection)入293細(xì)胞內(nèi)。10天后點(diǎn)取形成的病毒空斑。經(jīng)進(jìn)一步的空斑純化和擴(kuò)增后，此重組腺病毒稱為Adv-BMP2(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)
圖1)。
該重組腺病毒5型Adv-BMP2于2000年7月11日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)，CCTCC保藏號(hào)為V200004。
實(shí)施例2將BMP基因轉(zhuǎn)入間充質(zhì)細(xì)胞重組的腺病毒已經(jīng)失去在普通細(xì)胞內(nèi)的增殖和殺死細(xì)胞的功能。只作為載體可將其攜帶的BMP-2基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。用Adv-BMP2感染各種間充質(zhì)細(xì)胞(包括小鼠C3H10T1/2細(xì)胞和兔及豬的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞)，然后在體外培養(yǎng)5天。
收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用特異性抗人BMP2的抗體進(jìn)行免疫沉淀(immunoprecipitation)后作免疫印染(Western blot)試驗(yàn)。在Adv-BMP2感染的細(xì)胞培養(yǎng)液中可見(jiàn)特異的BMP-2條帶。而在其它對(duì)照組中則無(wú)。這表明Adv-BMP2介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)移可以在間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生人BMP-2蛋白(圖2)。
實(shí)施例3Adv-BMP2轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)細(xì)胞在體外的分化發(fā)育用Adv-BMP2感染各種間充質(zhì)細(xì)胞(如小鼠、兔及豬)后，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，受染的間充質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)下述變化A、間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。增殖受染后的間充質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)后的第7天可比對(duì)照間充質(zhì)細(xì)胞(未處理過(guò)的間充質(zhì)細(xì)胞和無(wú)活性重組腺病毒感染間充質(zhì)細(xì)胞)增殖3倍數(shù)目(圖3)。而且間充質(zhì)細(xì)胞增殖的效應(yīng)與Adv-BMP2的用量成正比(圖4)。Adv-BMP2用量大，間充質(zhì)細(xì)胞增殖多，反之則少。
B、間充質(zhì)細(xì)胞分化。受Adv-BMP2感染的間充質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)向成骨母細(xì)胞分化。其標(biāo)志為堿性磷酸酶活性升高。對(duì)照間充質(zhì)細(xì)胞則維持堿性磷酸活性不變(圖5)。
C、鈣離子沉淀。受Adv-BMP2感染的間充質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)15-20天，可呈現(xiàn)Van Cossa染色陽(yáng)性，這標(biāo)志著鈣離子沉淀的發(fā)生。此現(xiàn)象為典型的體外成骨母細(xì)胞/成骨細(xì)胞的又一標(biāo)志。而對(duì)照間充質(zhì)細(xì)胞無(wú)此反應(yīng)(圖6)。
實(shí)施例4Adv-BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后的間充質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)生成新骨將Adv-BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后的間充質(zhì)細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)可生成新骨，植入的方法可是直接注射或手術(shù)放入A、在小鼠體內(nèi)生成新骨當(dāng)將Adv-BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后的C3H10T1/2細(xì)胞注射入小鼠的股部肌肉后三周。X光檢查可在注射部位的肌肉內(nèi)發(fā)現(xiàn)新骨(圖7)。用組織學(xué)檢查進(jìn)一步確認(rèn)在肌肉內(nèi)生成的新骨具有完整的各種骨組織形態(tài)，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨髓腔瓊(圖8)。對(duì)照組無(wú)變化。
B、在兔子體內(nèi)生成新骨當(dāng)將Adv-BMP2轉(zhuǎn)染后的自身兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞用手術(shù)方法植入兔背部的脊柱骨部位。4-5周后的X光檢查可見(jiàn)新骨生成(圖9)。進(jìn)一步的組織學(xué)檢查確認(rèn)完整的骨組織形態(tài)(
圖10)。對(duì)照組無(wú)變化。
C、在豬體內(nèi)生成新骨當(dāng)將Adv-BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后的自身豬骨髓間充質(zhì)細(xì)胞用手術(shù)方法植入脊柱椎體間的空隙。6周后X光檢查可在椎體間隙中發(fā)現(xiàn)新形成的骨(
圖11)。新生成的骨組織可將上下椎體連成一體造成融合。組織學(xué)檢查確認(rèn)新骨的組織學(xué)特征(
圖11，
圖12A和12B)。對(duì)照組的椎體間隙維持原有的軟組織構(gòu)造。X光及組織學(xué)檢查無(wú)變化。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)制缺陷型的病毒，其特征在于，該病毒編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白，并且所述的病毒選自腺病毒、腺伴隨病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白選自BMP-2、BMP-4、BMP-7。
3.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白是BMP-2。
4.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，所述的病毒是重組腺病毒5型Adv-BMP2，CCTCC保藏號(hào)為V200004。
5.一種轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)細(xì)胞，其特征在于，它表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的間充質(zhì)細(xì)胞，其特征在于，它是被權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的病毒轉(zhuǎn)化的。
7.一種用于植入哺乳動(dòng)物體內(nèi)以刺激骨頭生長(zhǎng)的接種物，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述間充質(zhì)細(xì)胞。
8.一種體外產(chǎn)生骨或骨組織前體的方法，其特征在于，它包括步驟在適合細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的間充質(zhì)細(xì)胞，使其在體外分化成骨組織前體或骨母細(xì)胞。
9.一種在體內(nèi)刺激骨生成的方法，其特征在于，它包括步驟將權(quán)利要求7所述的接種物植入需要骨生成的部位。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于刺激骨生成的新方法和材料。具體地,公開(kāi)了一種復(fù)制缺陷型的病毒,該病毒編碼的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的蛋白,并且所述的病毒選自:腺病毒、腺伴隨病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。還公開(kāi)了用所述病毒轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)細(xì)胞,含該間充質(zhì)細(xì)胞的接種物,以及在體內(nèi)和體外刺激骨生成的方法。本發(fā)明可有效、方便和/或價(jià)廉地刺激骨生成。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1353185SQ0012711
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月2日
發(fā)明者樓覺(jué)人 申請(qǐng)人:上海兆安醫(yī)學(xué)科技有限公司