專利名稱：編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的核苷酸序列及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的核苷酸序列，該序列的鑒別和分離方法，和用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)支鏈氨基酸的方法，其中該棒狀細(xì)菌中編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的基因是擴(kuò)增的。
支鏈氨基酸L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸用于制藥工業(yè)及人用藥物和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。
已知支鏈氨基酸可通過(guò)棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過(guò)離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物如異亮氨酸類似物異亮氨酸hydroxyamate(Kisumi M,Komatsubara S,Sugiura,M,Chibata I(1972)細(xì)菌學(xué)雜志110:761-763)，纈氨酸類似物2-噻唑丙氨酸(TsuchidaT,Yoshinanga F,Kubota K,Momose H(1975)日本農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)39:1319-1322)或亮氨酸類似物α-氨基丁酸酯(Ambe-Ono Y,Sato K,Totsuka K,Yoshihara Y,Nakamori S(1996)生物科學(xué)生物工程生物化學(xué)60:1386-1387)有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生支鏈氨基酸的菌株(Tsuchida T,Yoshinanga F,Kubota K,Momose H(1975)日本農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)；Nakayama K,Kitada S,Kinoshita S(1961)日本普通及應(yīng)用微生物學(xué)雜志7:52-69；Nakayama K,Kitada S,Sato Z,Kinoshita(1961)日本普通及應(yīng)用微生物學(xué)雜志7:41-51)。
一段時(shí)間以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒桿菌生產(chǎn)支鏈氨基酸的菌株的改良，其通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)支鏈氨基酸生物合成基因，并研究對(duì)支鏈氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。此方面的綜述文章見Kinoshita(″谷氨酸細(xì)菌″，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，Benjamin Cummings，英國(guó)倫敦，1985,115-142),Hilliger(生物技術(shù)2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技術(shù)的關(guān)鍵回顧15,73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)782,25-39(1996))。
本發(fā)明人目的在于為改良支鏈氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)而提供新措施。
支鏈氨基酸用于制藥工業(yè)及人用藥物和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，因此提供生產(chǎn)支鏈氨基酸的新改良方法總是令人感興趣的。
當(dāng)下文提及支鏈氨基酸時(shí)，是指L-異亮氨酸，L-纈氨酸或L-亮氨酸。
本發(fā)明提供了含有選自如下一組的至少一個(gè)多核苷酸序列的分離的多核苷酸a)與編碼含有SEQ ID NO:3或5至少一個(gè)氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包括與SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制并源自棒桿菌的優(yōu)選為重組的DNA，其至少含有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的編碼brnF和/或brnE的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了如權(quán)利要求1的能復(fù)制的DNA，其含有(ⅰ)編碼brnF和/或brnE的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了權(quán)利要求2的多核苷酸，其含有選自SEQ ID NO:1,2,4或6的至少一個(gè)核苷酸序列，權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列的至少一個(gè)多肽，含有權(quán)利要求1的多核苷酸或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的DNA序列的載體，以及作為宿主細(xì)胞的含有所述載體的棒狀細(xì)菌。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上由一個(gè)多核苷酸序列組成，其可通過(guò)用含有SEQ ID NO:1,2,4或6所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫(kù)，并分離所述的DNA序列來(lái)篩選獲得，所述的文庫(kù)包括具有SEQ ID NO:1,2,4或6的多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸輸出蛋白的全長(zhǎng)cDNA，以及分離與brnF和/或brnE基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸輸出蛋白的基因DNA的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少30個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)堿基。具有至少40或50個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來(lái)。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO:3和/或5的多肽，特別是具有運(yùn)輸支鏈氨基酸生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ ID NO:3和/或5的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO:3和/或5的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明還提供了用所述能復(fù)制的DNA轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其是棒桿菌屬。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)支鏈氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)支鏈氨基酸的方法，在該棒狀細(xì)菌中編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的基因brnE和/或brnF的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過(guò)表達(dá)的。
文中術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性的提高，例如通過(guò)提高基因的拷貝數(shù)，或用強(qiáng)啟動(dòng)子或編碼高活性相應(yīng)酶(蛋白質(zhì))的基因，及如果需要組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)支鏈氨基酸，此微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)支鏈氨基酸的突變體或菌株，如生產(chǎn)異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871如生產(chǎn)亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21885黃色短桿菌ATCC21889或如生產(chǎn)纈氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌DSM12455谷氨酸棒桿菌FERM-P9325乳發(fā)酵短桿菌FERM-P9324乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1763本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的新基因brnE和brnF。這些基因是通過(guò)首先產(chǎn)生brnF或brnE缺陷的谷氨酸棒桿菌突變體而分離的。為此，將合適的起始菌株，如ATCC14752或ATCC13032進(jìn)行誘變過(guò)程。經(jīng)典的誘變過(guò)程是用化學(xué)物質(zhì)如N-甲基-N-硝基-N-硝基胍或紫外輻射進(jìn)行處理。這種起始突變的方法是已知的并參見Miller(細(xì)菌遺傳學(xué)簡(jiǎn)要教程，大腸桿菌及相關(guān)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1992))，或美國(guó)細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)的手冊(cè)“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”(美國(guó)華盛頓特區(qū)，1981)。
另一種誘變方法是轉(zhuǎn)座子誘變方法，其是利用轉(zhuǎn)座子“跳”入DNA序列的特征，從而破壞或抑制所涉及的基因的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知棒狀細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子。紅霉素抗性轉(zhuǎn)座子Tn5432(Tauch等，質(zhì)粒(1995)33:168-179)和氯霉素抗性轉(zhuǎn)座子Tn5546已相應(yīng)地從干燥棒桿菌菌株M82B中分離。Tauch等(質(zhì)粒(1995)34:119-131和質(zhì)粒(1998)40:126-139)證實(shí)用這些轉(zhuǎn)座子可進(jìn)行誘變。
另一種轉(zhuǎn)座子是Ankri等(細(xì)菌學(xué)雜志(1996)178:4412-4419)所述的轉(zhuǎn)座子Tn5531，其在本發(fā)明中作為例子應(yīng)用。轉(zhuǎn)座子Tn5531含有aph3卡那霉素抗性基因并可以質(zhì)粒載體pCGL0040的形式應(yīng)用，所述質(zhì)粒如


圖1所示。轉(zhuǎn)座子Tn5531的核苷酸序列可從國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)以登錄號(hào)U53587免費(fèi)獲得。
進(jìn)行誘變優(yōu)選轉(zhuǎn)座子誘變后，搜索brnF或brnE缺陷的突變體。brnF或brnE缺陷的突變體的識(shí)別是基于其在極限培養(yǎng)基瓊脂上生長(zhǎng)良好，但在補(bǔ)加含有支鏈氨基酸的寡肽如異亮氨酸-異亮氨酸二肽的極限培養(yǎng)基瓊脂上生長(zhǎng)較差。
這種突變體的一個(gè)例子是菌株ATCC14752brnE::Tn5531。
如此產(chǎn)生的菌株可用于克隆和測(cè)序brnF和/或brnE基因。
為此，可建立所涉及的細(xì)菌的基因文庫(kù)?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊(cè)建立基因文庫(kù)。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chamie,Weinheim，德國(guó)，1990)，或由Sambrook等所著手冊(cè)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)。一非常熟知的基因文庫(kù)是已由Kohara等(細(xì)胞50,495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫(kù)。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252:255-265,1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987,Proceeding of theNational Academy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫(kù)。適用于本發(fā)明的載體是在棒狀細(xì)菌優(yōu)選谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的載體，這種載體是現(xiàn)有技術(shù)已知的，一個(gè)例子是質(zhì)粒pZ1，其由Menkel等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64:549-554)所述。如此獲得的基因文庫(kù)然后經(jīng)轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)移進(jìn)brnF或brnE缺陷的指示菌株，并選擇能在存在含支鏈氨基酸的寡肽的極限培養(yǎng)基瓊脂上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。
當(dāng)使用由棒狀細(xì)菌的Tn5531誘變產(chǎn)生的突變體如菌株ATCC14752brnE::Tn5531時(shí)，通過(guò)其所含的卡那霉素抗性基因aph3可直接克隆和分離brnE::Tn5531等位基因。已知的克隆載體如pUC18(Norrander等，基因(1983)26:101-106和Yanisch-Perron等，基因(1985)33:103-119)可用于此目的。合適的克隆宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)7(1990)4645-4649)所述。在卡那霉素存在下選擇轉(zhuǎn)化子。然后對(duì)所得轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)74:5463-5467,1977)可用于此目的。使用這一方法，可獲得位于Tn5531插入位點(diǎn)上游和下游的基因。然后用商購(gòu)序列分析軟件如Lasergene軟件包(用于Windows的Biocomputing軟件，DNASTAR,Madison,USA)或HUSAR軟件包(釋放版本4.0，EMBL,Heidelberg，德國(guó))分析和裝配獲得的核苷酸序列。
這是用于獲得谷氨酸棒桿菌的編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的新DNA序列的方法，并在本發(fā)明中示作SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4顯示了基因brnF和brnE的編碼區(qū)。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5示出了從SEQ ID NO:1或從SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4獲得的基因產(chǎn)物的氨基酸序列。
通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性產(chǎn)生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，保守氨基酸置換，如用丙氨酸置換甘氨酸，或用谷氨酸置換天冬氨酸，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)活性的任何基本改變，即是中性有功能的。另外已知蛋白質(zhì)N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)此的論述，參見Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989)),Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技術(shù)6:1321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
用SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以合成合適的引物，用這些引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可擴(kuò)增各種棒狀細(xì)菌和菌株的brnF和brnE基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在Gait的手冊(cè)寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國(guó)牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德國(guó)，1994)中找到指導(dǎo)?；蛘?，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其部分可用作探針在基因文庫(kù)特別是棒狀細(xì)菌的基因文庫(kù)中搜索brnF和/或brnE基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員在寶靈格曼海姆有限公司的手冊(cè)“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國(guó)，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國(guó)際雜志(1991)41:255-260)中找到指導(dǎo)。然后克隆和測(cè)序以此方式擴(kuò)增的含有brnE和brnF基因的DNA片段。
以此方式獲得了如SEQ ID NO:6所示的菌株ATCC13032的brnE和brnF基因的DNA序列，并是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在brnF和/或brnE輸出蛋白基因過(guò)表達(dá)后，棒狀細(xì)菌以改良方式生產(chǎn)支鏈氨基酸。
為獲得過(guò)表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式工作。通過(guò)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在支鏈氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。通過(guò)目的在于延長(zhǎng)mRNA壽命的措施，也可改良表達(dá)。通過(guò)防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增。或者，通過(guò)改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對(duì)此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，歐洲專利EP-B0472869，美國(guó)專利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9,84-87(1991)),Reinscheid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60,126-132(1994)),LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175,1001-1007(1993))，專利申請(qǐng)WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物學(xué)綜述60:512-538(1996))及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，本發(fā)明的基因brnF和brnE可借助于質(zhì)粒過(guò)表達(dá)。合適的質(zhì)粒是在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。許多已知的質(zhì)粒載體，例如pZ1(Menkel等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)(1989)64:549-554),pEKEx1(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519,pBL1或pGA1。其他質(zhì)粒載體如pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)可如此應(yīng)用。
另外，除了新brnF和brnE基因之外，編碼支鏈氨基酸的已知生物合成途徑的其他酶或回補(bǔ)代謝的酶或檸檬酸循環(huán)的酶的一或多種基因的過(guò)表達(dá)，對(duì)支鏈氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，例如為生產(chǎn)L-異亮氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學(xué)2,63-72(1988))或編碼“抗反饋”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等，基因107,53-59(1991))可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼蘇氨酸脫水酶的ilv基因(Mockel等，細(xì)菌學(xué)雜志(1992)8065-8072)或編碼“抗反饋”蘇氨酸脫水酶的ilvA(Fbr)等位基因(Mockel等，(1994)分子微生物學(xué)13:833-842)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼乙酰羥酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)細(xì)菌學(xué)雜志175:5595-5603)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)65:1973-1979)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生化雜志254,395-403(1998))可以同時(shí)過(guò)表達(dá)。
因此，例如為生產(chǎn)L-亮氨酸，·編碼異丙基蘋果酸酯合酶的leuA基因(Patek等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60(1994)133-140)或編碼“抗反饋”異丙基蘋果酸酯合酶的等位基因可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼異丙基蘋果酸酯脫水酶的leuC和leuD基因(Patek等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60(1994)133-140)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼異丙基蘋果酸酯脫氫酶的leuB基因(Patek等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60(1994)133-140)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼乙酰羥酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)細(xì)菌學(xué)雜志175:5595-5603)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)65:1973-1979)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生化雜志254,395-403(1998))可以同時(shí)過(guò)表達(dá)。
因此，例如為生產(chǎn)L-纈氨酸，·編碼乙酰羥酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)細(xì)菌學(xué)雜志175:5595-5603)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)65:1973-1979)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生化雜志254,395-403(1998))可以同時(shí)過(guò)表達(dá)。
除brnE和/或brnF基因的過(guò)表達(dá)之外，排除非所需的二級(jí)反應(yīng)對(duì)支鏈氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過(guò)量產(chǎn)生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國(guó)，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或在分批方法，或在補(bǔ)料分批方法或重復(fù)補(bǔ)料分批法中分批培養(yǎng)以生產(chǎn)支鏈氨基酸。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechnik l.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求，關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)”(華盛頓D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至支鏈氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍達(dá)到。
支鏈氨基酸的分析可通過(guò)陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等(分析化學(xué)，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用進(jìn)行，或經(jīng)反相HPLC進(jìn)行，如Lindroth等(分析化學(xué)(1979)51:1167-1174)。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國(guó))·大腸桿菌菌株GM2929pCGL0040，保藏號(hào)DSM12839。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳述闡述。
根據(jù)Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)進(jìn)行從大腸桿菌分離質(zhì)粒DNA，限制消化，Klenow和堿性磷酸酶處理。除非另有說(shuō)明，根據(jù)Chung等(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1989)86:2172-2175)進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1谷氨酸棒桿菌ATCC14752的brnF和brnE基因的克隆和測(cè)序1、轉(zhuǎn)座子誘變用轉(zhuǎn)座子Tn5531誘變谷氨酸棒桿菌菌株ATCC14752，該轉(zhuǎn)座子的序列見國(guó)立生物技術(shù)信息中心(Bethesda,USA)的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為U53587。含有裝配的轉(zhuǎn)座子Tn5531的質(zhì)粒pCGL0040(Ankri等，細(xì)菌學(xué)雜志(1996)178:4412-4419)是從甲基化酶缺陷的大腸桿菌菌株GM2929pCGL0040(E.coli GM2929:Palmer等，基因(1994)143:1-12)中分離的。經(jīng)電穿孔法(Haynes等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)61:329-334)用質(zhì)粒pCGL0040轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌菌株ATCC14752。通過(guò)在含有15微克/毫升卡那霉素的LBHIS瓊脂板(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)65:299-304)上的卡那霉素抗性鑒別轉(zhuǎn)座子Tn5531已整合進(jìn)基因組的克隆。以此方式獲得2000個(gè)克隆，測(cè)試它們?cè)诋惲涟彼?異亮氨酸存在下的延遲生長(zhǎng)。為此，將所有克隆單獨(dú)轉(zhuǎn)移至具有或不具有3mM異亮氨酸-異亮氨酸的CGXⅡ極限培養(yǎng)基瓊脂板上。該培養(yǎng)基與Keilhauer等(細(xì)菌學(xué)雜志(1993)175:5593-5603)所述的CGXⅡ培養(yǎng)基相同，但另外含有25微克/毫升卡那霉素和15克/升瓊脂。Keilhauer等所述的該培養(yǎng)基的組成見表1。
表1培養(yǎng)基CGXⅡ的組成
瓊脂板在30℃保溫，并在12、18和24小時(shí)后檢查生長(zhǎng)。獲得一轉(zhuǎn)座子突變體，其在缺少異亮氨酸-異亮氨酸時(shí)以與起始菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14752相當(dāng)?shù)姆绞缴L(zhǎng)，但在存在3mM異亮氨酸-異亮氨酸時(shí)生長(zhǎng)延遲。該突變體命名為ATCC14752brnF::Tn5531。2、ATCC14752brnF::Tn5531中Tn5531插入位點(diǎn)的克隆和測(cè)序?yàn)榭寺?shí)施例1.1中所述的突變體的轉(zhuǎn)座子Tn5531下游的插入位點(diǎn)，首先如Schwarzer等(生物/技術(shù)(1990)9:84-87)所述分離這一突變體菌株的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ切割400ng染色體DNA。將完全限制的產(chǎn)物連接進(jìn)購(gòu)自Roche Diagnostics的同樣用EcoRⅠ線性化的載體pUC18(Norander等，基因(1983)26:101-106)。然后將連接混合物經(jīng)電穿孔(Dower等，核酸研究(1988)16:6127-6145)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant,1990，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87:4645-4649)。經(jīng)在含有50微克/毫升羧芐青霉素和25微克/毫升卡那霉素的LB瓊脂板上的羧芐青霉素和卡那霉素抗性鑒別其中轉(zhuǎn)座子Tn5531的插入位點(diǎn)以克隆形式存在于載體pUC18上的轉(zhuǎn)化子。從3個(gè)轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒并經(jīng)限制分析確定克隆的插入片段的大小。用Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1977)74:5463-5467)確定具有約7.2kb大小插入片段的一個(gè)質(zhì)粒上的插入位點(diǎn)的核苷酸序列。為此，以下列寡核苷酸引物出發(fā)測(cè)序1.3kb插入片段5′-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3＇。
為鑒別轉(zhuǎn)座子上游的插入位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶PstⅠ切割突變體的染色體DNA并連接進(jìn)已用PstⅠ線性化的載體pUC18中。其余的克隆操作如上所述。用Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1977)74:5463-5467)確定具有約4.8kb大小插入片段的一個(gè)質(zhì)粒上的插入位點(diǎn)的核苷酸序列。為此，以下列寡核苷酸引物出發(fā)測(cè)序1.6kb插入片段5′-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3＇。
用Lasergene軟件包(用于Windows的Biocomputing軟件，DNASTAR,Madison,USA)分析和組裝獲得的核苷酸序列。這一核苷酸序列再現(xiàn)為SEQ ID NO:1。分析鑒別了長(zhǎng)度為753bp和324bp的兩個(gè)開放讀框，其示作SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。相應(yīng)的基因命名為brnF和brnE。相關(guān)的基因產(chǎn)物包括251和108個(gè)氨基酸并再現(xiàn)為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。
實(shí)施例2從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中克隆和測(cè)序brnF和brnE基因?qū)?lái)自菌株ATCC13032的基因brnF和brnE克隆進(jìn)大腸桿菌克隆載體pUC18(Norander等，基因(1983)26:101-106,Roche Diagnostic，曼海姆，德國(guó))中?？寺∫詢刹竭M(jìn)行，首先用衍生自SEQ ID NO:1的下述寡核苷酸引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因。
brnE,brnF，-正向
5′-[AGC GCT GTC TGC TTA AGC CTT TTC]-3′brnE,brnf，-反向5′-[GCG CGA TCA ATG GAA TCT AGC TTC]-3′PCR反應(yīng)在200μM脫氧核甘酸三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，1μM相應(yīng)寡核苷酸，100ng谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，1/10體積的10×反應(yīng)緩沖液和2.6單位的熱穩(wěn)定Taq/PwoDNA聚合酶混合物(來(lái)自Roche Diagnostics的擴(kuò)充高可靠性PCR系統(tǒng)，曼海姆，德國(guó))存在下在一熱循環(huán)儀(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,USA)中在如下條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃30秒，58℃30秒和72℃2分鐘。
然后用SureClone連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)根據(jù)廠商指導(dǎo)將約1.3kb大小的擴(kuò)增片段連接進(jìn)載體pUC18的SmaⅠ限制位點(diǎn)中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant,1990，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87:4645-4649)。經(jīng)在含有50微克/毫升羧芐青霉素的LB瓊脂板上的羧芐青霉素抗性鑒別轉(zhuǎn)化子。從8個(gè)轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒并經(jīng)限制分析確定1.3kb PCR片段的插入片段的存在。以后將得到的重組質(zhì)粒命名為pUC18brnEF。
用Sanger等的雙脫氧鏈終止法(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1977)74:5463-5467)質(zhì)粒pUC18brnEF中的1.3kb PCR片段的核苷酸序列。為此，用購(gòu)自Roche Diagnostics(曼海姆，德國(guó))的下述引物測(cè)序pUC18brnEF的完整插入片段。
通用引物5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′反向引物5′-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3′所得核苷酸序列再現(xiàn)為SEQ ID NO:6。用Lasergene軟件包(用于Windows的Biocomputing軟件，DNASTAR,Madison,USA)分析所獲得的核苷酸序列。
實(shí)施例3谷氨酸棒桿菌ATCC13032的brnEF基因的表達(dá)將brnEF基因克隆進(jìn)大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220:478-480)中?？寺∫詢刹襟E進(jìn)行。首先用衍生自SEQ ID NO:6的下述寡核苷酸引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因。brnEF-正向5′-GCT CTA GAA CCT TGT CAG CCA GTG CG-3′brnEF-反向5′-GCT CTA GAA AAA ATC CGC ATC CCC TCA-3′這些寡核苷酸引物另外還含有位于5’一側(cè)的XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。PCR反應(yīng)在200μM脫氧核苷酸三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，1μM相應(yīng)寡核苷酸，100ng谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，1/10體積的10×反應(yīng)緩沖液和2.6單位的熱穩(wěn)定Taq/Pwo DNA聚合酶混合物(來(lái)自Roche Diagnostics的擴(kuò)充高可靠性PCR系統(tǒng)，曼海姆，德國(guó))存在下在一熱循環(huán)儀(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,USA)中在如下條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃30秒，58℃30秒和72℃2分鐘。然后約1.3kb大小的擴(kuò)增片段用限制酶XbaⅠ根據(jù)廠商Roche Diagnostics(曼海姆，德國(guó))的指導(dǎo)處理并用RapidLigation試劑盒(Roche Diagnostics)連接進(jìn)載體pJC1的XbaⅠ限制位點(diǎn)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant,1990,美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87:4645-4649)。經(jīng)在含有50微克/毫升卡那霉素的LB瓊脂板上的卡那霉素抗性鑒別轉(zhuǎn)化子。從8個(gè)轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒并經(jīng)限制分析確定1.3kb PCR片段的插入片段的存在。以后將得到的重組質(zhì)粒命名為pJC1brnEF。經(jīng)電穿孔(Haynes等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)61:329-334)將質(zhì)粒pJC1和pJC1brnEF導(dǎo)入形成異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株DM368-2中。菌株DSM368-2的描述見EP-B-0 385 940并已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心，保藏號(hào)DSM5399。通過(guò)在含有15微克/毫升卡那霉素的LBHIS瓊脂平板上的卡那霉素抗性(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)65:299-304)鑒別轉(zhuǎn)化子。以此方式獲得谷氨酸棒桿菌菌株DM368-2/pJC1和DM368-2/pJC1brnEF。
實(shí)施例4用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸通過(guò)在50毫升含有50微克/ml卡那霉素的腦心浸液培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,USA)中于30℃預(yù)培養(yǎng)菌株DM368-2/pJC1和DM368-2/pJC1brnEF 14小時(shí)而研究其產(chǎn)生異亮氨酸的情況。然后細(xì)胞用0.9％(w/v)氯化鈉溶液洗2次，并用此懸液接種60毫升CgⅫ培養(yǎng)基使OD600(在600nm處的光密度)為0.1。該培養(yǎng)基與Keilhauer等(細(xì)菌學(xué)雜志(1993)175:5593-5603)所述培養(yǎng)基相同，但額外含有50微克/毫升卡那霉素。兩個(gè)菌株均在30℃和130rpm下培養(yǎng)。24和48小時(shí)后取樣品，短暫離心細(xì)胞(用購(gòu)自Heraeus(Osterode，德國(guó))的Biofuge pico在13000rpm離心5分鐘)。
用反相HPLC(Lindroth等，分析化學(xué)(1979)51:1167-1174)定量測(cè)定培養(yǎng)物上清中的胞外氨基酸濃度。使用附有熒光檢測(cè)儀(G1321A)的HP1100系列HPLC層析(惠普，Waldbronn，德國(guó))；用HP-Chem-Station(惠普)控制該系統(tǒng)并進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)。在自動(dòng)化柱前衍化中，1微升待分析的氨基酸溶液與20微升制備好的正苯二醛/2-巰基乙醇試劑(Pierce Europe BV,Oud-Beijerland，荷蘭)混合。使用具有升高的非極性相(甲醇)的梯度程序經(jīng)組合前置柱(40×4mm Hypersil ODS5)和主柱(Hypersil ODS5，兩個(gè)柱均購(gòu)自CS-Chromatographie Service GmbH,Langerwehe，德國(guó))而分離得到的熒光物質(zhì)硫取代的異吲哚(Jones等，層析學(xué)雜志(1983)266:471-482)。極性洗脫劑是乙酸鈉(0.1M,pH7.2)；流速是0.8毫升/分鐘。在激發(fā)波長(zhǎng)230nm和發(fā)射波長(zhǎng)450nm對(duì)衍化的氨基酸進(jìn)行熒光檢測(cè)。經(jīng)與外標(biāo)和作為額外內(nèi)標(biāo)的天冬酰胺比較而計(jì)算氨基酸濃度。
所得結(jié)果示于表2。
表2
本發(fā)明包括如下附圖
圖1含有轉(zhuǎn)座子Tn5531的質(zhì)粒pCGL0040圖。轉(zhuǎn)座子以未涂黑的箭頭示出。
圖中所示長(zhǎng)度應(yīng)被認(rèn)為是大約值。所采用的縮寫和術(shù)語(yǔ)有如下含義EcoRⅠ來(lái)自大腸桿菌的限制酶XbaⅠ來(lái)自Xanthomonas badrii的限制酶ClaⅠ來(lái)自Caryophanum latum的限制酶SalⅠ來(lái)自Streptomyces albus的限制酶ScaⅠ來(lái)自Streptomyces caespitosus的限制酶SmaⅠ來(lái)自Serratia marcescens的限制酶Amp氨芐青霉素抗性基因Kan卡那霉素抗性基因oriBR322質(zhì)粒pBR322的復(fù)制源點(diǎn)序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>編碼支鏈氨基酸的輸出蛋白的核苷酸序列及其分離方法和應(yīng)用<130>990128 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1271<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌ATCC14752<220><221>基因<222>(101)..(853)<223>brnF<220><221>基因<222>(853)..(1176)<223>brnE<400>1gcgcgatcaa tggaatctag cttcatatat tgcacaatag cctagttgag gtgcgcaaac 60tggcaacaaa actacccggc aattgtgtga tgattgtagt gtgcaaaaaa cgcaagagat 120tcattcaagc ctggaggtgt cgccatccaa ggcagccctg gaaccagatg ataaaggtta 180tcggcgctac gaaatcgcgc aaggtctaaa aacctccctt gctgcaggtt tgggcatgta 240cccgattggt attgcgtttg gtctcttggt tattcaatac ggctacgaat ggtgggcagc 300cccactgttt tccggcctga ttttcgcggg ctccaccgaa atgctggtca tcgccctcgt 360tgtgggcgca gcgcccctgg gcgccatcgc 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1.分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的至少一個(gè)多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:3或5至少一個(gè)氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選為重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的能復(fù)制的DNA，含有(ⅰ)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的一個(gè)核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于的(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
5.衍生自權(quán)利要求1或2的核苷酸序列的蛋白質(zhì)氨基酸序列，示于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4
6.通過(guò)導(dǎo)入權(quán)利要求2或5的一或多個(gè)能復(fù)制的DNA而轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬。
7.經(jīng)棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)支鏈L-氨基酸的方法，其中使用如下細(xì)菌，該細(xì)菌中brnE和/或brnF基因或編碼這些基因的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過(guò)表達(dá)的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中使用如下細(xì)菌，該細(xì)菌中所需氨基酸生物合成途徑的其它基因是額外擴(kuò)增的。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所用的細(xì)菌中，降低所需L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。
10.權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的方法，其中使用經(jīng)一或多個(gè)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且所述質(zhì)粒載體攜帶編碼brnE和/或brnF基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的方法，其中使用產(chǎn)生L-異亮氨酸、L-纈氨酸或L-亮氨酸的棒狀細(xì)菌。
12.生產(chǎn)支鏈L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟(a)將前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的微生物發(fā)酵，該微生物中至少brnE和/或brnF是擴(kuò)增的特別羧基過(guò)表達(dá)的，其任選地與其它基因一起擴(kuò)增特別是過(guò)表達(dá)，(b)富集培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中的所需L-氨基酸，及(c)分離L-氨基酸。
13.前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中使用棒桿菌屬微生物。
14.分離brnE或brnF基因的方法，其特征在于獲得在含異亮氨酸和/或亮氨酸和/或纈氨酸的寡肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)的這一/這些基因缺陷的突變體，優(yōu)選棒狀細(xì)菌，作為指示菌株，及a)在建立基因文庫(kù)后鑒別并分離brnE或brnF基因，或b)在轉(zhuǎn)座子誘變情況中，選擇優(yōu)選含有抗生素抗性的轉(zhuǎn)座子，從而獲得所需基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其含有選自如下一組的至少一個(gè)多核苷酸序列:a)與編碼含有SEQ ID NO:3或5至少一個(gè)氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含有與SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸,其中所述多肽顯示出brnE或brnF基因編碼的酶的生物學(xué)活性。本發(fā)明還涉及經(jīng)擴(kuò)增所述基因而發(fā)酵生產(chǎn)支鏈L－氨基酸的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1302873SQ0012989
公開日2001年7月11日 申請(qǐng)日期2000年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月27日
發(fā)明者妮科爾·肯納克內(nèi)希特, 赫爾曼·扎姆, 洛塔爾·埃格林, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司, 于利希研究中心有限公司