專利名稱：酶法生產(chǎn)右旋糖酐的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多糖類及其衍生物的其他多糖類及生產(chǎn)方法，尤其涉及一種葡聚糖及其衍生物及生產(chǎn)方法。
右旋糖酐(又稱葡聚糖)是一種無毒無害的生物高分子物質(zhì)。由于它具有特殊的生理功能和化學活性，因此，又能衍生出一系列重要新型產(chǎn)品。正因如此，它已被廣泛地應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及科學研究等各個領域。成為當今人類生活中重要的生物技術門類之一。
幾十年來右旋糖酐的生產(chǎn)，不論國內(nèi)，國外，基本上還是承襲傳統(tǒng)的細菌發(fā)酵過程。這一過程在本質(zhì)上說來是不可控制的。因為在這一過程中，從細菌生長，到產(chǎn)酶(右旋糖酐蔗糖酶)，以及從酶合成右旋糖酐都在同一生物反應器中進行，而每一步所需的最適條件是極不相同的。由此而造成的產(chǎn)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定性是無法克服的。
正因如此，科學家們一直致力于酶法合成右旋糖酐的研究。但這是一項費時費力的工程，尤其更應用于工業(yè)化生產(chǎn)談何容易。
本發(fā)明的目的在于研制一種簡便、快速、高效生產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶的先進方法，并建立酶法合成右旋糖酐的工業(yè)生產(chǎn)程序，以取代傳統(tǒng)的不可控制的細菌發(fā)酵過程。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1、右旋糖酐蔗糖酶的新的生產(chǎn)方法A、產(chǎn)酶細菌的選育將處于生長旺盛期的細菌(腸膜狀明串球菌)離心、沉淀、洗滌之后，用硝酸胍溶液(濃度為100微克/毫升)處理90分鐘，然后離心沉淀，除去上清液，再用生理鹽水洗滌三次。將這些處理過的細菌接種于斜面培養(yǎng)基上。經(jīng)過反復篩選。從中挑出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。
B、細菌生長與繁殖將上述斜面培養(yǎng)基上的優(yōu)質(zhì)細菌接種于500毫升液體培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基的組成如下蔗糖2.0％酵母膏0.5％磷酸氫二鉀0.5％黃豆抽提物0.3％
無機鹽液0.5％加蒸餾水至100％PH7.3-7.6所述無機鹽液成分為每100毫升中含硫酸鎂4克，硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.2克。液體培養(yǎng)基在接種之前必須高壓消毒，接種后置于25℃恒溫水溶中培養(yǎng)8至12小時，即可以10倍比例繼續(xù)接種于新的培養(yǎng)基中，并逐級放大。
C、右旋糖酐蔗糖的生產(chǎn)首先是制備一種適合于細菌產(chǎn)酶的特殊培養(yǎng)基，其組成如下蔗糖3.0％酵母膏1.0％黃豆抽提物0.3％磷酸氫二鉀1.5％無機鹽液1.0％加蒸餾水至100％PH7.3-7.8所述無機鹽液組成為每100毫升中，硫酸鎂2克，氯化鈣0.5克，其他硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.1克。
上述培養(yǎng)基混勻后高壓消毒、冷卻至23-25℃?zhèn)溆谩?br> 生產(chǎn)時，在無菌條件下，按培養(yǎng)基體積10％比例，將上述生長旺盛期的菌液接種其中，維持溫度在23-25℃左右，并間隙攪動，約24小時，測定PH及酶活性。當PH下降至4.5-5.0酶活性達高峰時，即可停止反應，放料離心。離心速度一般為3000-5000轉/分，時間約15分鐘。離心后將沉淀棄去，上清液收集于潔凈無菌的容器中，加蓋后，存放于4℃冷室備用，并測定酶活性。在4℃環(huán)境中，酶活性一般可穩(wěn)定達3個月之久。
2、右旋糖酐的酶法合成途徑取上述方法生產(chǎn)的酶液，按每毫升10單位計算，加于蔗糖緩沖液中。例如蔗糖緩沖液容積為1000毫升，則需加入10×1000＝10,000單位的酶液。又假設酶活性為100單位/毫升，則實際上應加入酶液100毫升。
蔗糖緩沖液的制備如下蔗糖15％含鈣離子醋酸鹽溶液10％加蒸餾水至100％并用30％醋酸調(diào)節(jié)PH至5.2-5.3。
含鈣離子醋酸鹽緩沖液的組成為每1000毫升中含醋酸鈉6.8克，氯化鈣0.5克。
當酶液加于蔗糖緩沖液之后，立即攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH在5.2-5.3之間，維持溫度在24-26℃并間斷攪拌。待粘度達到峰值時(一般在18-24小時)，即可用等體積95％酒精沉淀。沉淀物即為右旋糖酐(又稱粗酐)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比具有的優(yōu)點(1)技術先進酶法合成，使右旋糖酐生產(chǎn)由傳統(tǒng)的非控制系統(tǒng)一躍而成為全新的可控制過程。改變了幾十年來的落后狀態(tài)，邁向世界領域的前沿。
(2)增加產(chǎn)量實踐證明，這一技術，按糖加酶，定量供應，而且在最后的生物反應器中，成分簡單，沒有干擾，因而確保高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。和傳統(tǒng)發(fā)酵相比較平均產(chǎn)量約增加20％。
(3)生產(chǎn)成本降低由于這一技術可使右旋糖酐蔗糖酶的產(chǎn)量增加一倍以上，加上生產(chǎn)右旋糖酐的蔗糖緩沖液中不必加入其他營養(yǎng)物質(zhì)，這就大大地降低生產(chǎn)成本。
(4)提高產(chǎn)品質(zhì)量由于這一新技術，把細菌予以分離，因此產(chǎn)品的質(zhì)量比傳統(tǒng)發(fā)酵法顯著改善。
實現(xiàn)發(fā)明的最好形式實施例1實驗室規(guī)模的生產(chǎn)將斜面培養(yǎng)基細菌接種到500毫升的滅菌液體培養(yǎng)基中。其組成為蔗糖10克、酵母膏2.5克、磷酸氫二鉀2.5克，黃豆抽提物1.5克、無機鹽液2.5毫升、加蒸餾水使溶，再將體積加至500毫升，PH7.2-7.7(無機鹽的組成為100毫升中含硫酸鎂4克、硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.2克)。
將接種后的液體培養(yǎng)基置于23-25℃的恒溫水溶中培養(yǎng)約8-10小時，待細菌生長旺盛(PH在4.8至5.2)時，即可轉移到產(chǎn)酶的營養(yǎng)基中。其過程如下先配制營養(yǎng)培養(yǎng)基，方法是稱取蔗糖15克，酵母膏5克，黃豆抽提物1.5克，磷酸氫二鉀7.5克，無機鹽液5毫升，加蒸餾水使溶，再加至500毫升體積，并高壓消毒，然后冷至23-25℃。(無機鹽組成為每100毫升中含硫酸鎂2克、氯化鈣0.5克，其他硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.1克)。
其次將50毫升上述液體培養(yǎng)基菌液轉移接種到500毫升的產(chǎn)酶營養(yǎng)培養(yǎng)基中，混勻后放置于23-25℃恒溫水溶中，約24小時，待PH降至4.5-5.0時，即可取出，離心(3000-5000轉/分)15分鐘，仔細吸取上清液，測定酶活性，放4℃冰箱備用。
上述制得的是右旋糖酐蔗糖酶(粗酶)，下面介紹如何利用這種酶，在實驗室中合成右旋糖酐。首先配制蔗糖緩沖液。方法是稱取蔗糖150克，加800毫升蒸餾水使溶，然后加入醋酸鈉0.68克，氯化鈣0.05克，用30％醋酸調(diào)節(jié)PH至5.2-5.3。然后加入10,000單位右旋糖酐蔗糖酶液，并加蒸餾水至總容積為1000毫升，再調(diào)節(jié)PH至5.2-5.3。維持溶液溫度在24-26℃，并間斷攪拌，24小時后，加入1000毫升95％濃度酒精沉淀，即可得到右旋糖酐。
實施例2小規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)方法與實施例1相同，只是細菌生長繁殖要進行二級放大，每級均以10倍增加，即由500毫升×2擴大到10升以至100升。但培養(yǎng)基的組成與實施例1完全一樣。產(chǎn)酶營養(yǎng)培養(yǎng)基擴大至1000升。由酶生產(chǎn)右旋糖酐容積雖擴大，但蔗糖緩沖液的組成及合成的條件均與實施例1同?，F(xiàn)將其生產(chǎn)流程圖示如下斜面培養(yǎng)基→500毫升液體培養(yǎng)基→10升種子罐→100升種子罐→1000升產(chǎn)酶罐→管式連續(xù)離心機→2萬升右旋糖酐合成。
權利要求
1.一種酶法生產(chǎn)右旋糖酐，其特征在于包括以下步驟1)右旋糖酐蔗糖酶的生產(chǎn)方法A、產(chǎn)酶細菌的選育將處于生長旺盛期的細菌腸膜狀明串球菌細菌離心沉淀、洗滌之后，用濃度為100微克/毫升的硝酸胍溶液處理90分鐘，然后離心沉淀，除去上清液，再用生理鹽水洗滌三次，將這些處理過的細菌接種于斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)過反復篩選，從中挑出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株；B、細菌生長與繁殖將上述斜面培養(yǎng)基上的優(yōu)質(zhì)細菌接種于500毫升液體培養(yǎng)基中，這種培養(yǎng)基的組成為蔗糖2.0％酵母膏0.5％磷酸氫二鉀0.5％黃豆抽提物0.3％無機鹽液0.5％加蒸餾水至100％PH7.3-7.6所述無機鹽液成分為100毫升中含硫酸鎂4克，硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.2克，液體培養(yǎng)基在接種之前必需高壓消毒，接種后置于恒溫25℃水浴中培養(yǎng)8至12小時，即可以10倍比例繼續(xù)接種在新的培養(yǎng)基中，并逐級放大；C、右旋糖酐蔗糖酶的生產(chǎn)首先是制備一種適合細菌產(chǎn)酶的特殊培養(yǎng)基，其組成如下蔗糖3.0％酵母膏1.0％黃豆抽提物0.3％磷酸氫二鉀1.5％無機鹽液1.0％，加蒸餾水至100％PH7.3-7.8所述無機鹽液組成為每100毫升中硫酸鎂2克，氯化鈣0.5克，其他硫酸亞鐵、硫酸錳和氯化鈉各0.1克，上述培養(yǎng)基混勻后高壓清毒，冷卻至23-25℃?zhèn)溆茫簧a(chǎn)時，在無菌條件下，按培養(yǎng)基體積10％比例，將上述生長旺盛期的菌液接種其中，維持溫度在23-25℃左右，并間隙攪動，約24小時，測定PH及酶活性，當PH下降至4.5-5.0酶活性達高峰時，即可停止反應，放料離心，離心速度一般為3000-5000轉/分，時間約15分鐘，離心后將沉淀棄去，上清液收集在潔凈無菌的容器中，加蓋后，存放在4℃冷室備用，并測定酶活性，在4℃環(huán)境中，酶活性一般可穩(wěn)定達3個月之久。2)右旋糖酐的酶法合成途徑取上述方法生產(chǎn)的酶液，按每毫升10個單位計算，加于蔗糖緩沖液中。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶法生產(chǎn)右旋糖酐，其特征在于所述的蔗糖緩沖液的制備如下蔗糖15％含鈣離子醋酸鹽溶液10％加蒸餾水至100％，并用30％醋酸調(diào)節(jié)PH5.2-5.3，所述含鈣離子醋酸鹽緩沖液的組成為每1000毫升中含醋酸鈉6.8克，氯化鈣0.5克，當酶液加在蔗糖緩沖液之后，立即攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH在5.2-5.3之間，維持溫度在24-26℃并間斷攪拌，待粘度達到峰值時即可用等體積95％酒精沉淀，沉淀物即為右旋糖酐。
全文摘要
酶法生產(chǎn)右旋糖酐,分兩大步。第一大步,首先生產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶又分三步:A、產(chǎn)酶細菌的培養(yǎng),B、細菌生長與繁殖,C、生產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶。第二大步為合成右旋糖酐酶,通過采用基因突變技術培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)細菌,研制一種特殊的培養(yǎng)基配方,使右旋糖酐蔗糖酶產(chǎn)量增加1倍以上,經(jīng)離心除去細菌后,將酶液定量加于蔗糖緩沖液pH5.2－5.3中于23－26℃溫度下,間隙攪拌18－24小時后酒精沉淀即得無菌右旋糖酐,本發(fā)明使不控的發(fā)酵過程改全新可控過程,不僅使投資和生產(chǎn)成本降低,質(zhì)量高且產(chǎn)量可增20%以上。
文檔編號C12P19/00GK1353193SQ00130268
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月2日 優(yōu)先權日2000年11月2日
發(fā)明者楊敏 申請人:楊敏