專利名稱：絲狀體藍藻高效表達盒和含有該表達盒的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絲狀體藍藻高效表達盒和含有該表達盒的載體。
近幾年來，以藍藻為宿主的基因工程發(fā)展迅速。藍藻又名藍細菌，是一類光合原核生物。藍藻的遺傳特性決定了藍藻基因工程的進展。藍藻的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的分子遺傳背景十分相似。而且藍藻中除染色體DNA外，還含有質(zhì)粒DNA，也能發(fā)生接合和轉(zhuǎn)化。這使它們易于進行分子操作，成為至今在藻類中唯一能成功地轉(zhuǎn)入和表達外源基因的類群。這些都使藍藻的分子生物學和基因工程近15年來得到了較快的發(fā)展，藍藻已經(jīng)成為基因工程的有效工具。
1981年Kuhlemeier等首次把抗生素基因?qū)胨{藻。1994年日本和我國學者同時把藥物基因轉(zhuǎn)入了藍藻。這以后，我們研究集體再把人腫瘤壞死因子-α、尿激酶原、人表皮生長因子、人小腸三葉因子等基因轉(zhuǎn)入到藍藻并成功地表達，主要用于制藥和處理環(huán)境。
雖然轉(zhuǎn)基因藍藻已有希望產(chǎn)業(yè)化制備藥物或處理環(huán)境，但存在一個極需解決的問題就是提高表達效率以加速產(chǎn)業(yè)化進程。迄今為止，國內(nèi)外所報導的藍藻表達外源基因的表達效率都不高。與大腸桿菌相比差1-2個數(shù)量級。
我們研究集體近幾年也對轉(zhuǎn)基因藍藻中外源基因的表達效率進行了探索。從1993年起，我們先后通過改變載體質(zhì)粒(穿梭表達載體和整合表達載體)、啟動子(PpsbA和金屬誘導型啟動子)、受體等因素，表達效率有所提高，但仍不理想。
由于藍藻是原核生物，其轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時進行。近幾年對適用于藍藻基因工程的啟動子研究較深入(如強啟動子和誘導型啟動子的應用)，但對翻譯水平的調(diào)控研究不多。外源基因的高效表達不僅和轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)，在很大程度上也與mRNA的翻譯起始頻率密切相關(guān)。在大腸桿菌中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。翻譯水平調(diào)控的研究主要涉及SD序列和起始密碼子、偏愛密碼子。人工合成引入適用于藍藻的SD序列(6～8個堿基左右)，是一條有效可行的途徑。
mRNA的翻譯起始頻率主要由其5’-末端的結(jié)構(gòu)序列決定，稱為核糖體結(jié)合位點(RBS)。RBS主要包括以下四個要素(1)位于mRNA上翻譯起始密碼上游的富含嘌呤結(jié)構(gòu)、可與核糖體16sRNA末端結(jié)合的SD序列(Schine-Delgarno)；(2)起始密碼子在E.coli和藍藻中，較常用的是AUG，也有少數(shù)使用GUG.；(3)SD與起始密碼子間的堿基組成和距離；(4)起始密碼子后的核苷酸序列對核糖體結(jié)合的影響。
針對目前存在的表達效率不高的問題和調(diào)控的可能性，本發(fā)明在原來我們實驗室已構(gòu)建的pDC-TNF載體基礎(chǔ)工作上作了如下三方面改進(1)通過PCR方法在目的基因TNF-α之前連上適用于藍藻的SD序列，(2)縮短了啟動子PpsbA與目的基因之間的距離；(3)調(diào)整SD序列與目的基因TNF-α之間的距離來提高TNF-α的表達效率。
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于在絲狀體藍藻中高效表達外源基因的表達盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種絲狀體藍藻高效表達載體。
因而，本發(fā)明提供了一種用于在絲狀體藍藻中高效表達外源基因的表達盒，包括啟動子，SD序列和目的基因，其中所述的SD序列為5’-GGAGAG-3’。所述的啟動子可以是可以在絲狀體藍藻中表達外源基因的任何一種啟動子，例如PpsbA。
本發(fā)明的表達盒中，所述的外源基因可以為人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因，也可以為其它的外源基因。
在本發(fā)明的表達盒中，SD序列與目的基因起始密碼子之間的距離為4bp。
在本發(fā)明的表達盒中，啟動子與目的基因之間的距離為19bp。
本發(fā)明還提供了一種絲狀體藍藻表達載體，其特征在于，該載體含有本發(fā)明的表達盒。所述的載體可以是任何一種已知的在絲狀體藍藻中表達外源基因的質(zhì)粒載體，例如pKT-210，pDC-08，pRL-489。
本發(fā)明利用質(zhì)粒pIB-Tc構(gòu)建了一種絲狀藍藻的高效表達載體pIB-TNFα，并將這種表達載體在中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，保藏中心地址中國，北京，中關(guān)村。保藏號為CGMCCNo.0508。
在本發(fā)明的表達盒中，從SD序列到起始密碼子的序列最好是GGAGAGTCATATG。
用新的SD序列構(gòu)建成pIB-TNF的表達效率提高了7倍，如表2所示表1
2.宿主菌E.coli DH5α來自本實驗室。
3.質(zhì)粒(1)pRL439，RP4+pRL542 in DH5α由美國國家植物學實驗室C.P.Wolk教授贈送；(2)質(zhì)粒pRL439上帶有PpsbA啟動子、氨芐青霉素抗性基因、以及非受損的bom區(qū)(轉(zhuǎn)移必需區(qū))；穿梭質(zhì)粒pDC-8的大小為11kb，含有pDUI片段，有在藍藻中的復制位點、接合轉(zhuǎn)移驅(qū)動識別位點bom，以及新霉素(NPT)基因，可表達卡那霉素抗性。
2.PCR法改變SD序列(1)引物通過引物設(shè)計在TNF基因的5’-端添加SD序列，在3’-端引入EcoRI的酶切位點。
引物1 含SD1 5’-CCTGGAGAGTCATATGG-3’引物2 含EcoRI酶切位點5’-AGAATTCCCCGGGGATC-3’(2)模板 以TNFα基因為模板(3)PCR反應及產(chǎn)物的純化反應條件94℃變性1min；56℃退火1min；72℃延伸1min。共30個循環(huán)。
純化用4M的乙酸銨和無水乙醇純化。
3.穿梭表達載體pIB-TNF-α的構(gòu)建如


圖1所示，高效表達TNF-α基因的穿梭表達載體pIB-TNF-α的構(gòu)建過程可分為2步(1)把上述PCR產(chǎn)物的約600bp的DNA片段連在質(zhì)粒pRL-439啟動子PpsbA下游的BamH1位點，得到重組質(zhì)粒pIB-Tc；
(2)用EcoRI/SalI雙酶切分別消化重組質(zhì)粒pIB-Tc和穿梭質(zhì)粒pDC-08；回收pIB-Tc的700bp左右的含啟動子PpsbA，SD序列，TNF-α基因的片斷，以及pDC-08的9.0Kb片斷；連接后得到穿梭表達載體pIB-TNFα。
4.穿梭表達載體在大腸桿菌中的表達檢測圖2為大腸桿菌蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果。含有pIB-TNF和pDC-TNF(未改變SD序列)的細菌裂解物中均出現(xiàn)了一條分子量約為17kD的蛋白帶。該蛋白帶分子量大小和TNF-α蛋白的理論值相符。與TNF-α蛋白的標準樣品也一致。而且含pIB-TNF的17kD的蛋白帶明顯比pDC-TNF的濃。經(jīng)CS-910薄層掃描儀檢測，TNF-α蛋白在分別含pIB-TNF和pDC-TNF的菌中的表達量分別是14.2％和6.9％(見圖3)。則改變SD序列后TNF在菌中的表達量提高了1.1倍。
5.三親接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)基因藻的篩選三親接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化7120后，在新霉素選擇壓力下平板篩選2周左右有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，而野生藻對照在新霉素選擇壓力下不能生長(如圖3)。挑單菌落接種于含新霉素25的BG-11培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后變綠。進一步提高新霉素的濃度，將轉(zhuǎn)基因藻接種于含新霉素35、45、55、65、75、85、100ug/ml的BG-11培養(yǎng)液中，培養(yǎng)并觀察。發(fā)現(xiàn)野生型魚腥藻即使在Neo25的培養(yǎng)液中也不能存活，而轉(zhuǎn)基因藻在新霉素100ug/ml的BG-11培養(yǎng)液中仍生長良好。這說明了pIB-TNF已轉(zhuǎn)入魚腥藻7120中，并且可穩(wěn)定維持新霉素抗性。
6.轉(zhuǎn)基因藻的DNA水平檢測分別提取野生藻、正對照(含空載體pDC-08的轉(zhuǎn)基因藻)和轉(zhuǎn)基因藻中的質(zhì)粒DNA，并以其為模板進行PCR反應，發(fā)現(xiàn)只有含pIB-TNF的轉(zhuǎn)基因藻有大小約600bp的PCR產(chǎn)物。證實了TNF基因確實已以質(zhì)粒形式穩(wěn)定存在于藍藻中。
7.TNF-α基因在魚腥藻7120中的表達及活性將藍藻細胞提取液用放射免疫法定量測量，結(jié)果如表2所示。發(fā)現(xiàn)含pIB-TNF的轉(zhuǎn)基因藻中TNFα的表達量比含pDC-TNF(未改變SD序列)的轉(zhuǎn)基因藻提高11倍。
權(quán)利要求
1.一種用于在絲狀體藍藻中高效表達外源基因的表達盒，包括啟動子，SD序列和目的基因，其中所述的SD序列為5’-GGAGAG-3’。
2.按照權(quán)利要求1所述的表達盒，其中，所述的外源基因為人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因。
3.按照權(quán)利要求1所述的表達盒，其中，SD序列與目的基因起始密碼子之間的距離為4bp。
4.按照權(quán)利要求1所述的表達盒，其中，啟動子與目的基因之間的距離為19bp。
5.按照權(quán)利要求1所述的表達盒，其中，所述的啟動子是PpsbA。
6.按照權(quán)利要求1所述的表達盒，其中，從SD序列到起始密碼子的序列是GGAGAGTCATATG。
7.一種絲狀體藍藻表達載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1至6之一所述的表達盒。
8.按照權(quán)利要求7所述的表達載體pIB-TNFα，其保藏號為CGMCCNo.0508。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于在絲狀體藍藻中高效表達外源基因的表達盒,包括啟動子,SD序列和目的基因,其中所述的SD序列為5’－GGAGAG－3’。本發(fā)明還提供了含有所述的表達盒的絲狀體藍藻表達載體。
文檔編號C12N15/70GK1353189SQ00132268
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月14日
發(fā)明者施定基, 冉亮, 李艷, 鐘暉, 劉鳳龍, 彭國宏 申請人:中國科學院植物研究所