專利名稱：：配子體花粉自交不親和性基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明是關于顯花植物金魚草配子體自交不親和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)位點(S位點)中一個基因的克隆，即花粉自交不親和性基因(花粉S基因)，AhSLF-S2(AntirrhinumhispanicumSLocusF-box-S2)。本發(fā)明涉及AhSLF-S2的cDNA序列。金魚草S位點編碼的AhSLF-S2與自交不親和性在花粉中的表達密切相關。本發(fā)明進一步涉及可用于金魚草S2等位基因型鑒定的部分AhSLF-S2序列及其相關的寡聚核苷酸引物。本發(fā)明的主要用途是對自交不親和金魚草及其相關植物進行花粉S基因型的快速鑒定和分離配子體花粉S基因的方法。高等植物花粉落到柱頭上后開始萌發(fā)，然后花粉管沿著雌蕊細胞間隙或表面生長，最終到達子房完成雙受精過程。由于植物很難自主控制落到其柱頭上的花粉，它們在長期進化過程中形成許多在受精前區(qū)分有利花粉的策略，有些種類花粉將被阻止萌發(fā)或生長。這類被抑制的花粉有來自不同種植物的，還有來自同種植物但與該個體基因型過于一致的(比如來自同一植株的花粉)，前者稱為種間不親和性(inter-specificincompatibility)，后者稱為種內不親和性(intra-specificincompatibility)。事實上，種間不親和性益于保持物種的穩(wěn)定性，種內不親和性則可促進種內的遺傳變異。這兩種不親和性的發(fā)生涉及許多復雜的受遺傳控制的相互作用，包括細胞間的相互識別，細胞內和細胞間的信號傳導，以及許多其它相關的影響因子，其中任一過程受阻都可能導致不親和性。在種內不親和性中，最典型的代表是自交不親和性(self-incompatibility，簡稱為SI)，表現(xiàn)為正?？捎拇菩弁ㄖ参镒曰ㄊ诜鄄荒墚a生種子(deNettancourt，1977)。在高等植物中，據(jù)估計有超過一半的物種表現(xiàn)出自交不親和性，并被認為在被子植物早期進化中起到了不可低估的作用(deNettancourt，1977)。絕大多數(shù)SI植物在遺傳上受具有復等位基因的單一位點或基因座(稱為Slocus)控制(deNettancourt，1977)。單位點SI又可根據(jù)花粉不親和表型的遺傳控制方式的不同分為兩類，一類是花粉的自交不親和表型由其攜帶的單倍體S等位基因型決定，即配子體自交不親和性(gametophyticself-incompatibility，GSI)；另一類為孢子體自交不親和性(sporophyticself-incompatibility，SSI)，即花粉表型由產生花粉的植株即二倍體孢子體S等位基因型決定。早期人們認為這兩種機制間的不同可能是由于S基因表達時間的差異造成的。SSI的S基因產物在減數(shù)分裂前合成，并均勻分布在兩種不同S基因型的單倍體花粉胞被上，而GSI的S基因產物則在減數(shù)分裂后合成，只存在于各自的花粉中(Newbiginetal，1993)。但是，現(xiàn)有的證據(jù)表明SSI植物的花粉自交不親和性(花粉S)基因產物為配子體表達模式，只是由于花粉S基因產物為分泌到花粉細胞外的胞被蛋白，因此一個花粉可以攜帶來自兩個不同花粉S基因產物，造成了與孢子體S基因型一致的結果(Stephensonetal，1997；Doughtyetal，1998；Schopferetal.，1999；Cuietal.，2000；Takayamaetal.，2000)。大多數(shù)SI植物表現(xiàn)為GSI，目前較為細致地研究了其中的茄科，薔薇科，玄參科和罌粟科植物(Andersonetal.，1986；Franklinetal.，1995；Xueetal.，1996；Sassaetal.，1996；KaoandMcCubbin，1997)。在前三科的自交不親和植物中，不親和花粉可在柱頭表面萌發(fā)，花粉管生長的抑制發(fā)生在傳遞組織中，在此導致不親和花粉的花粉管生長的抑制，然而罌粟的不親和花粉在柱頭表面萌發(fā)后即受到抑制。通常，根據(jù)SI的遺傳、生理特性，要分離S等位基因產物就需要尋找與特異S基因共分離的雌蕊或花粉蛋白。比如，要分離植株在雌蕊中S1基因型的特異產物，就要尋找一類在所有具S1基因的植株中都有，而在所有無S1基因的植株中都沒有的雌蕊特異蛋白。1952年，Lewis在配子體自交不親和植物月見草(Oenotheraorganesis)中首次發(fā)現(xiàn)了與特定S等位基因相關的蛋白質。此后，研究人員從茄科等植物中發(fā)現(xiàn)含量豐富并與S位點遺傳連鎖的花柱糖蛋白(Slocusglycoproteins，SLG)。通過設計與這些糖蛋白N-端序列同源的寡核苷酸探針和分子雜交的方法，1986年，Anderson等從花煙草(Nicotianaalata)中第一次分離到與GSI相關的編碼S位點花柱糖蛋白的cDNA。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)其蛋白產物與真菌的一類RNaseRh和T2(Kawataetal.，1988)具有同源性，且其含同樣的活性部位，因此具有RNase活性，故而稱為S—核酸酶(S-RNases)(McClureetal.，1989)。目前已有的證據(jù)證明S-RNase控制自交不親和性在花柱中的表達(花柱S基因)(Andersonetal.，1986and1989；Cornishetal.，1987；McClure，etal.，1989and1990；Aietal.，1990；Huangetal.，1994；Leeetal.，1994；Xueetal.，1996；Sassaetal.，1997；Zureketal.，1997；Mattonetal.，1997and1999；Doddsetal.，1999)。但是，目前在GSI植物中還沒有分離到花粉S基因產物。因此，本發(fā)明的目的是分離GSI植物的花粉S基因，并研究所分離的基因和發(fā)展快速鑒定金魚草花粉自交不親和表型及其分離花粉S基因的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定金魚草植株之間自交親和性的方法。本發(fā)明提供了一種鑒定金魚草植株之間自交親和性的方法，該方法包括(1)選取兩個金魚草植株，提取基因組DNA；(2)按照本發(fā)明公開的金魚草S基因設計兩個PCR引物；(3)使用所設計的PCR引物對提取的金魚草基因組DNA進行PCR反應，并對該PCR產物進行測序；(4)如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列相同，則該兩株金魚草植株之間是自交不親和的，如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列不相同，則該兩株金魚草植株之間是自交親和的。在本發(fā)明的上述方法中，按照本發(fā)明的金魚草基因設計PCR引物以及使用所設計的引物進行PCR擴增可按照現(xiàn)有技術中已知的方法進行。本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于鑒定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對。本發(fā)明的用于鑒定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對可以是本發(fā)明所公開的金魚草S基因的任何一個片段，只要上游引物和下游引物之間的距離在10到1970個堿基之間；優(yōu)選在50到1000個堿基之間；最好在100到500個堿基之間。該引物對中的每一個引物的長度可以是6個到50個堿基，優(yōu)選15到30個堿基；最好為20個堿基。本發(fā)明的又一個目的是提供一種改變金魚草自交不親和性的方法。本發(fā)明的改變金魚草自交不親和性的方法包括(1)將本發(fā)明的正義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織并使本發(fā)明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養(yǎng)成植株。通過該方法得到的金魚草植株具有S核酸酶系統(tǒng)的GSI植物中獲得該基因的特異性，使它們產生相應的花粉自交不親和性。本發(fā)明的另一種改變金魚草自交不親和性的方法包括(1)將反義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織并使本發(fā)明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養(yǎng)成植株。將反義AhSLF-S2轉入植物中可以使其或有高度同源性基因的功能喪失，變成自交親和的植物。這些構建為人產生自交不親和和自交親和特性提供了基礎，是一種利用它們在多種GSI植物乃至作物中產生雜種優(yōu)勢的方法。附圖簡要說明圖1金魚草S2等位基因位點的物理結構及編碼和推測的基因?；蜣D錄的方向由盒式箭頭表示。方盒表示外顯子或編碼區(qū)。預測的GENE9和GENE11分別編碼S2核酸酶和AhSLF-S2。Kb，kilobasepairs。圖2AhSLF-S2的cDNA序列(序列一)。核苷酸的位置由數(shù)字標出。圖3AhSLF-S2的氨基酸序列。氨基酸的位置由數(shù)字標出。黑線標出F-box結構域。圖4SLF基因家族的氨基酸序列比較。來自擬南芥和水稻的SLF成員分別有它們的數(shù)據(jù)庫登錄號表示。擬南芥Q64598，Q9SSK2，CAB79194，Q9SU30，AAF26066，Q9S9V1，Q9SI34，022742，AAF30317，Q9SFC7和Q9SDB2。水稻BAA95875。S2GENE11代表AhSLF-S2。不同序列中相同氨基酸由黑框標出，灰框標出保守的氨基酸。位于N端的保守F-box結構域用黑線標出。圖5AhSLF-S2的組織特異表達的Northern分析。利用AhSLF-S2特異探針對來自不同S基因型的不同組織的RNA進行雜交。左側的數(shù)字表示檢測到的轉錄本的大小。Kb，kilobases。圖6AhSLF-S2的組織特異和時空表達的RACE分析。A，來自S2S4基因型植株不同發(fā)育時期組織RNA的RACE產物的雜交結果。泳道1，2和3分別代表來自2mm長花藥期的花藥、花瓣和花托。泳道4，5和6分別代表來自花藥成熟期的花藥、花瓣和花托。B，來自S2S4基因型植株花藥成熟期的花藥(泳道1和2)和花柱(泳道3和4)RNA的RACE產物的雜交結果。C，來自S2S4(泳道1-4)和S1S5基因型植株(泳道5-8)不同發(fā)育時期花藥和花粉RNA的RACE雜交結果。泳道1和5<4mm花藥；泳道2和61-2cm花藥；泳道3和7，成熟花粉；泳道4和8葉片。D，RACE所用基因特異和Adaptor引物位置示意圖。G11aAATGGGCCCATGCAACGGGC。CDSIIIATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N(N＝A，G，C，orT；N-1＝A，G，orC)。箭頭表示基因轉錄的方向。雜交探針為全長cDNA。圖7金魚草S2基因型植株花粉基因型的DNA雜交分析。A，AhSLF-S2的DNA雜交結果。來自不同基因型的5μg基因組DNA分別經(jīng)限制性內切酶HindIII或EcoRI酶解、凝膠電泳分離和轉膜后，以AhSLF-S2的cDNA為探針進行雜交。實心箭頭表示AhSLF-S2的雜交片段，空心箭頭表示與AhSLF-S2同源的非S位點DNA片段。數(shù)字表示雜交片段的大小。泳道1-5代表的基因型分別為S1S4、S4S5、S1S5、ScSc和S1S2。Kb，kilobasepairs。圖下標出了探針的位置。B，S2-核酸酶基因的DNA雜交結果。圖示與A相同。圖8利用PCR快速鑒定金魚草S2基因型植株的花粉基因型。A，利用基因特異引物鑒定花粉S2基因型的PCR分析結果。利用AhSLF-S2和S2-核酸酶基因特異的引物，以不同基因型的基因組DNA(50ng)為模板分別進行PCR反應(94℃1min，35X(60℃1min，72℃1min)，72℃10min)。AhSLF-S2特異引物G11e(ACAATCGACATGGCTAC)，G11f(GTTGTTGCATTCCCGTGAGGG)和G11j(ATTATTTGACATTTGGGTTATG)。S2-核酸酶基因特異引物G2338(ACAATCGACATGGCTAC)和G1280(GCTTGCCCCTTTCTCAAG)(Xueetal.，1996)。PCR產物經(jīng)1％凝膠電泳分離后，EB染色顯示DNA片段。泳道1-8代表的基因型分別為S1S4、S4S5、S2S5、S1S5、S2S5、S4S5、S1S5和S2S4。箭頭標出S2基因型特異的PCR擴增產物。B，AhSLF-S2基因特異引物位置示意圖。實施例植物材料金魚草自交不親和的種間雜種的產生和不同S等位基因分離群體的獲得參見Xueetal.(1996)。用于本發(fā)明的材料為含有S2S4和S1S5的品系(Xueetal.，1996)。它們分別按常規(guī)的栽培條件種植于溫室。由于這些植物為自交不親和，因此不能通過種子繁殖。它們的保持通過扦插完成。實施例1金魚草BAC文庫的構建和篩選首先從來自S2S4植株的葉片分離植物細胞核(LiuandWhittier，1994)。然后利用HindIII將DNA部分酶解后，克隆到同樣酶切的BAC載體pBeloBAC11(Shizuyaetal.，1992)。連接產物通過電轉化的方法轉化大腸桿菌DH10B。通過插入失活Laz基因的方法篩選含有外源DNA的插入子。對近100個插入子大小的分析發(fā)現(xiàn)平均插入子的大小為70kbp。將35000個克隆保存于96孔平板后，利用BIOMEK2000(Beckman)的機器人將這些克隆以高密度點陣方式點到29張HYBOND膜上(每張膜上點1182個克隆)。每個克隆重復點3次。膜經(jīng)處理后(Sambrooketal.，1989)，保存于4℃。為了獲得含有S位點的BAC克隆，利用S2核酸酶基因(Xueetal.，1996)為探針對金魚草BAC文庫進行了篩選(Sambrooketal.，1989)。其中一個陽性克隆經(jīng)進一步的實驗證實含有全長的S2核酸酶，即S2BAC(圖一)。脈沖場電泳分析發(fā)現(xiàn)該克隆的插入子大小約為63kbp。為了確認S2BAC含有的序列為S位點序列，通過反向PCR(IPCR)和BAC末段測序的方法獲得了兩端約500bp的序列。通過設計片段對應的引物，在S等位基因的分離群體(Xueetal.，1996)中沒有發(fā)現(xiàn)兩端與S核酸酶基因有重組，表明S2BAC含有的序列全部來自S位點。實施例2S2BAC的DNA序列分析為了測定S2BAC中插入片段的全部序列，首先利用超聲波處理的方法將純化的S2BAC質粒DNA部分打斷后，分離1-2kb的組分，然后亞克隆到pBluescript載體(Strategene，USA)。第二，挑選2000個有插入片段的轉化子并制備質粒DNA(Sambrooketal.，1989)。第三，利用MEGABASE1000全自動DNA測序儀(MolecularDynamics，USA)測定每個質粒兩端的序列(每個測序反應平均獲得的序列為400bp)。第四，將獲得的序列通過計算機程序(STADENPACKAGE，http//www.sanger.ac.uk/)進行組裝后獲得S2BAC插入子的全長序列(每個核苷酸平均被測的次數(shù)為10次)。序列分析表明S2核酸酶基因位于該克隆約50kb的位置(參見圖一)。利用GENSCAN等(http//www.sanger.ac.uk/)分析發(fā)現(xiàn)該克隆編碼了11個預測的基因，其中包括S2核酸酶基因，說明有可能這些基因為表達基因(參見圖一)。但是，除S2核酸酶基因外，數(shù)據(jù)庫分析表明有其中三個基因(GENE4，6和8)可能編碼反轉座子，而其余的基因都沒有在DNA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)與已知基因同源。實施例3金魚草花藥cDNA文庫的構建收集并合并金魚草不同時期的花藥組織，提取RNA(Xueetal.，1996)。然后利用CLONTECH的SMARTTM試劑盒合成雙鏈cDNA，并將其克隆在λTripEx2載體(CLONTECH，USA)中。插入子檢測發(fā)現(xiàn)該cDNA文庫的插入子大小平均為1kb。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)該文庫的滴度1×106。實施例4一個代表花粉自交不親和性基因AhSLF-S2cDNA克隆的分離和鑒定DNA序列分析表明S2BAC除了含有S2核酸酶基因外還含有其它的基因，這些基因可能為自交不親和基因。但是，如果為控制自交不親和性的基因，如花粉S基因，它必須表現(xiàn)出應有的序列多態(tài)性和配子體基因表達的模式。為了分離S位點中具有花粉S基因特征的基因，對S2BAC中可能編碼多態(tài)性的區(qū)域進行了“掃描”。每2kb設計一對引物，對不同S等位基因型的植株進行PCR分析。結果發(fā)現(xiàn)了GENE2，5，10和11位于多態(tài)性區(qū)域，這些區(qū)域內的基因可能編碼花粉S基因。為了分離花粉中表達的基因，利用多態(tài)性區(qū)域來的探針對上述構建的花藥cDNA文庫進行了篩選。獲得了一個位于S2核酸酶基因下游的GENE11的cDNA。該cDNA為1986個核苷酸(圖二)，Northern雜交分析(Sambrooketal.，1989)表明它代表了一個全長的基因(見實施例5，圖五)。金魚草RNA的分離方法按照Xueetal.(1996)進行。計算機分析表明它編碼一個376個氨基酸的蛋白質(圖三)。與DNA序列的比較發(fā)現(xiàn)該基因不含內含子。數(shù)據(jù)庫分析沒有發(fā)現(xiàn)它與已知的基因同源。但是，在已測序的擬南芥和水稻基因組中發(fā)現(xiàn)了多個與其同源的推測基因(圖四)。Pfam分析發(fā)現(xiàn)這類基因都含有一個保守的F-box結構域(圖四)。因此，它們代表一類新的F-box基因。由于該家族發(fā)現(xiàn)的第一個表達基因來自S位點，所以將它們命名為SLF(SLocusF-box)。將從金魚草S2位點分離的SLF稱為AhSLF-S2(AntirrhinumhispanicumSLF-S2)。結合AhSLF-S2的物理位置、表達模式和序列多態(tài)性方面(案例3和6)的證據(jù)，AhSLF-S2編碼了一個金魚草的花粉自交不親和性基因，即花粉S基因。實施例5AhSLF-S2的表達分析RNA印跡雜交發(fā)現(xiàn)AhSLF-S2只在來自含有S2等位基因植株的花藥組織中表達，而在其它組織中不表達，其轉錄本的大小約為2kb(圖五)。利用等位基因特異的引物，通過RACE分析發(fā)現(xiàn)AhSLF-S2只在減數(shù)分裂后的來自含有S2等位基因植株的花藥以及成熟花藥中表達(圖六)。這些結果說明AhSLF-S2為一個S2等位基因特異的配子體基因，進一步表明它編碼一個花粉S基因。實施例6金魚草S2基因型的鑒定利用AhSLF-S2引物和PCR的方法可以鑒定含S2花粉基因型的金魚草植株(圖七)。同時，也可以利用AhSLF-S2來的DNA探針完成類似的工作(圖八)。金魚草DNA的提取、酶切和印記分析按照Xueetal.(1996)完成。實施例7GSI植物花粉S基因的克隆玄參科植物金魚草和茄科以及薔薇科植物的S位點都編碼S核酸酶。根據(jù)這一相似性，它們的花粉S基因產物也應屬于同一類。因此，通過分離S位點編碼的SLF基因，可以獲得這些SI植物的花粉S基因。首先構建目標植物的基因組DNA文庫，并獲得覆蓋S位點的克隆，通過常規(guī)的分子生物學技術尋找具有SLF特征的基因即可獲得目標植物的花粉S基因。參考文獻1.AiY，SinghA，ColemanCE，IoergerTR，Kheyr-PourA，andKaoT-h.(1990)Self-incompatibilityinPetuniainflataIsolationandcharacterizationofcDNAsencodingS-allele-associatedproteins.Sex.Plant.Reprod.，3130-1382.AndersonMA，CornishEC，MauS-L，WilliamsEG，HoggartR，AtkinsonA，BonigI，GregoB，SimpsonR，RochePJandClarkeAE.(1986)CloningofacDNAforastylarglycoproteinassociatedwithexpressionofself-incompatibilityinNicotianaalata.Nature32138-44.3.AndersonMA，McFaddenGI，BernatzkyR，AtkinsonA，OrpinT，DedmanH，TregearG，F(xiàn)ernleyR，ClarkeAE.(1989)Sequencevariabilityofthreeallelesoftheself-incompatibilitygeneofNicotianaalata.PlantCell，1483-4914.BaiC，SenP，HofmanK，MaL，GoebelM，HarperW，ElledgeS.(1996)Skp1connectscellcycleregulatorstotheubiquitinproteolysismachinerythroughanovelmotif，theF-box.Cell，86263-2745.CornishEC，PettittJM，BonigI，ClarkeAE.(1987)Developmentallycontrolledexpressionofageneassiociatedwithself-incompatibilityinNicotianaalata.Nature，32699-1026.CraigKL，TyersM.(1999)TheF-boxanewmotifforubiquitindependentproteolysisincellcycleregulationandsignaltransduction.Prog.Biophy.Mol.Biol.，72299-3287.CuiY，BiYM，BrugiereN，ArnoldoM，RothsteinSJ.(2000)TheSlocusglycoproteinandtheSreceptorkinasearesufficientforself-pollenrejectioninBrassica.ProcNatlAcadSciUSA.973713-3717.8.deNettancourt，D.(1977)Incopatibilityinangiosperms.(BerlinSpringer-Verlag).9.DoddsPN，F(xiàn)ergusonC，ClarkeA，andNewbiginE.(1999)Pollen-expressedS-RNasesarenotinvolvedinself-incompatibilityinLycopersiconperruvianum.Sex.Plant.Reprod.1276-8710.DoughtyJ，DixonS，HiscockSJ，WillisAC，ParkinIA，DickinsonHG.(1998)PCP-A1，adefensin-likeBrassicapollencoatproteinthatbindstheSlocusglycoprotein，istheproductofgametophyticgeneexpression.PlantCell.101333-1347.11.HuangS，LeeH-S.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S基因設計兩個PCR引物；(3)使用所設計的PCR引物對提取的金魚草基因組DNA進行PCR反應，并對該PCR產物進行測序；(4)如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列相同，則該兩株金魚草植株之間是自交不親和的，如果該兩株金魚草之間的PCR產物的DNA序列不相同，則該兩株金魚草植株之間是自交親和的。3.一種用于鑒定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對，其核苷酸序列為權利要求1所述的金魚草S基因的任何一個片段，但條件是上游引物和下游引物之間的距離在10到1970個堿基之間，該引物對中的每一個引物的長度為6到50個堿基。4.按照權利要求3所述的引物對，其中，上游引物和下游引物之間的距離在50到1000個堿基之間；該引物對中的每一個引物的長度是15到30個堿基。5.按照權利要求3所述的引物對，其中，上游引物和下游引物之間的距離在100到500個堿基之間，該引物對中的每一個引物的長度為20個堿基。6.一種改變金魚草自交不親和性的方法，包括(1)將權利要求1所述的正義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織并使本發(fā)明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養(yǎng)成植株。7.一種改變金魚草自交不親和性的方法，包括(1)將相應于權利要求1所述的基因的反義AhSLF-S2基因克隆到植物轉化載體中；(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生的金魚草組織并使本發(fā)明的基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織培養(yǎng)成植株。全文摘要本發(fā)明提供了一種金魚草S基因,該基因具有說明書所述的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了使用該基因鑒定金魚草植株之間自交親和性的方法、用于鑒定金魚草植株之間自交親和性的PCR引物對、以及一種改變金魚草自交不親和性的方法。文檔編號C12N15/29GK1354254SQ0013246公開日2002年6月19日申請日期2000年11月21日優(yōu)先權日2000年11月21日發(fā)明者薛勇彪,賴釗,張燕生申請人:中國科學院發(fā)育生物學研究所