專利名稱：：編碼pfkA基因的新核苷酸序列的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了編碼pfkA基因的核苷酸序列，和通過具有擴增的pfkA基因的棒狀細菌發(fā)酵生產L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法。氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產。由于其極其重要性，已持續(xù)進行改良生產方法的嘗試。生產方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或產物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產性質。為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的調節(jié)代謝物營養(yǎng)缺陷的并產生L-氨基酸如L-賴氨酸的菌株。一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于棒桿菌生產氨基酸的菌株的改良，其是通過擴增各個生物合成基因并研究對氨基酸生產的作用而進行。這一主題的綜述文章可在Kinoshita(“谷氨酸細菌”，工業(yè)微生物的生物學，Demain和Soloman編輯，BenjaminCummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術學關鍵綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學學會年報782，25-39(1996))。本發(fā)明人目的在于為改良氨基酸尤其是L-賴氨酸的發(fā)酵生產而提供新措施。氨基酸、尤其是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)，因此提供生產氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。當下文提到L-賴氨酸或賴氨酸時，不僅是指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。本發(fā)明提供了一種來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還提供了根據(jù)權利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選包括能復制的DNA，含有(ⅰ)SEQIDNO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。本發(fā)明還提供了權利要求4的多核苷酸，含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，權利要求6的多核苷酸，其編碼含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽，含有權利要求1的多核苷酸序列的載體，特別是穿梭載體或質粒載體，以及作為宿主細胞的含有載體的棒狀細菌。本發(fā)明還提供了基本上由多核苷酸序列組成的多核苷酸，其可通過用含有相應于SEQIDNO1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交合適的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫包括具有相應于SEQIDNO1的所述多核苷酸序列的完整基因。本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼果糖磷酸激酶的全長cDNA，以及分離與果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(PCR)制備編碼磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個、優(yōu)選至少20個、特別優(yōu)選至少15個連續(xù)核苷酸。具有至少40或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的?！胺蛛x的”是指從其天然環(huán)境中分離出來?！岸嗪塑账帷币话愕厣婕岸嗑酆颂呛塑账岷投嗑勖撗鹾颂呛塑账幔淇梢允欠切揎椀腞NA或DNA，或修飾的RNA或DNA?！岸嚯摹睉斫鉃榘ń?jīng)肽鍵結合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質。本發(fā)明的多肽包括SEQIDNO2的多肽，特別是具有果糖磷酸激酶生物學活性的多肽，以及與SEQIDNO2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQIDNO2的多肽至少80％、特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產氨基酸的棒狀細菌發(fā)酵生產氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，在該棒狀細菌中編碼pfkA基因的核苷酸序列是擴增的，尤其是過表達的。文中術語“擴增”是指微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶的胞內活性的增加，例如通過增加一或多個基因的拷貝數(shù)，通過用強啟動子或編碼具有升高的活性的相應酶的基因或等位基因，及任選地組合使用這些方法。本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產L-氨基酸特別是L-賴氨酸。此微生物可以是棒狀細菌尤其是棒桿菌屬的代表菌。在棒桿菌屬中尤其應提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產L-氨基酸的能力。適當?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產氨棒桿菌FERMBP-1539CorynebacteriummelassecolaATCC17965黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產L-氨基酸的突變體或菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715。本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼果糖磷酸激酶(EC2.7.1.11)的新pfkA基因。為了分離谷氨酸棒桿菌的pfkA基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(VerlagChamie，Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實驗手冊(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E.coliK-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學，252255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCosI(Wahl等，1987，ProceedingoftheNationalAcademyofSciencesUSA，842160-2164)，在E.coliK-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質粒如pBR322(Bolivar，生命科學25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學院院報7(1990)4645-4649)所述。借助于粘?？寺〉拈LDNA片段隨后可亞克隆并用適于測序的通用載體測序，如Sanger等(美國科學院院報745463-5467，1977)所述。以此方式可獲得編碼pfkA基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQIDNO1，是本發(fā)明的一部分，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應蛋白質的氨基酸序列。所得pfkA基因產物的氨基酸序列以SEQIDNO2表示。通過遺傳密碼的簡并性產生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQIDNO1或SEQIDNO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，蛋白質中的保守氨基酸置換，如用丙氨酸置換蛋白質中甘氨酸，或用谷氨酸置換蛋白質中天冬氨酸，本領域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質任何功能的改變，即是中性的。另外已知蛋白質N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領域技術人員可在以下文獻中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細菌學雜志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質科學3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技術61321-1325(1988))，及已知關于遺傳和分子生物學的教材。以相應方式產生自SEQIDNO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQIDNO1或SEQIDNO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產生自SEQIDNO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15個核苷酸的長度。通過雜交鑒別DNA序列的指導可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細菌學國際雜志(1991)41255-260)。用聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA序列的指導參見Gait的手冊寡核苷酸合成實用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg，德國，1994)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在pfkA過表達后，棒狀細菌以改良方式生產L-氨基酸尤其是L-賴氨酸。為獲得過表達，可提高相應基因的拷貝數(shù)，或可使位于結構基因上游的啟動子和調節(jié)區(qū)或核糖體結合位點突變。摻入結構基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過可誘導啟動子，在L-賴氨酸發(fā)酵生產期間增強表達也是可能的。通過目的在于延長mRNA壽命的措施，也可改良表達。通過防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因構建體可以不同拷貝數(shù)存在于質粒中，或可在染色體中整合與擴增?；蛘?，通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關基因的過表達。本領域熟練技術人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術5,137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術9,84-87(1991))，Reinscheid等(應用及環(huán)境微生物學60,126-132(1994))，LaBarre等(細菌學雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學綜述60512-538(1996))及已知關于遺傳及分子生物學的教材。例如，本發(fā)明的pfkA基因可借助于質粒過表達。合適的質粒是在棒狀細菌中復制的質粒。各種已知的質粒載體，如pZ1(Menkel等，應用及環(huán)境微生物學(1989)64549-554)，pEKEx1(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))是基于隱蔽質粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它可質粒載體如基于pCG4(US-A4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學通信66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)可以同樣方式使用。其他合適的質粒載體是那些可通過整合進染色體而進行基因擴增的質粒載體，例如，由Reinscheid等(應用及環(huán)境微生物學60126-132(1994))所述的用于復制或擴增hom-thrB操縱子的質粒載體。在這一方法中，將完整基因克隆進能在宿主(典型地是大腸桿菌)中復制而在谷氨酸棒桿菌中不能復制的質粒載體中?？煽紤]的載體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學雜志26932678-84；US-A5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷蘭；Bernard等，分子生物學雜志，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細菌學雜志1734510-4516)。含有待擴增基因的質粒載體然后可經(jīng)接合或轉化轉移進希望的谷氨酸棒桿菌菌株。接合方法例如如Schafer等(應用及環(huán)境微生物學60，756-759(1994))所述。轉化方法例如如Thierbach等(應用微生物學及細菌學29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學通信123，343-347(1994))所述。經(jīng)“交換”而同源重組后，得到的菌株含有至少兩個拷貝的所需基因。另外，不僅是pfkA基因，而且特定生物合成途徑、糖酵解、回補代謝、檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的擴增或過表達，對氨基酸特別是L-賴氨酸的生產可以是有益的。因此，為生產L-賴氨酸，例如可同時過表達一或多種選自如下一組的基因·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，或·編碼三糖磷酸異構酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，或·編碼3-磷酸甘油激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，或·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。對于氨基酸特別是L-賴氨酸的生產，除了擴增pfkA基因外，還有利的是同時弱化·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)和/或·編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因(US09/396,478，DSM12969)。除pfkA基因的過表達之外，抑制非所需的二級反應對氨基酸特別是L-賴氨酸的生產也是有益的(Nakayama“生產氨基酸的微生物的育種”，微生物產物的過量產生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學術出版社，倫敦，英國，1982)。根據(jù)本發(fā)明產生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或用分批方法，補料分批方法或重復補料分批法分批培養(yǎng)以生產氨基酸特別是L-賴氨酸。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechnik1.EinfuhrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需求，關于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D.C.,USA,1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸，這些物質可單獨或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用生長必需物質如氨基酸和維生素，此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中上述物質可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當方式加入培養(yǎng)物中?？梢赃m當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調節(jié)培養(yǎng)物的PH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產生。適當?shù)倪x擇性作用物質例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至賴氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍達到。L-賴氨酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等(分析化學，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用進行。本發(fā)明方法用于發(fā)酵制備氨基酸尤其是L-賴氨酸。本發(fā)明借助于以下提供的實施例得以更詳述闡述。實施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸烊鏣auch等(1995，質粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA并用限制性內切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(RocheMolecularBiochemicals，德國曼海姆，產品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(LaJolla，USA，產品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等(1987)美國科學院院報842160-2164)的DNA用限制性內切酶XbaI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述XbaI，編碼27-0948-02)酶切并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性內切酶BamHI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032DNA片段混合并用T4DNA連接酶(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用GigapackⅡXL包裝提取物(Stratagene，LaJolla，USA，產品描述GigapackⅡXL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細胞置于10mMMgSO4并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。實施例2pfkA基因的分離和測序用QiaprepSpin微量制備試劑盒(產品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離各個菌落的粘粒DNA，并用限制性內切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(RocheMolecularBiochemicals，德國曼海姆，產品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產品描述Zero背景克隆試劑盒，產品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內切酶BamHI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述BamHI，產品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，DNA混合物與T4連接酶(PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學院院報874645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。重組克隆的質粒制備用Biorobot9600(產品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統(tǒng)公司(產品號403044，Weiterstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”。在帶有購自PE應用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABIPrism377”測序儀的“RotiphoresisNF”丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(29∶1)(產品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中進行凝膠電泳分離和序列分析。原始數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。同源性分析用“BLAST搜索程序’(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行。獲得的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。對該核苷酸序列的分析顯示一1029堿基對的開放讀框，其被稱為pfkA基因。pfkA基因編碼343個氨基酸的多肽。實施例3用于在谷氨酸棒桿菌中過量表達pfkA的質粒的制備3.1將pfkA克隆進pCR-Blunt載體如Tauch等(1995，質粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA?；趯嵤├?已知的谷氨酸棒桿菌pfkA基因的序列，選擇下述寡核苷酸用于聚合酶鏈反應pfkA-exp5′-AACTGCAGCTCTGGCGATTA-3′pfkA-ex25′-AACTATCCAAACATTGCCTG-3′所述引物由MWG生物技術公司(Ebersberg，德國)合成，并根據(jù)Innis等(PCR方案，方法和應用指南，1990，學術出版社)的標準PCR方法用來自Roche診斷學有限公司(德國曼海姆)的Pwo聚合酶進行PCR反應。用聚合酶鏈反應分離攜帶pfkA基因的約1160bp的DNA片段。用Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA；目錄號K2700-20)的ZeroBluntPCR克隆試劑盒將擴增的DNA片段連接進載體pCR2Blunt載體(Bernard等，(1983)，分子生物學雜志234534-541)中。用連接混合物轉化大腸桿菌菌株Top10F(Grand等，(1990)，美國科學院院報874645-4649)。通過將轉化混合物在補加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)上鋪板而選擇攜帶質粒的細胞。用來自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉化子分離質粒DNA，并用限制酶EcoRI限制隨后瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)證實。質粒命名為pCRB1-pfkAexp1。3．2穿梭載體pEC-T18mob2的制備根據(jù)現(xiàn)有技術構建大腸桿菌－谷氨酸棒桿菌穿梭載體。該載體含有質粒pGA1的包括復制效應子per(US-A5，175，108；Nesvera等，細菌學雜志179，1525-1532(1997))的復制區(qū)rep，質粒pAG1的賦予四環(huán)素抗性的tetA(Z)基因(US-A5,158,891；國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)基因文庫登錄號AF121000)，質粒pMB1(Sutcliffe，定量生物學冷泉港研討會43，77-90(1979))的復制起點oriV，包括1ac啟動子和多克隆位點(mcs)的1acZα基因片段(Norrander等，基因26，101-106(1983))，以及質粒RP4(Simon等，(1983)生物/技術1784-791)的mob區(qū)。然后將構建的載體轉化進大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實用方案，第Ⅰ卷，IRL出版社，Oxford，華盛頓特區(qū)，美國)。通過將轉化混合物在補加5mg/l四環(huán)素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)上鋪板而選擇攜帶質粒的細胞。用來自Qiagen的QIAprepSpinMiniprep試劑盒從轉化子分離質粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindⅢ限制隨后瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)證實。質粒命名為pEC-T18mob2并如圖1所示。3.3將pfkA克隆進穿梭載體pEC-T18mob2中所用載體是實施例3.2所述的大腸桿菌－谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。來自這一質粒的DNA用限制酶EcoRI完全酶切，然后用蝦堿性磷酸酶(RocheMolecularBiochemicals，德國曼海姆，產品描述SAP，編碼1758250)去磷酸化。通過用限制酶EcoRI完全酶切從實施例3.1所述的質粒pCRB1-pfkAexp1中分離pfkA基因。用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產品號20021，Qiagen，Hilden，德國)從瓊脂糖凝膠中分離約1160bppfkA片段。以此方式獲得的pfkA片段與制備的pEC-T18mob2載體混合，并用T4DNA連接酶(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后轉化進大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實用方案，第Ⅰ卷，IRL出版社，Oxford，華盛頓特區(qū)，美國)。通過將轉化混合物在含有5mg/l四環(huán)素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學190)上鋪板而選擇攜帶質粒的細胞。37℃保溫過夜后，選擇各個重組克隆。根據(jù)廠商指導用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(產品號27106，Qiagen，Hilden，德國)從轉化子分離質粒DNA，并用限制酶EcoRI酶切以經(jīng)隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢查質粒。得到的質粒命名為pT-pfkAexp，其示于圖2。實施例4用質粒pT-pfkAexp轉化菌株DSM5715通過Liebl等所述的電穿孔法(FEMS微生物學通信，53299-303(1989))用質粒pT-pfkAexp轉化菌株DSM5715(EP-B-0435132)。在補加5mg/l四環(huán)素的LBHIS瓊脂(18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨醇，5g/lBacto-胰胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/lNaCl，18g/lBacto-瓊脂))上篩選轉化子。在33℃保溫2天。用常規(guī)方法(Peters-Wendich等，1998，微生物學，144，915-927)從轉化子分離質粒DNA，用限制性內切酶EcoRI切割并經(jīng)隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢查質粒。獲得的菌株稱為DSM5715/pT-pfkAexp。實施例5生產賴氨酸實施例4中制備的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pT-pfkAexp在適于生產賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中的賴氨酸含量。為此，首先在33℃在具有合適抗生素的瓊脂板(具有四環(huán)素(5mg/l)的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。從這些瓊脂板培養(yǎng)物開始，接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgⅢ(NaCl2.5g/l，Bacto-肽胨10g/l，Bacto-酵母膏10g/l，葡萄糖20g/l，pH7.4)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物16小時。從此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(測量波長660nm)是0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿)5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)50g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。24小時后，用Biomek(Beckman儀器有限公司，慕尼黑)確定在660nm測量波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定形成的賴氨酸量。所得結果示于表1。表1<tablesid="table1"num="001"><table>菌株OD(660)賴氨酸HClg/LDSM5715/pT-pfkAexp14.610.1DSM571515.28.1</table></tables>本發(fā)明包括如下附圖圖1質粒pEC-T18mob2圖。圖2質粒pT-pfkAexp圖。圖中所采用的縮寫和符號有如下含義Tet四環(huán)素抗性基因oriV大腸桿菌的質粒編碼的復制起點RP4mob質粒遷移的mob區(qū)rep谷氨酸棒桿菌質粒pGA1的質粒編碼的復制起點perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)′lacZa′lacZα基因片段的5’末端lacZ-alpha′lacZα基因片段的3’末端pfkA谷氨酸棒桿菌ATCC13032的pfkA基因BamHI限制酶BamHI的酶切位點EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點HindⅢ限制酶HindⅢ的酶切位點KpnI限制酶KpnI的酶切位點PstI限制酶PstI的酶切位點PvuI限制酶PvuI的酶切位點SalI限制酶SalI的酶切位點SacI限制酶SacI的酶切位點SmaI限制酶SmaI的酶切位點SphI限制酶SphI的酶切位點XbaI限制酶XbaI的酶切位點XhoI限制酶XhoI的酶切位點序列表&lt;110&gt;德古薩-于爾斯股份公司&lt;120&gt;編碼pfkA基因的新核苷酸序列&lt;130&gt;990169BT&lt;140&gt;&lt;141&gt;&lt;160&gt;2&lt;170&gt;PatentInVer.2.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1274&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(143)..(1171)&lt;400&gt;1gtcgatttgttaatgaaactgcagctctggcgattaaataagatggtcagagacagtttt60ttggcctgtcaacccctgtgattctcttatttttgggtgattgttccggcgcgggtgttg120tgatgggtttaatatggaagacatgcgaattgctactctcacgtcaggcggc172MetArgIleAlaThrLeuThrSerGlyGly1510gactgccccggactaaacgccgtcatccgaggaatcgtccgcacagcc220AspCysProGlyLeuAsnAlaValIleArgGlyIleValArgThrAla152025agcaatgaatttggctccaccgtcgttggttatcaagacggttgggaa268SerAsnGluPheGlySerThrValValGlyTyrGlnAspGlyTrpGlu303540ggactgttaggcgatcgtcgcgtacagctgtatgacgatgaagatatt316GlyLeuLeuGlyAspArgArgValGlnLeuTyrAspAspGluAspIle455055gaccgaatcctccttcgaggcggcaccattttgggcactggtcgcctc364AspArgIleLeuLeuArgGlyGlyThrIleLeuGlyThrGlyArgLeu606570catccggacaagtttaaggccggaattgatcagattaaggccaactta412HisProAspLysPheLysAlaGlyIleAspGlnIleLysAlaAsnLeu75808590gaagacgccggcatcgatgcccttatcccaatcggtggcgaaggaacc460GluAspAlaGlyIleAspAlaLeuIleProIleGlyGlyGluGlyThr95100105ctgaagggtgccaagtggctgtctgataacggtatccctgttgtcggt508LeuLysGlyAlaLysTrpLeuSerAspAsnGlyIleProValValGly110115120gtcccaaagaccattgacaatgacgtgaatggcactgacttcaccttc556ValProLysThrIleAspAsnAspValAsnGlyThrAspPheThrPhe125130135ggtttcgatactgctgtggcagtggctaccgacgctgttgaccgcctg604GlyPheAspThrAlaValAlaValAlaThrAspAlaValAspArgLeu140145150cacaccaccgctgaatctcacaaccgtgtgatgatcgtggaggtcatg652HisThrThrAlaGluSerHisAsnArgValMetIleValGluValMet155160165170ggccgccacgtgggttggattgctctgcacgcaggtatggccggcggt700GlyArgHisValGlyTrPIleAlaLeuHisAlaGlyMetAlaGlyGly175180185gctcactacaccgttattccagaagtacctttcgatattgcagagatc748AlaHisTyrThrValIleProGluValProPheAspIleAlaGluIle190195200tgcaaggcgatggaacgtcgcttccagatgggcgagaagtacggcatt796CysLysAlaMetGluArgArgPheGlnMetGlyGluLysTyrGlyIle205210215atcgtcgttgcggaaggtgcgttgccacgcgaaggcaccatggagctt844IleValValAlaGluGlyAlaLeuProArgGluGlyThrMetGluLeu220225230cgtgaaggccacattgaccagttcggtcacaagaccttcacgggaatt892ArgGluGlyHisIleAspGlnPheGlyHisLysThrPheThrGIyIle235240245250ggacagcagatcgctgatgagatccacgtgcgcctcggccacgatgtt940GlyGlnGlnIleAlaAspGluIleHisValArgLeuGlyHisAspVal255260265cgtacgaccgttcttggccacattcaacgtggtggaaccccaactgct988ArgThrThrValLeuGlyHisIleGlnArgGlyGlyThrProThrAla270275280ttcgaccgtgttctggccactcgttatggtgttcgtgcagctcgtgcg1036PheAspArgValLeuAlaThrArgTyrGlyValArgAlaAlaArgAla285290295tgccatgagggaagctttgacaaggttgttgctttgaagggtgagagc1084CysHisGluGlySerPheAspLysValValAlaLeuLysGlyGluSer300305310attgagatgatcacctttgaagaagcagtcggaaccttgaaggaagtt1132IleGluMetIleThrPheGluGluAlaValGlyThrLeuLysGluVal315320325330ccattcgaacgctgggttactgcccaggcaatgtttggatagtttttcg1181ProPheGluArgTrpValThrAlaGlnAlaMetPheGly335340ggcttttatcaacagccaataacagctctttcgcccattgaggtggaggggctgtttttt1241catgccgtaaggaaagtgcaagtaagtgaaatc1274&lt;210&gt;2&lt;211&gt;343&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;400&gt;2MetArgIleAlaThrLeuThrSerGlyGlyAspCysProGlyLeuAsn151015AlaValIleArgGlyIleValArgThrAlaSerAsnGluPheGlySer202530ThrValValGlyTyrGlnAspGlyTrpGluGlyLeuLeuGlyAspArg354045ArgValGlnLeuTyrAspAspGluAspIleAspArgIleLeuLeuArg505560GlyGlyThrIleLeuGlyThrGlyArgLeuHisProAspLysPheLys65707580AlaGlyIleAspGlnIleLysAlaAsnLeuGluAspAlaGlyIleAsp859095AlaLeuIleProIleGlyGlyGluGlyThrLeuLysGlyAlaLysTrp100105110LeuSerAspAsnGlyIleProValyalGlyValProLysThrIleAsp115120125AsnAspValAsnGlyThrAspPheThrPheGlyPheAspThrAlaVal130135140AlaValAlaThrAspAlaValAspArgLeuHisThrThrAlaGluSer145150155160HisAsnArgValMetIleValGluValMetGlyArgHisValGlyTrp165170175IleAlaLeuHisAlaGlyMetAlaGlyGlyAlaHisTyrThrValIle180185190ProGluValProPheAspIleAlaGluIleCysLysAlaMetGluArg195200205ArgPheGlnMetGlyGluLysTyrGlyIleIleValValAlaGluGly210215220AlaLeuProArgGluGlyThrMetGluLeuArgGluGlyHisIleAsp225230235240GlnPheGlyHisLysThrPheThrGlyIleGlyGlnGlnIleAlaAsp245250255GluIleHisValArgLeuGlyHisAspValArgThrThrValLeuGly260265270HisIleGlnArgGlyGlyThrProThrAlaPheAspArgValLeuAla275280285ThrArgTyrGlyValArgAlaAlaArgAlaCysHisGluGlySerPhe290295300AspLysValValAlaLeuLysGlyGluSerIleGluMetIleThrPhe305310315320GluGluAlaValGlyThrLeuLysGluValProPheGluArgTrpVal325330335ThrAlaGlnAlaMetPheGly340權利要求1.來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包括SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。2.權利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒狀細菌中復制的優(yōu)選地是重組的DNA。3.權利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。4.權利要求2的多核苷酸，含有如SEQIDNO1所示的核酸序列。5.權利要求2的可復制的DNA，含有(ⅰ)如SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內相應于的(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。6.權利要求2的多核苷酸序列，其編碼含有示于SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽。7.發(fā)酵生產L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，其特征在于進行以下步驟(a)發(fā)酵生產L-氨基酸的棒狀細菌，該細菌中至少pfkA基因或其編碼核苷酸序列是擴增的，特別是過表達的，(b)在培養(yǎng)基或細菌細胞中積累L-氨基酸，及(c)分離L-氨基酸。8.權利要求7的方法，特征在于所用細菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因是額外擴增的。9.權利要求7的方法，其特征在于所用細菌中降低L-賴氨酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。10.權利要求7的方法，其特征在于使用經(jīng)質粒載體轉化的菌株，且此質粒載體攜帶編碼pfkA基因的核苷酸序列。11.權利要求7-10任一項的方法，其特征在于使用產生L-賴氨酸的棒狀細菌。12.權利要求6的方法，其特征在于發(fā)酵這樣的細菌生產賴氨酸，所述細菌中選自如下一組的一或多個基因同時擴增，特別是過表達12.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.3編碼三糖磷酸異構酶的tpi基因，12.4編碼琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；傅膁apE基因，12.5編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，12.6編碼3-磷酸甘油激酶的pgk基因，12.7編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因。13.權利要求9的方法，其特征在于發(fā)酵這樣的細菌生產賴氨酸，所述細菌中選自如下一組的一或多個基因同時弱化13.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，13.2編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因。14.前述一或多條權利要求的方法，其特征在于使用谷氨酸棒桿菌的微生物。15.權利要求1的多核苷酸序列作為經(jīng)聚合酶鏈反應產生編碼果糖磷酸激酶的基因的DNA的引物的應用。16.權利要求1的多核苷酸序列作為雜交探針的應用。全文摘要本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其含有選自如下一組的多核苷酸序列:a)與編碼包括SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含有與SEQIDNO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸,以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還提供了經(jīng)擴增pfkA基因發(fā)酵生產L－氨基酸的方法,以及本發(fā)明多核苷酸作為引物或雜交探針的應用。文檔編號C12N1/21GK1297054SQ00132480公開日2001年5月30日申請日期2000年11月21日優(yōu)先權日1999年11月23日發(fā)明者貝蒂娜·默克爾,瓦爾特·普費弗勒申請人:德古薩－于爾斯股份公司