專利名稱：一種堅強(qiáng)芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種堅強(qiáng)芽孢桿菌以及使用這種桿菌通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素的方法。
磷霉素[(-)-1R，2S-環(huán)氧丙基磷酸，(-)-1R，2S-epoxypropylphosphonicacid，F(xiàn)osfomycin，F(xiàn)oM]是一種抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的臨床常用的重要廣譜抗生素，1969年由Hendlin等人自弗氏鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)[1]。它與丙酮酰轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合，導(dǎo)致該酶不可逆失活，抑制N-乙酰胞壁酸的合成[2]。磷霉素與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性，因而在臨床上可用于耐藥性金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌及沙門氏菌等引起的感染，如敗血癥、腦膜炎、肺炎及尿道、腸道、皮膚軟組織等的感染。
由于磷霉素的結(jié)構(gòu)簡單，目前工業(yè)上以化學(xué)全合成進(jìn)行生產(chǎn)，得到磷霉素的外消旋體，經(jīng)化學(xué)拆分，得到磷霉素，由順丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，PPOH)到磷霉素的實際收率低于32％[3]。由于右旋磷霉素完全廢棄，加之需要大量的化學(xué)拆分試劑，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。
利用微生物可以將磷霉素合成的中間體順丙烯磷酸直接環(huán)氧化為磷霉素(


圖1)，該反應(yīng)為立體有擇性反應(yīng)，不存在化學(xué)拆分的問題，且條件溫和，污染較少，所得產(chǎn)品的光學(xué)純度較高。表1列出相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果。利用微生物環(huán)氧化順丙烯磷酸產(chǎn)生磷霉素的過程如下所示
表1.微生物立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸產(chǎn)生磷霉素的文獻(xiàn)
由于存在底物或產(chǎn)物抑制作用，目前達(dá)到的最高水平是細(xì)菌在底物濃度達(dá)到0.5％(g/ml，下同)時，轉(zhuǎn)化率40％，產(chǎn)物濃度2.1mg/mL[4]；真菌在順丙烯磷酸濃度為0.3％時，其轉(zhuǎn)化率為40％，最高產(chǎn)物濃度1.15mg/mL[7]。
本發(fā)明的一個目的是提供一種堅強(qiáng)芽孢桿菌，這種桿菌可以通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用本發(fā)明的堅強(qiáng)芽孢桿菌通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素的方法。
我們由土樣中篩選到了8株細(xì)菌，皆可將順丙烯磷酸立體選擇性環(huán)氧化為磷霉素。其中一株堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，編號S101。因而，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的可以將順丙烯磷酸立體選擇性環(huán)氧化為磷霉素的微生物堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，編號為S101。該菌株采自北京香山土壤中，經(jīng)富集培養(yǎng)，篩選得到。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國，北京，中關(guān)村，郵政編碼100080)，保藏編號為CGMCC No.0495，名稱為堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S101。
該菌株具有如下特征細(xì)胞桿狀，革蘭氏陽性，大小為0.75×2.0～3.75μm，產(chǎn)生中生近端生的橢圓狀芽孢，孢囊不膨大。細(xì)胞內(nèi)無聚-β-羥基丁酸鹽(PHB)顆粒。不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇(V-P反應(yīng)陰性)，VP液最終pH7.2。接觸酶陽性，氧化酶陽性。卵磷脂酶陰性，還原硝酸鹽。在7％NaCl中生長但pH5.7時不生長，在厭氧培養(yǎng)基中不生長，營專營好氧生活。從葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，石蕊牛奶呈還原反應(yīng)。
該菌株具有如下轉(zhuǎn)化特點1.底物耐受性好，以PPOH為碳源(3％～5％)生長良好，但沒有轉(zhuǎn)化；2.該菌產(chǎn)磷霉素的量隨著底物濃度的增加而增加，但轉(zhuǎn)化率下降，在底物濃度1.0％時，產(chǎn)率15％；3.產(chǎn)物濃度高，在底物濃度0.5％時，產(chǎn)物濃度達(dá)2.65mg/mL；該菌種對于底物的純度要求不高，明顯優(yōu)于本研究組曾經(jīng)篩選到的青霉菌。
生長、保藏培養(yǎng)基菌株在瓊脂牛肉汁斜面上生長良好。
本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的堅強(qiáng)芽孢桿菌通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的堅強(qiáng)芽孢桿菌，并從培養(yǎng)上清液中分離手性藥物磷霉素的步驟。
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基可以是含有適當(dāng)?shù)奶荚?，氮源和順丙烯磷酸的培養(yǎng)基，例如，可以是含有甘油，蛋白胨，牛肉浸膏，礬酸鈉，氯化鈷和順丙烯磷酸的培養(yǎng)基，該菌株可以完成將順丙烯磷酸立體選擇性轉(zhuǎn)化為磷霉素。
在上述培養(yǎng)基中甘油可被其他碳源所代替，如蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖等。甘油的最佳用量為培養(yǎng)基總體積的1％～7％(重量/體積)。
可以完成該轉(zhuǎn)化反應(yīng)的蛋白胨有魚蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨和玉米漿等。最佳為胰蛋白胨和聚胨。蛋白胨的最佳用量為培養(yǎng)基總體積的1％～5％(重量/體積)。
牛肉浸膏可被酵母膏等替代，牛肉浸膏的最佳用量為培養(yǎng)基總體積的0.3％～3％(重量/體積)。
硫酸鎂可被各種鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋇鹽、鈣鹽、鋁鹽所代替；礬酸鈉和氯化鈷可被相應(yīng)的鹽所代替。
pH對轉(zhuǎn)化的影響pH6～9皆可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，pH7～8為最適值。
溫度對轉(zhuǎn)化的影響該反應(yīng)在20℃～40℃的范圍內(nèi)皆可進(jìn)行，最適溫度28℃。
培養(yǎng)時間轉(zhuǎn)化培養(yǎng)4天～5天開始產(chǎn)生磷霉素，5天～7天達(dá)到最高水平。
底物在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為0.05-2(重量/體積)％。
實施例實施例一、磷霉素的制備1、堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S101，在牛肉汁瓊脂斜面上28℃培養(yǎng)24h。
2、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基甘油3％，胰蛋白胨1％，聚胨2％，牛肉浸膏0.5％，MgSO4·7H2O 0.15％，Na3VO4·12H2O 0.01％，CoCl2·6H2O 0.05％，蒸餾水，PPOH 0.05％～5％，pH8.0。
3、把步驟1的菌株接入2中，在28℃，280r/min的搖床上培養(yǎng)5天。按照實施例二所示的方法進(jìn)行生物檢測以確定磷霉素的生成并達(dá)到了最高值。
4、收集3產(chǎn)生的發(fā)酵液，合并離心，棄去菌絲。上清液按2％的量加入活性炭攪拌，抽濾，除去活性炭。上清液通過290陰離子交換樹脂柱，蒸餾水洗柱至流出液無色。以0％～3％的NaCl水溶液洗脫。收集活性部分，減壓濃縮，濃縮液用硅膠柱干柱減壓柱層析(硅膠H)，50％甲醇洗脫，活性部分減壓濃縮除去甲醇，水溶液冷凍干燥，得磷霉素粗品(尚有少部分未轉(zhuǎn)化的底物PPOH)。實施例二、磷霉素的檢測與鑒定1、生物檢測指示菌變形桿菌(Proteus sp.)FI-1，該菌的生長只被磷霉素抑制，右旋磷霉素、PPOH以及實驗中的其它物質(zhì)皆不抑制其生長。菌在牛肉汁加糖的瓊脂斜面上37℃培養(yǎng)16h后使用。將由蛋白胨，牛肉膏，酵母膏和洋菜組成的培養(yǎng)基熔融，冷卻，接入指示菌，傾倒平皿。
磷霉素檢測將10μl樣品加于直徑8mm的圓形濾紙片上，吹干，貼于含指示菌的培養(yǎng)皿上，28℃，培養(yǎng)16h，磷霉素可產(chǎn)生清晰透明之抑菌圈。抑菌圈的直徑與磷霉素濃度的對數(shù)在一定范圍內(nèi)成正比，據(jù)此可得磷霉素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算磷霉素的濃度。
2、磷霉素的薄層層析[8]
利用如下展開劑系統(tǒng)，可以將磷霉素與底物PPOH區(qū)分開來a.正丁醇∶乙酸∶水(3∶1∶1)；b.甲醇∶水∶三乙胺(80∶20∶5)。顯色劑a.含0.1％FeCl3·6H2O的80％乙醇水溶液；b.含1％磺基水楊酸的80％乙醇水溶液，先a后b，磷霉素顯白色斑點(見
圖1)。將展開后的硅膠板置于含指示菌的培養(yǎng)皿上，待浸潤后取下，28℃，培養(yǎng)16h，含磷霉素的部分產(chǎn)生抑菌圈。比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值可確證磷霉素的存在。實施例三、影響轉(zhuǎn)化的因素1、甘油對轉(zhuǎn)化的影響甘油是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。表2部分顯示了甘油的用量與轉(zhuǎn)化的關(guān)系。
表2.甘油的量與轉(zhuǎn)化的關(guān)系
*φ代表抑菌圈直徑，下同2、底物濃度與轉(zhuǎn)化的關(guān)系30ml轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后，發(fā)酵液體積約為25ml，測定磷霉素濃度。結(jié)果見表2，在沒有PPOH時發(fā)酵液中沒有磷霉素，該結(jié)果也說明磷霉素是由PPOH轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的，而不是發(fā)酵產(chǎn)生。
表3 PPOH的濃度對轉(zhuǎn)化的影響
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1.一種堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)S101，保藏編號為CGMCC No.0495。
2.一種利用微生物通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的堅強(qiáng)芽孢桿菌，并從培養(yǎng)上清液中分離手性藥物磷霉素的步驟。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，培養(yǎng)所述的堅強(qiáng)芽孢桿菌時所使用的培養(yǎng)基中含有甘油，蛋白胨，牛肉浸膏，礬酸鈉和氯化鈷和順丙烯磷酸。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，培養(yǎng)基中甘油的用量為培養(yǎng)基總體積的1％～7％(重量/體積)。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，培養(yǎng)基中蛋白胨的用量為培養(yǎng)基總體積的1％～5％(重量/體積)。
6.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，牛肉浸膏的用量為培養(yǎng)基總體積的0.3％～3％(重量/體積)。
7.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，培養(yǎng)基的pH為7～8。
8.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，培養(yǎng)溫度為28℃。
9.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，底物順丙烯磷酸在培養(yǎng)基中的濃度為0.05-2(重量/體積)％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)S101,保藏編號為CGMCC No.0495。本發(fā)明還提供了一種利用微生物通過立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸制備手性藥物磷霉素的方法,該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的堅強(qiáng)芽孢桿菌,并從培養(yǎng)上清液中分離手性藥物磷霉素的步驟。
文檔編號C12N1/20GK1355292SQ0013251
公開日2002年6月26日 申請日期2000年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月24日
發(fā)明者石家驥 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所