專利名稱：：編碼基因sucC和sucD的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了棒狀細(xì)菌編碼基因sucC和sucD的核苷酸序列和應(yīng)用sucC基因和/或sucD基因弱化的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸尤其是L-賴氨酸和L-谷氨酸的方法。L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-谷氨酸，可以用于人類藥品和制藥產(chǎn)業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、尤其可用于動物營養(yǎng)。眾所周知氨基酸是通過棒狀細(xì)菌菌株特別是谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而產(chǎn)生。由于氨基酸的重要性人們一直在努力改善其生產(chǎn)方法。產(chǎn)量的提高包括發(fā)酵技術(shù)，例如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組份，例如發(fā)酵過程中糖的濃度，或通過如離子交換層析對產(chǎn)物的加工，或微生物自身固有的生產(chǎn)性質(zhì)。利用包括誘變，篩選和突變體精選的方法改進生產(chǎn)特性。這樣獲得的菌株具有對抗代謝物的抗性或者成為重要的調(diào)控代謝物營養(yǎng)缺陷型，并且產(chǎn)生氨基酸。近年來重組DNA技術(shù)方法也用于改善生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌菌株。本發(fā)明人的目的在于提供改善氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的新方法。對于下文中提到的L-氨基酸或氨基酸，應(yīng)理解的是，這些術(shù)語指一個或多個包括它們的鹽形式的氨基酸，這些氨基酸選自如下一組，L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。尤其優(yōu)選的是指L-賴氨酸和L-谷氨酸。本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，它含有選自下列一組的多核苷酸序列a)與編碼含SEQIDNo.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％的相同性的多核苷酸，b)與編碼含SEQIDNo.3氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％的相同性的多核苷酸，c)編碼含有與SEQIDNo.2氨基酸序列有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，d)編碼含有與SEQIDNo.3氨基酸序列有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)與a)、b)、c)或d)互補的多核苷酸，及，f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，該多肽優(yōu)選的顯示出琥珀酰輔酶A合成酶的活性。本發(fā)明還提供了如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，它優(yōu)選的是可復(fù)制的DNA，包含(ⅰ)如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列，或(ⅱ)至少一個在遺傳密碼子簡并性范圍內(nèi)基于序列(ⅰ)的序列，或(ⅲ)至少一個可與序列(ⅰ)或(ⅱ)的互補序列相雜交的序列，以及任選地(ⅳ)(ⅰ)的功能性中性有義突變株。本發(fā)明進一步還提供了如權(quán)利要求4所述的含有如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列的多核苷酸，如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸優(yōu)選的是重組的、可在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的DNA，含有本發(fā)明的多核苷酸的部分，至少是所述序列的15個連續(xù)核苷酸的載體，和sucC基因和/或sucD基因通過尤其是插入或缺失而弱化的棒狀細(xì)菌。本發(fā)明還提供了一些多核苷酸，它們基本上包含有一段多核苷酸序列，它可利用雜交的方法通過用含有如SEQIDNo.1的上述多核苷酸序列或其片段的探針篩選相應(yīng)的基因文庫獲得，該文庫含有完整的具有如SEQIDNo.1所述的多核苷酸序列的sucC基因和/或sucD基因，本發(fā)明還涉及上述DNA序列的分離。含本發(fā)明的序列的多核苷酸適于作為RNA,cDNA,和DNA雜交探針，以便分離全長的編碼琥珀酰輔酶A合成酶的cDNA，核酸和/或多核苷酸或基因，和分離序列與琥珀酰輔酶A合成酶基因有高度相似性的cDNA或基因。含本發(fā)明的序列的多核苷酸還適于作為引物，以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從編碼琥珀酰輔酶A合成酶的基因產(chǎn)生DNA。作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30，優(yōu)選的至少20，尤其特別優(yōu)選的是15個連續(xù)核苷酸。長度至少是40或50個核苷酸的寡核苷酸也適用?！胺蛛x的”是指從天然環(huán)境中分離的。“多核苷酸”總的來說是指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其中這些術(shù)語可以是指未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。至于術(shù)語“多肽”應(yīng)理解為含有通過肽鍵連接的兩個或兩個以上氨基酸的肽或蛋白。本發(fā)明的多肽包括如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所述的多肽，尤其是那些具有琥珀酰輔酶A合成酶活性的多肽，以及那些與如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所述的多肽具有至少70％相同性，且優(yōu)選與如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所述的多肽具有至少80％，尤其優(yōu)選至少90％到95％的相同性，并帶有上述的活性的多肽。本發(fā)明進一步還涉及利用已經(jīng)可以生產(chǎn)氨基酸尤其是L-賴氨酸和L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌來發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的方法，其中所說的氨基酸選自如下一組，L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸，尤其是L-賴氨酸和L-谷氨酸，而且所述細(xì)菌中編碼sucC基因和/或sucD基因的核苷序列被弱化，尤其以低水平表達(dá)。本文所用術(shù)語“弱化”描述的是降低或關(guān)閉微生物中由相關(guān)DNA編碼的一種或多種酶(蛋白)的胞內(nèi)活性，例如利用弱啟動子或編碼相應(yīng)的具有低活性的酶的基因和/或等位基因和/或失活相關(guān)基因或酶(蛋白)，且任選地上述這些特征的組合。本發(fā)明的微生物能從葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸，尤其是L-賴氨酸。微生物的類型可是棒狀細(xì)菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中應(yīng)當(dāng)特別注意的是谷氨酸棒桿菌，它因產(chǎn)生L-氨基酸的能力而為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知。棒桿菌屬合適的菌株，特別是谷氨酸棒桿菌類型，尤其是如下所知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870CorynebacteriummelassecolaATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERMBP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020及從中獲得的產(chǎn)生L-氨基酸的突變體和/或菌株，例如L-賴氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5714。編碼琥珀酰輔酶A合成酶(EC6.2.1.5)的新基因sucC和sucD已從谷氨酸棒桿菌中得到分離。為了從谷氨酸棒桿菌中分離sucC基因和/或sucD基因或其它基因，首先在大腸桿菌中構(gòu)建了該微生物的一個基因文庫?；蛭膸斓臉?gòu)建在周知的教科書和手冊中都有敘述?？商峒暗睦影╓innacker所著的教科書基因和克隆，基因技術(shù)入門(VerlagChemie,Weinheim，德國，1990)或Sambrook等著的手冊分子克隆，實驗室指南(冷泉港實驗室出版社，1989)。一個非常有名的基因文庫是大腸桿菌K-12菌株W3110，由Kohara等在λ載體上構(gòu)建的(細(xì)胞50,495-508(1987))。Bathe等(分子和普通遺傳學(xué)，252255-265,1996)描述了一個來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032用粘粒載體SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美國國家科學(xué)院進展，842160-2164)構(gòu)建于大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)的基因文庫。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3),317-326(1992))描述了利用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))從谷氨酸棒桿菌ATCC13032獲得的基因文庫。O′Donohue(來自谷氨酸棒桿菌的四種普通芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析。Ph.D論文，愛爾蘭國家大學(xué)，Galway,1997)描述了利用Short等(核酸研究，167583)所述的λZap表達(dá)系統(tǒng)進行谷氨酸棒桿菌基因的克隆。為了在大腸桿菌中產(chǎn)生來自谷氨酸棒桿菌的基因文庫，可使用如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)，25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因，19259-268)質(zhì)粒。尤其適于做宿主的是那些限制性缺陷和重組缺陷的大腸桿菌菌株，諸如菌株DH5α(JeffreyH.Miller“細(xì)菌遺傳學(xué)快速教程，大腸桿菌和相關(guān)細(xì)菌的實驗室指南和手冊”，冷泉港實驗室出版社，1992)。在粘粒或其它λ載體的協(xié)助下克隆的長DNA片段可隨后被亞克隆到易于獲得的適于DNA測序的載體上。DNA測序方法如特別是Sanger等所描述的(美國國家科學(xué)院進展，745463-5467,1977)。獲得的DNA序列然后可通過已知的運算和/或序列分析程序進行研究，例如Staden的研究方法(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG-方案(生化分析方法39,74-97(1998)),Pearson和Lipman的FASTA運算(美國國家科學(xué)院進展85,2444-2448(1988))或Alschul等的BLAST運算(自然遺傳學(xué)6,119-129(1994))并與公共收錄數(shù)據(jù)庫中列出的序列條目進行比較。核苷酸序列的公共收錄數(shù)據(jù)庫正如歐洲分子生物實驗室(EMBL，海德堡，德國)或生物技術(shù)信息國家中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)的數(shù)據(jù)庫。編碼sucC和sucD基因的谷氨酸棒桿菌新DNA序列已被發(fā)現(xiàn)，如SEQIDNo.1是本發(fā)明的一部分。而且相關(guān)蛋白的氨基酸序列已通過上述方法得自現(xiàn)存的DNA序列。產(chǎn)生的susC基因和sucD基因產(chǎn)物的氨基酸序列示于SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。根據(jù)遺傳密碼子的簡并性而由SEQIDNo.1衍生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的主題之一。同樣的可與SEQIDNo.1或部分SEQIDNo.1雜交的DNA序列也是本發(fā)明的主題之一。最后，通過從SEQIDNo.1獲得的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的DNA序列也是本發(fā)明的主題之一。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以通過尤其是在寶靈曼GmbH(曼海姆，德國)出版的手冊“DIG系統(tǒng)用戶濾膜雜交指南”和Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國際雜志(1991)41255-260)的雜交方法發(fā)現(xiàn)鑒定DNA序列的信息。雜交在嚴(yán)格的條件下進行，就是說雜交僅在探針和靶序列，即用探針處理的多核苷酸，有至少70％相同的情況下發(fā)生。眾所周知包括洗膜步驟的完全雜交受緩沖液組分、溫度和鹽濃度變化的影響或甚至是由其決定。優(yōu)選地在相對洗膜步驟完全性相對低的程度進行雜交反應(yīng)(Hybaid雜交指南，Hybaid有限公司，Teddington,UK,1996)。例如5xSSC緩沖液可在溫度為50-60℃時用于雜交反應(yīng)。在此過程中探針也可和與探針序列相同性少于70％的多核苷酸雜交。這樣的雜交不太穩(wěn)定且在嚴(yán)格的條件下會被洗去。這可如通過降低鹽濃度到2xSSC及任選地連續(xù)降至0.5xSSC(DIG系統(tǒng)用戶濾膜雜交指南，寶靈曼，曼海姆，德國，1995)，溫度繼續(xù)保持50-68℃而實現(xiàn)。也可任選地降低鹽濃度低至0.1xSSC。通過從50-68℃起1-2℃逐步提高溫度，可分離顯示出如與所用探針有至少70％或至少80％或至少90％-95％相同性的多核苷酸片段。雜交的詳盡說明可連同所述的試劑盒商購得到(例如DIGEasyHybvonderFirmaRocheDiagnosticsGmbH，曼海姆，德國，目錄號160558)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可通過聚合酶鏈反應(yīng)尤其是按Gait手冊寡核苷酸合成實用途徑(IRL出版社，牛津，英國，1984)和Newton和GrahamPCR(SpektrumAkademischerVerlag，海德堡，德國，1994)中所述的方法發(fā)現(xiàn)增強DNA序列的細(xì)節(jié)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)棒狀細(xì)菌在sucC基因和/或sucD基因弱化后可增強L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)。為了獲得這種弱化，可以將sucC基因和/或sucD基因的表達(dá)降低或關(guān)閉，也可以將酶蛋白催化活性降低或關(guān)閉?；蛘邔煞N方法的結(jié)合起來?；虮磉_(dá)的降低可通過合適的培養(yǎng)條件或基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)遺傳改變(突變)獲得?；虮磉_(dá)的信號結(jié)構(gòu)是指如阻遏基因，激活基因，操縱子，啟動子，滅活子，核糖體結(jié)合位點，起始密碼子和終止子結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可從上文獲得信息如在發(fā)明應(yīng)用WO96/15246,Boyd和Murphy(細(xì)菌學(xué)雜志1705949(1988)),Voskuil和Chambliss(核酸研究263548(1998)),Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58191(1998)),Patek等(微生物學(xué)1421297(1996))和熟知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中，例如Knippers的教科書(“分子遺傳學(xué)”，第6版，GeorgThiemeVerlag,Stuttgart，德國，1995)或Winnacker的教科書(“基因和克隆”，VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim，德國，1990)。導(dǎo)致改變和/或降低酶蛋白催化活性的突變在本領(lǐng)域背景中已有介紹；可提及的例子包括Qiu和Goodman(生物化學(xué)雜志2728611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科學(xué)生物技術(shù)和生物化學(xué)611760-1762(1997))和Mockel(“谷氨酸棒桿菌中蘇氨酸脫氫酶取消變構(gòu)調(diào)控和酶的結(jié)構(gòu)”)，Juelichs研究中心的報告，Jul-2906,ISSN09442952,Jlich，德國，1994)?？蓮倪z傳和分子生物學(xué)教科書匯總獲得概論和摘要，例如Hagemann(普通遺傳學(xué)，GustavFischerVerlag,Stuttgart,1986)所著。突變包括諸如轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等現(xiàn)象。根據(jù)氨基酸替換對酶活性的影響，可分為錯義突變和無義突變?；蛑兄辽僖粋€堿基對的插入或缺失，導(dǎo)致框架移動突變，導(dǎo)致加入錯誤的氨基酸或翻譯過早結(jié)束。密碼子缺失通常導(dǎo)致酶活性的完全抑制。產(chǎn)生這種突變的詳細(xì)內(nèi)容是本領(lǐng)域背景知識的一部分并且可從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的教科書中獲得，例如Kmippers著的教科書(“分子遺傳學(xué)”，第6版，GeorgThiemeVerlag,Strttgart，德國，1995)，Winnacker所著(“基因和克隆”，VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim，德國，1990)或Hagemann所著(“AllgemeineGenetik”,GustavfischerVerlag,Stuttgart,1986)。一種常規(guī)的突變谷氨酸棒桿菌基因的方法是Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9,84-87(1991))描述的基因破壞和基因置換的方法。基因破壞法的核心部分是將目的基因編碼區(qū)克隆到在宿主細(xì)胞(典型的是大腸桿菌)中可復(fù)制但在谷氨酸棒桿菌中不能復(fù)制的質(zhì)粒載體上?？墒褂玫妮d體包括如pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schfer等，基因145,69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jger等，細(xì)菌學(xué)雜志1745462-65(1992)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)生物化學(xué)雜志26932678-84；美國專利5,487,993)，pCRBlunt(FirmaInvitrogen,Groningen,Niederlande；Bemard等，分子生物學(xué)雜志，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志1734510-4516)。含基因編碼區(qū)核心部分的質(zhì)粒載體接著通過接合或轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌目的菌株中得到轉(zhuǎn)變。接合的方法如Schfer等所描述的(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60,756-759(1994))。轉(zhuǎn)化的方法如Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7,1067-1070(1989))和Tauch(FEMS微生物學(xué)通信123,343-347(1994))所描述的等。通過交換事件而同源重組后，受影響的基因編碼區(qū)被載體序列破壞且獲得兩個不完整等位基因，每個都缺少3′和5′末端。這種方法在如Fitzpatrick等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)42,575-580(1994))關(guān)閉谷氨酸棒桿菌的recA基因時曾使用過。sucC基因和/或sucD基因也是通過這種方法關(guān)閉的。在基因置換方法中，在感興趣的基因中體外產(chǎn)生一突變，例如缺失、插入或堿基交換。將產(chǎn)生的等位基因隨后克隆入不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的載體中，隨后該載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或結(jié)合轉(zhuǎn)化而進入所需的谷氨酸棒桿菌宿主。通過實現(xiàn)整合的第一次交換事件和實現(xiàn)切割的合適的第二次交換事件而同源重組后，實現(xiàn)突變和/或等位基因在靶基因和/或靶序列中的摻入。這一方法例如在Peters-Wendisch(微生物學(xué)144,915-927(1998))經(jīng)缺失關(guān)閉谷氨酸棒桿菌的pyc基因時使用過。以此方式可將缺失、插入或堿基交換摻入sucC和/或sucD基因中。通過這種方法可將缺失、插入或堿基交換摻入到sucC基因和/或sucD基因中。而且，為了有利于生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸，除了弱化sucC基因和/或sucD基因，也可以增強，尤其是過表達(dá)，一種或多種相關(guān)的生物合成途徑、糖酵解、回補途徑、三羧酸循環(huán)或氨基酸輸出的酶。因此，在L-賴氨酸和/或L-谷氨酸的生產(chǎn)上，除了弱化sucC基因和/或sucD基因，還可以將選自下列一組中的一個或多個基因增強，尤其是過表達(dá)·編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸鹽合酶的dapA基因(EP-B0197335)，·編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086)，·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086)，·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，生物化學(xué)歐洲雜志254,395-403(1998))，·編碼反饋抑制天冬氨酸激酶的lysC基因(AccessionNo.P26512)，·編碼L-賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A19548222)，·編碼Zwal-蛋白的zwal基因(DE19959328.0,DSM13115)。而且，除了弱化sucC基因和/或sucD基因外，同時將選自下列一組中的一個或多個基因的表達(dá)弱化也可利于提高L-賴氨酸和/或L-谷氨酸的生產(chǎn)·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7,DSM13114)，·編碼zwa2-蛋白的zwa2基因(DE19959327.2,DSM13113)。另外除了弱化sucC基因和/或sucD基因外，關(guān)閉非所需的次要反應(yīng)也有利于提高L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和/或L-谷氨酸的生產(chǎn)(Nakayama“培養(yǎng)生產(chǎn)氨基酸的微生物”，出處微生物產(chǎn)物的過表達(dá)，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.)，學(xué)院出版社，倫敦，UK,1982)。含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的微生物也是本發(fā)明的主題之一，并可連續(xù)培養(yǎng)或以分批法分批發(fā)酵(分批培養(yǎng))或用補料分批或重復(fù)補料分批法來生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸。在Chmiel的教科書(生物方法技術(shù)，生物工程入門(GustavFisherverlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科書(生物反應(yīng)器和外周設(shè)施(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中有已知培養(yǎng)方法的概述。所用的培養(yǎng)基必須滿足相關(guān)菌株的需要。不同微生物培養(yǎng)基的說明在美國細(xì)菌學(xué)協(xié)會(華盛頓D.CUSA,1981)的“普通細(xì)菌學(xué)方法指南”的冊子中可見?？赡苡玫降奶荚词翘呛吞妓衔锶缙咸烟恰⒄崽?、乳糖、果糖、甘露糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪如大豆油、向日葵油、落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸，醇如甘油和乙醇，有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨使用或混合使用?？勺鳛榈词褂糜袡C氮包括復(fù)合物如蛋白胨、酵母抽提物、肉類抽提物、麥芽抽提物、玉米浸泡液、大豆面粉和尿素，或無機復(fù)合物如硫酸銨，氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨使用或混合使用?？勺鳛榱自词褂玫挠辛姿帷⒘姿岫溻浕蛄姿釟涠?，或相關(guān)含鈉的鹽。而且培養(yǎng)基必須含有鹽或金屬如生長必須的硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除上述物質(zhì)外，基本的生長物質(zhì)如氨基酸和維生素也要使用。除外，需向培養(yǎng)基中加合適的前體物質(zhì)。上文提到的原種物質(zhì)可以一次性添加到培養(yǎng)基中，或在實際培養(yǎng)中以適當(dāng)?shù)姆椒尤??？捎眠m當(dāng)?shù)膲A性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。用消泡劑如脂肪酸、多聚甘油酯防止泡沫產(chǎn)生。向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)挠行У倪x擇性物質(zhì)如抗生素以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定。要在培養(yǎng)當(dāng)中引入氧或含氧氣體混合物如空氣以維持通氣條件。培養(yǎng)溫度通常維持在20℃到45℃，優(yōu)選的25℃到40℃。培養(yǎng)繼續(xù)直到目的產(chǎn)物已達(dá)最大產(chǎn)量。此目的通常在10小時到160小時內(nèi)達(dá)到。從本領(lǐng)域背景中可知測定L-氨基酸的方法?？赏ㄟ^Spakdman等描述的方法進行分析(分析化學(xué)，30,(1958),1190)、陰離子交換柱后用茚三酮衍生法或用Lindroth等描述的反向柱HPLC法進行分析(分析化學(xué)(1979)511167-1174)。本發(fā)明在下文中通過具體方案進行詳細(xì)描述。實施例1來自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸斓闹苽渫ㄟ^Tauch等描述的方法(1995，質(zhì)粒33168-179)分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ部分切割(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情Sau3AⅠ，編號27-0913-02)。用蝦堿性磷酸酶將DNA片段去磷酸化(RocheMolecularBiochemicals，曼海姆，德國，產(chǎn)品詳情SAP，編號1758250)。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情XbaⅠ，編號27-0948-04)切割來自Stratagene(LaJolla,USA,產(chǎn)品詳情SuperCosl粘粒載體試劑盒，編號251301)的粘粒載體SuperCosl的DNA(Wahl等(1987)美國國家科學(xué)院進展，USA842160-2164)并同法用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。然后用限制性內(nèi)切酶BamHl(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情BamHⅠ，編號27-0868-04)切割粘粒-DNA。將如此處理的粘粒-DNA和處理的ATCC13032-DNA混合再用T4-DNA-連接酶處理(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情，編號27-1870-04)。用GigapackⅡXL包裝抽提物在噬菌體中包裝此連接混合物(Stratagene,LaJolla，美國，產(chǎn)品詳情GigapackⅡX1包裝抽提物，貨號200217)。將大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)細(xì)胞收集于10mMMgSO4中并與一份噬菌體懸液混合以達(dá)到轉(zhuǎn)染。按Sambrook等描述的方法(1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)進行粘粒文庫的轉(zhuǎn)染和滴定，細(xì)胞涂于含100μg/ml氨芐的LB-瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1190)上。37℃培養(yǎng)過夜后篩選重組克隆。實施例2基因sucC和sucD的分離和測序根據(jù)廠商說明用QiaprepSpinMiniprep試劑盒(貨號為27106,Qiagen,Hilden，德國)分離單克隆的粘粒DNA并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情Sau3AⅠ，貨號為27-0913-02)部分切割。用蝦堿性磷酸酶將DNA片段去磷酸化(RocheMolecularBiochemicals，曼海姆，德國，產(chǎn)品詳情SAP，貨號為1758250)。凝膠分離后用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(貨號為20021,Qiagen,Hilden，德國)分離出大小在區(qū)段1500到2000bp的粘粒片段。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品詳情BamHⅠ，貨號為27-0868-04)切割來自Invitrogen(Groningen,Niederlande，產(chǎn)品詳情Zero背景克隆試劑盒，貨號為K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA。按Sambrook等所述的方法(1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)進行粘粒片段與測序載體pZero-1的連接，T4連接酶(PharmaciaBiotech,Freiburg，德國)與DNA混合物孵育過夜。連接混合物電轉(zhuǎn)于大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美國國家科學(xué)院進展，874645-4649)(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)中并涂于含50ug/mlzeocin的LB-瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1190)上。用Biorobot9600(貨號為900200,Qiagen,Hilden，德國)進行重組克隆的質(zhì)粒制備。根據(jù)Zimmermann等(1990，核酸研究，181067)改良的Sanger等的雙脫氧鏈終止法(1977，美國國家科學(xué)院進展，745463-5467)進行測序。應(yīng)用PE應(yīng)用生物系統(tǒng)(貨號為403044,Weiterstadt，德國)的RRdRhodamin終止循環(huán)測序試劑盒。用rotiphoresisNF丙烯酰氨/雙丙烯酰氨膠(29∶1)(貨號為A124.1,Roth,Karlsruhe，德國)和PE應(yīng)用生物系統(tǒng)“ABIPrism377”測序設(shè)備(Weiterstadt，德國)進行凝膠電泳分離和分析。利用97-0版的Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)處理得到粗序列數(shù)據(jù)。將pZerol衍生物的單個序列集合成比鄰的疊連群。編碼區(qū)的計算機輔助分析通過XNIP程序進行(Staden,1986，核酸研究，14217-231)。對照國家生物技術(shù)信息中心的無盈余數(shù)據(jù)庫，使用BLAST研究程序(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)進行進一步分析。獲得的核苷序列如SEQIDNo.1中所示。核苷序列分析顯示有一個1206堿基對的開放閱讀框，鑒定為sucC基因，和一個882堿基對的開放閱讀框，鑒定是sucD基因。sucC基因編碼402個氨基酸的多肽，如SEQIDNo.2所示。sucD基因編碼294個氨基酸的多肽，如SEQIDNo.3所示。實施例33.1用于sucC基因整合誘變的整合載體的制備染色體DNA是按照Eikmanns等人的方法，從ATCC13032菌株中分離制備的(微生物學(xué)，1994,1401817-1828)。根據(jù)實施例1中谷氨酸棒桿菌的sucC基因序列，用下述的寡核苷酸進行PCR(多聚酶鏈反應(yīng))sucC-in15′CGCGCGAATCGTTCGTAT3′sucC-in25′CGCCACCAATGTCTAGGA3′上述引物可用MWGBiotechPCR儀進行合成(德國的埃伯堡)，而PCR反應(yīng)所使用的酶為Pwo聚合酶，購自寶靈曼公司(德國，產(chǎn)品詳情Pwo聚合酶，產(chǎn)品編號No.1644947)，PCR操作按照Innis等人的方法進行(PCR操作指南，PCR方法和應(yīng)用指南，1990，科學(xué)院出版社)。通過PCR反應(yīng)，可以擴增長度為0.55kb的sucC基因內(nèi)部片段。PCR產(chǎn)物可通過0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。應(yīng)用購自Invitrogen公司(美國加州Carlsbad；貨號為K2700-20)的ZeroBluntTM試劑盒，將擴增后的DNA片段連接到pCRBluntⅡ載體中(Bemard，等，分子生物學(xué)雜志，1993,234534-541)。對大腸桿菌的TOP10菌株電穿孔，再進行連接反應(yīng)(Hanahan，見DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓，美國，1985)。在LB培養(yǎng)板上篩選攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(Sambrook，等，分子克隆--實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，培養(yǎng)基中添加濃度為25mg/l的卡那霉素。使用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAprep旋轉(zhuǎn)微量制備試劑盒，從轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度為0.8％)鑒定。該質(zhì)粒命名為pCRBluntsucCint，如圖1所示。sucD基因的缺失首先采用Tauch等人的方法(質(zhì)粒，1995,33168-179)，從ATCC13032菌株中分離染色體DNA。根據(jù)實施例2所述的谷氨酸棒桿菌的sucD基因序列，下文所列出的寡核苷酸用于篩選sucD缺失等位基因。sucD-d15′-CGATGTGATTGCGCTTGATG-3′sucD-d25′-ACCTCACGCATAAGCTTCGCATGCTCTGAACCTTCCGAAC-3′sucD-d35′-GTTCGGAAGGTTCAGAGCATGCGAAGCTTATGCGTGAGGT-3′sucD-d45′-ATGAAGCCAGCGACTGCAGA-3′相關(guān)的引物由MWGBiotech進行合成(德國的Ebersberg),PCR反應(yīng)所使用的酶為Pfu聚合酶(Stratagene，產(chǎn)品編號600135,LaJolla，美國)，儀器為PTC100-熱循環(huán)儀(MJ研究公司，Waltham，美國)。借助PCR反應(yīng)，引物可以擴增內(nèi)部缺失的sucD等位基因。PCR產(chǎn)物可以通過0.8％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，還可應(yīng)用Sanger等人的方法進行測序(美國科學(xué)院研究進展，1977,745463-5467)。實施例44.1DSM5715菌株sucD基因的整合誘變按照Tauch等人的電穿孔法(FEMS微生物學(xué)通信，1994,123343-347)，實施例3中的質(zhì)粒pCRBluntsucCint，電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒桿菌的DSM5715菌株中。DSM5715菌株為AEC抗性L-賴氨酸生產(chǎn)菌。由于載體pCRblunt-sucCint不能在DSM5715中自行復(fù)制，所以如果該質(zhì)粒整合到DSM5715的基因組中，它只停留在纖維素中。將電轉(zhuǎn)后的樣本涂布在LB瓊脂板上，進行篩選pCRBluntsucCint整合到染色體的克隆(Sambrook，等，分子克隆--實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，培養(yǎng)基中添加濃度為15mg/l的卡那霉素。為了檢測質(zhì)粒的整合，使用寶靈曼GmbH“地高辛體系濾膜雜交法使用指南”中所述的方法(德國曼海姆)，應(yīng)用寶靈曼公司生產(chǎn)的地高辛雜交試劑盒，對sucCint片段進行標(biāo)記。按照Eikmanns等人的方法(微生物學(xué)，1994,1401817-1828)，分離可能整合菌株的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和HindⅢ進行酶切。用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，用寶靈曼公司生產(chǎn)的地高辛雜交試劑盒，在68℃下進行雜交。實施例3中的質(zhì)粒pCRBluntsucCint自身插到DSM5715的染色體的sucC基因中。該菌株鑒別為DSM5715pCRBluntsucCint。4.2交換載體pK18mobsacBsucDdel的構(gòu)建實施例3.2中的sucD缺失型衍生物是在使用Qiagenquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Hilden，德國)，用0.8％的瓊脂糖凝膠進行分離，然后再用可移動的克隆載體pK18mobsacB(Schafer，等，基因，1994,1469-73)進行連接。在這之前，用限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和XbaⅠ對該載體進行酶切，并與sucD缺失的等位基因混合，然后用T4DNA連接酶(AmershamPharmacia，弗雷堡，德國)連接。用連接混合物對大腸桿菌DH5αmcr(Grant，等，美國科學(xué)院研究進展，1990,874645-4649)進行電穿孔(Hanahan，見DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，冷泉港，紐約，1989)。用LB瓊脂培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，篩出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook，等，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，培養(yǎng)基中添加濃度為25mg/l的卡那霉素。用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAprep旋轉(zhuǎn)微量制備試劑盒，從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，克隆的sucD缺失的等位基因由MWGBiotech(Ebersberg，德國)進行測序而證實。該質(zhì)粒命名為pK18mobsacBsucDdel。該菌株稱為DH5αmcr/pK18mobsacBsucDdel.4.3對谷氨酸棒桿菌DSM5715菌株中sucD基因的缺失誘變按照Tauch等人所介紹的電穿孔法(FEMS微生物學(xué)通信，1994，123343-347)，對實施例4.2中的pK18mobsacBsucDdel載體進行電轉(zhuǎn)。該載體不能在DSM5715中自行復(fù)制，結(jié)果整合在染色體中的質(zhì)粒只能存在于纖維素中。通過將電轉(zhuǎn)后標(biāo)本涂布在LB瓊脂板上，進行篩選整合有pK18mobsacBsucDdel的克隆(Sambrook，等，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，培養(yǎng)基中添加濃度為15mg/l的卡那霉素。生長出的克隆在卡那霉素濃度為25mg/l的LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)，33℃，16小時。為了使質(zhì)粒和染色體中完整的sucD基因一起切下，克隆還要在含10％蔗糖的LB瓊脂中生長。pK18mobsacBsucDdel質(zhì)粒含有一拷貝的sacB基因，后者可以把蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)閷劝彼岚魲U菌無毒性的左旋蔗糖酶。只有整合的pK18mobsacBsucDdel質(zhì)粒被切除的克隆，才可以在含有蔗糖的LB瓊脂上生長。sucD基因的完整染色體拷貝或伴有內(nèi)部缺失的不完整拷貝可與質(zhì)粒一起被切除。為了檢測不完整的sucD基因是否還殘留在染色體中，按照寶靈曼GmbH出版的“地高辛體系濾膜雜交法使用指南”一書中所述的方法(德國曼海姆，1993)，應(yīng)用寶靈曼公司生產(chǎn)的地高辛雜交試劑盒，標(biāo)記pK18mobsacBsucDdel質(zhì)粒片段。按照Eikmanns等人的方法(微生物學(xué)，1994,1401817-1828)，分離可能缺失突變體的染色體DNA，分別用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和PstⅠ進行酶切。酶切片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并在68℃下用寶靈曼公司的地高辛雜交試劑盒進行雜交。根據(jù)片段所顯示的結(jié)果，DSM5715菌株的sucD基因拷貝完全喪失，相反，僅缺失的拷貝還一直存在。該菌株稱為谷氨酸棒桿菌DSM5715ΔsucD。實施例5應(yīng)用菌株DSM5715pCRBluntsucCint生產(chǎn)L-谷氨酸用合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)實施例4.1中谷氨酸棒桿菌株DSM5715pCRBluntsucCint，生產(chǎn)L-谷氨酸，并測定培養(yǎng)基上清中的谷氨酸的濃度。為了生產(chǎn)谷氨酸，首先將該菌株接種在含相應(yīng)抗生素的瓊脂板上，33℃，24小時(卡那霉素濃度為25mg/l的腦心瓊脂)。挑取瓊脂平板上的菌落接種預(yù)培養(yǎng)基(100毫升的三角燒瓶中加10毫升培養(yǎng)基)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為CgⅢ完全培養(yǎng)基。CgⅢ培養(yǎng)基NaCl2.5g/lBacto-肽胨10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)2％(W/V)pH值調(diào)至7.4在該培養(yǎng)基中添加卡那霉素(25mg/l)。將預(yù)培養(yǎng)物在搖瓶中進行搖蕩，240轉(zhuǎn)/分，33℃，16小時。將預(yù)培養(yǎng)物接種在主培養(yǎng)基中，使主培養(yǎng)基的初始光密度(OD)為0.1OD(波長為660nm)。MM培養(yǎng)基用于主培養(yǎng)。MM培養(yǎng)基CSL(玉米浸液)5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)50g/l鹽類(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾除菌)0.3mg/l鹽酸硫胺素(過濾除菌)0.2mg/l延胡索酸(過濾除菌)5.81g/l亮氨酸(過濾除菌)0.1g/lCaCO325g/lCSL，MOPS與鹽溶液用氨水調(diào)至pH值為7，再進行高壓滅菌。然后再加入滅菌后的底物和維生素類溶液，以及干態(tài)滅菌的CaCO3。10毫升的培養(yǎng)基在100毫升帶擋板的燒瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入濃度為25mg/l的卡那霉素。在溫度為33℃，濕度為80％的條件下培養(yǎng)。24小時后，用Biomek1000(貝克曼儀器GmbH，慕尼黑)測定培養(yǎng)液的光密度值，波長為660nm。所生成的谷氨酸可以用Eppendorf-BioTronik(漢堡，德國)氨基酸分析儀，經(jīng)離子交換層析，以及茚三酮檢測，可對過柱后的分離物進行定量。表1所示為檢測結(jié)果。表1<tablesid="table1"num="001"><table>菌株OD值(660nm)L-谷氨酸mg/lDSM571510.420DSM5715pCRBluntsucCint3.9154</table></tables>5.1使用DSM5715ΔsucD菌株生產(chǎn)L-谷氨酸在適合產(chǎn)L-谷氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中對實施例4.3中的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pK18mobsacBsucDdel進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液上請中谷氨酸的含量。為了上述目的，首先將該菌株在瓊脂板上孵育24小時上，33℃。然后將瓊脂板上的菌落接種在這種瓊脂培養(yǎng)基上(100毫升的三角燒瓶中含有10毫升的培養(yǎng)基)。全營養(yǎng)培養(yǎng)基CgⅢ用于預(yù)培養(yǎng)。并在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，濃度為25mg/l。將預(yù)培養(yǎng)物在搖瓶中進行搖蕩，240轉(zhuǎn)/分，33℃,16小時。對從預(yù)培養(yǎng)物所獲得的主要培養(yǎng)物進行接種，結(jié)果主培養(yǎng)物的光密度為0.1OD(波長為660nm)。MM培養(yǎng)基用于主培養(yǎng)。培養(yǎng)在含有10毫升的培養(yǎng)基的帶擋板的100毫升搖瓶中進行。培養(yǎng)溫度為33℃，濕度為80％。72小時后，用Biomek1000(貝克曼儀器GmbH公司，慕尼黑)測定培養(yǎng)液的光密度值，波長為660nm。所生成的谷氨酸可以用Eppendorf-BioTronik(漢堡，德國)氨基酸分析儀，經(jīng)離子交換層析，茚三酮檢測，對過柱分離物進行定量。表2為檢測結(jié)果。表2以下為本發(fā)明的附圖圖1pCRBluntsucCint質(zhì)粒圖譜。以下為所使用術(shù)語和縮寫的含義。KmR卡那霉素抗性基因ZeocinZeocine抗性基因HindⅢ限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切位點SphⅠ限制性內(nèi)切酶SphⅠ的酶切位點EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切位點sucCintsucC基因內(nèi)部片段ColE1ori質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起點圖2pK18mobsacBsucDdel質(zhì)粒圖譜所使用的術(shù)語和縮寫的意思如下。oriV類似ColE1的pMB1的復(fù)制起點sacB編碼左旋蔗糖酶的sacB基因RP4mobRP4活動位點Kan卡那霉素抗性基因sucDdel谷氨酸棒桿菌的sucD缺失等位基因SphⅠ限制性內(nèi)切酶SphⅠ的酶切位點PstⅠ限制性內(nèi)切酶PstⅠ的酶切位點XmaⅠ限制性內(nèi)切酶XmaⅠ的酶切位點XbaⅠ限制性內(nèi)切酶XbaⅠ的酶切位點序列表&lt;110&gt;德古薩-于爾斯股份公司&lt;120&gt;編碼基因sucC和sucD的新核苷酸序列&lt;130&gt;990171BT&lt;140&gt;&lt;141&gt;&lt;160&gt;3&lt;170&gt;PatentInVer.2.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;2410&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(142)..(1347)&lt;223&gt;sucC&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(1372)..(2253)&lt;223&gt;sucD&lt;400&gt;1gcaccacggatccaattttgttgcaatttgcaaagtttacagtgttagacttcacaatac60gatcatattggtgagttgaaacacttacttttacgggaagactttgttaaagacgcagaa120ggct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lt;400&gt;2MetGluLeuAlaValAspLeuPheGluTyrGlnAlaArgAspLeuPhe151015GluThrHisGlyValProValLeuLysGlyIleValAlaSerThrPro202530GluAlaAlaArgLysAlaAlaGluGluIleGlyGlyLeuThrValVal354045LysAlaGlnValLysValGlyGlyArgGlyLysAlaGlyGlyValArg505560ValAlaProThrSerAlaGlnAlaPheAspAlaAlaAspAlaIleLeu65707580GlyMetAspIleLysGlyHisThrValAsnGlnValMetValAlaGln859095GlyAlaAspIleAlaGluGluTyrTyrPheSerIleLeuLeuAspArg100105110AlaAsnArgSerTyrLeuAlaMetCysSerValGluGlyGlyMetGlu115120125IleGluIleLeuAlaLysGluLysProGluAlaLeuAlaLysValGlu130135140ValAspProLeuThrGlyIleAspGluAspLysAlaArgGluIleVal145150155160ThrAlaAlaGlyPheGluThrGluValAlaGluLysValIleProVal165170175LeuIleLysIleTrpGlnValTyrTyrGluGluGluAlaThrLeuVal180185190GluValAsnProLeuValLeuThrAspAspGlyAspValIleAlaLeu195200205AspGlyLysIleThrLeuAspAspAsnAlaAspPheArgHisAspAsn210215220ArgGlyAlaLeuAlaGluSerAlaGlyGlyLeuAspIleLeuGluLeu225230235240LysAlaLysLysAsnAspLeuAsnTyrValLysLeuAspGlySerVal245250255GlyIleIleGlyAsnGlyAlaGlyLeuValMetSerThrLeuAspIle260265270ValAlaAlaAlaGlyGluArgHisGlyGlyGlnArgProAlaAsnPhe275280285LeuAspIleGlyGlyGlyAlaSerAlaGluSerMetAlaAlaGlyLeu290295300AspValIleLeuGlyAspSerGlnValArgSerValPheValAsnVal305310315320PheGlyGlyIleThrAlaCysAspValValAlaLysGlyIleValGly325330335AlaLeuAspValLeuGlyAspGlnAlaThrLysProLeuValValArg340345350LeuAspGlyAsnAsnValValGluGlyArgArgIleLeuAlaGluTyr355360365AsnHisProLeuValThrValValGluGlyMetAspAlaAlaAlaAsp370375380HisAlaAlaHisLeuAlaAsnLeuAlaGlnHisGlyGlnPheAlaThr385390395400AlaAsn&lt;210&gt;3&lt;211&gt;294&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;400&gt;3MetSerIlePheLeuAsnSerAspSerArgIleIleIleGlnGlyIle151015ThrGlySerGluGlySerGluHisAlaArgArgIleLeuAlaSerGly202530AlaLysLeuValGlyGlyThrAsnProArgLysAlaGlyGlnThrIle354045LeuIleAsnAspThrGluLeuProValPheGlyThrValLysGluAla505560MetGluGluThrGlyAlaAspValThrValIlePheValProProAla65707580PheAlaLysAlaAlaIleIleGluAlaIleAspAlaHisIleProLeu859095CysValIleIleThrGluGlyIleProValArgAspAlaSerGluAla100105110TrpAlaTyrAlaLysLysValGlyHisThrArgIleIleGlyProAsn115120125CysProGlyIleIleThrProGlyGluSerLeuAlaGlyIleThrPro130135140AlaAsnIleAlaGlySerGlyProIleGlyLeuIleSerLysSerGly145150155160ThrLeuThrTyrGlnMetMetTyrGluLeuSerAspIleGlyIleSer165170175ThrAlaIleGlyIleGlyGlyAspProIleIleGlyThrThrHisIle180185190AspAlaLeuGluAlaPheGluAlaAspProGluThrLysAlaIleVal195200205MetIleGlyGluIleGlyGlyAspAlaGluGluArgAlaAlaAspPhe210215220IleSerLysHisValThrLysProValValGlyTyrValAlaGlyPhe225230235240ThrAlaProGluGlyLysThrMetGlyHisAlaGlyAlaIleValThr245250255GlySerGluGlyThrAlaArgAlaLysLysHisAlaLeuGluAlaVal260265270GlyValArgValGlyThrThrProSerGluThrAlaLysLeuMetArg275280285GluValValAlaAlaLeu290權(quán)利要求1．含有編碼sucC基因和/或sucD基因的的多核苷酸序列的分離的多核苷酸，其選自如下一組a)與編碼含SEQIDNo.2所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸，b)與編碼含SEQIDNo.3所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸，c)編碼含有與SEQIDNo.2氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，d)編碼含有與SEQIDNo.3氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，e)與a)、b)、c)或d)互補的多核苷酸，及，f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，該多肽序列優(yōu)選地具有琥珀酰輔酶A合成酶的活性。2．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸優(yōu)選地是重組的可在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的DNA。3．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。4．如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，含有SEQIDNo.1所示的核酸序列。5．如權(quán)利要求2所述的可復(fù)制的DNA，其含有(ⅰ)SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或者(ⅱ)至少一個在遺傳密碼子簡并性范圍內(nèi)基于序列(ⅰ)的序列，或(ⅲ)至少一個可與序列(ⅰ)或(ⅱ)的互補序列相雜交的序列，以及任選地(ⅳ)(ⅰ)的功能性中性有義突變。6．如權(quán)利要求5所述的可復(fù)制的DNA，其中雜交是在相當(dāng)于最大2×SSC的嚴(yán)格條件下進行。7．如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼含有SEQIDNo2所示的氨基酸序列的多肽。8．棒狀細(xì)菌，其sucC基因和/或sucD基因是弱化的。9．生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和/或L-谷氨酸的方法，其中進行下列步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需的L-氨基酸的細(xì)菌，該細(xì)菌中首先sucC基因和/或sucD基因或者其編碼核苷酸序列是弱化的，尤其是關(guān)閉的；b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中富集L-氨基酸，并c)分離L-氨基酸。10．如權(quán)利要求9所述的方法，其中所用的細(xì)菌中所需的L-氨基酸的生物合成途徑的額外基因被增強。11．如權(quán)利要求9所述的方法，其中所用的細(xì)菌中降低所需的L-氨基酸的形成的代謝途徑被至少部分地關(guān)閉。12．如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼sucC基因和/或sucD基因的多核苷酸的表達(dá)被弱化，尤其是被關(guān)閉。13．如權(quán)利要求9所述的方法，其中多核苷酸sucC和sucD編碼的多肽(酶蛋白)的催化特性被降低。14．如權(quán)利要求9所述的方法，其中為了生產(chǎn)L-氨基酸，發(fā)酵如下的微生物，該微生物中，選自下列一組中的一個或多個基因被同時增強和/或過表達(dá)14.1．編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，14.2．編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，14.3．編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的gap基因，14.4．編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因，14.5．編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因，14.6．編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，14.7．編碼L-賴氨酸輸出蛋白的lysE基因，14.8．編碼反饋抑制天冬氨酸激酶的lysC基因，14.9．編碼Zwal-蛋白的zwal基因。15．如權(quán)利要求9所述的方法，其中為了生產(chǎn)L-氨基酸，發(fā)酵如下棒狀細(xì)菌微生物，該微生物中，選自下列一組中的一個或多個基因同時被弱化15.1．編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，15.2．編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，15.3．編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，15.4．編碼Zwa2-蛋白的zwa2基因。16．含有一個載體的棒狀細(xì)菌，其中該載體帶有如權(quán)利要求1所述多核苷酸的部分、至少是所述序列中的15個連續(xù)的核苷酸。17．如前述一或多項權(quán)利要求的方法，其中所利用的微生物是谷氨酸棒桿菌。18．檢測RNA,cDNA和DNA，以分離編碼琥珀酰輔酶A合成酶或者具有與sucC基因和/或sucD基因的序列具有高度相似性的核酸和/或多核苷酸或基因的方法，其中將含有如權(quán)利要求1、2、3或4所述的多核苷酸序列的多核苷酸用作雜交探針。全文摘要本發(fā)明涉及含有編碼sucC基因和sucD基因的多核苷酸序列的多核苷酸,其選自:a)與編碼含SEQIDNo.2所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70%相同性的多核苷酸,b)與編碼含SEQIDNo.3所述氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少70%相同性的多核苷酸,c)編碼所含序列與SEQIDNo.2氨基酸序列具有至少70%相同性的多肽的多核苷酸,d)編碼所含序列與SEQIDNo.3氨基酸序列具有至少70%相同性的多肽的多核苷酸,e)與a)、b)、c)或d)互補的多核苷酸,及,f)含多核苷酸序列a)、b)、c)、d)或e)的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用所述基因以弱化形式存在的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法,以及所述多核苷酸用作雜交探針的用途。文檔編號C12R1/15GK1298019SQ00132540公開日2001年6月6日申請日期2000年11月24日優(yōu)先權(quán)日1999年11月25日發(fā)明者貝蒂娜·默克爾,瓦爾特·普費弗勒,阿希姆·馬克思申請人:德古薩－于爾斯股份公司