專利名稱：用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-蘇氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中g(shù)lyA基因是弱化的。
L-氨基酸用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，人用藥物及制藥工業(yè)。
已知氨基酸可通過(guò)棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過(guò)離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法。以此方式獲得對(duì)抗代謝產(chǎn)物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性，或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如蘇氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也用于谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良，其通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)氨基酸生物合成基因，并研究其對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。此方面的綜述文章見(jiàn)Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，Benjamin Cummings,英國(guó)倫敦，1985,115-142),Hilliger(生物技術(shù)2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技術(shù)的關(guān)鍵回顧15,73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)782,25-39(1996))。
本發(fā)明目的在于為改良用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法提供新措施。
L-氨基酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。因而提供生產(chǎn)L-氨基酸的新改良方法總是令人感興趣的。
下文提及L-氨基酸時(shí)，指L-蘇氨酸或L-異亮氨酸。
本發(fā)明提供了一種用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，此棒狀細(xì)菌中至少編碼glyA基因產(chǎn)物的核苷酸序列(glyA基因)是弱化的，尤其低水平表達(dá)，所需產(chǎn)物在培養(yǎng)基或細(xì)胞中濃縮，并分離L-氨基酸。
所用菌株優(yōu)選在glyA基因弱化之前已產(chǎn)生L-氨基酸。
優(yōu)選的實(shí)施方案見(jiàn)于權(quán)利要求。
術(shù)語(yǔ)“弱化”是指微生物中由相應(yīng)DNA(在此為glyA基因)編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))胞內(nèi)活性的降低或消除，例如通過(guò)用弱啟動(dòng)子，或用編碼低活性酶(蛋白質(zhì))的基因或等位基因，或失活相應(yīng)基因或酶，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生的可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜，淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸。此微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌體，例如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649
黃色短桿菌BB69黃色短桿菌DSM5399乳發(fā)酵短桿菌FERM-BP269乳發(fā)酵短桿菌TBB-10和例如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871技術(shù)人員已發(fā)現(xiàn)在glyA基因弱化之后，棒狀細(xì)菌以改良生產(chǎn)L-氨基酸。
glyA基因編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.2.1)。glyA基因的核苷酸序列已由日本特許公開(kāi)JP-A-08107788闡述。根據(jù)本發(fā)明可使用該參考文獻(xiàn)闡述的glyA基因。另外還可使用得自遺碼密碼的簡(jiǎn)并，或中性功能的有義突變的glyA基因的等位基因。
為獲得弱化，可降低或消除glyA基因的表達(dá)或基因產(chǎn)物的催化性質(zhì)?？扇芜x組合這二種措施。
通過(guò)對(duì)基因表達(dá)信號(hào)結(jié)構(gòu)的遺傳修飾(突變)或通過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)可降低基因表達(dá)?；虮磉_(dá)的信號(hào)結(jié)構(gòu)例如是阻抑物基因，激活物基因，操縱子，啟動(dòng)子，弱化子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，起始密碼子及終止子。本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對(duì)此的詳述，參見(jiàn)如專利申請(qǐng)WO96/15246,Boyd和Murphy(細(xì)菌學(xué)雜志170:5949(1988)),Voskuil和Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程學(xué)58:191(1998)),Patek等(微生物學(xué)142:1297(1996))及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材，如由Knippers所著教材(分子遺傳學(xué)，第6卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart,德國(guó)，1995)或由Winnacker所著教材(基因與克隆，VCH Verlagsgeselschaft,Weinheim,德國(guó)，1990)。
現(xiàn)有技術(shù)已知導(dǎo)致酶蛋白催化性質(zhì)改變或降低的突變，可提及的例如Qiu和Goodman(生物化學(xué)雜志272:8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科學(xué)生物技術(shù)及生物化學(xué)61:1760-1762(1997))，及Mockel(谷氨酸棒桿菌的蘇氨酸脫水酶刪除酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)，Julich研究中心報(bào)告，Jul-2906,ISSN09442952,Julich,德國(guó)，1994)。在遺傳及分子生物學(xué)的已知教材例如由Hagemann所著教材(普通遺傳學(xué)，Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)中可發(fā)現(xiàn)相關(guān)綜述。
可能的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失。依于氨基酸置換對(duì)酶活性的影響，指作錯(cuò)義突變或無(wú)義突變?；蛑兄辽僖粋€(gè)堿基對(duì)的插入或缺失導(dǎo)致移碼突變，這是由于不正確氨基酸被摻入或翻譯被過(guò)早中斷。一些密碼子的缺失典型地導(dǎo)致酶活性的完全喪失。目前已知這種突變產(chǎn)生的方法，并可見(jiàn)于已知遺傳及分子生物學(xué)的教材，例如由Knippers所著教材(分子遺傳，第6卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart,德國(guó)，1995),由Winnacker所著教材(基因與克隆，VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim,德國(guó)，1990)或由Hagemann所著教材(普通遺傳學(xué)，Gustav Fischer Verlag,Stutgart,1986)。
例如，glyA基因的弱化可通過(guò)除去天然啟動(dòng)子并插入位于上游的可調(diào)節(jié)控制元件而進(jìn)行。lacⅠ-tac系統(tǒng)被用作控制元件。為將lacⅠ-tac系統(tǒng)摻入染色體glyA基因的上游，制備整合質(zhì)粒pK18mobglyA’(
圖1)。質(zhì)粒pKl8mobglyA’含有tac啟動(dòng)子(Amann等，基因25:167-178(1983)；De Boer等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)80:21-25(1983))，和位于tac啟動(dòng)子直接下游的SEQ ID NO:1所示的glyA基因5’末端序列。此質(zhì)粒還含有編碼Lac抑制物的lacⅠ基因(Farabaugh，自然274:765-769(1978):Stark等，基因51:255-267(1987))。lacⅠ-tac-5’glyA單元的序列示作SEQ ID NO:2。質(zhì)粒pKl8mobglyA’能在大腸桿菌而不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。轉(zhuǎn)化及通過(guò)實(shí)現(xiàn)整合的“交換”事件而同源重組之后，可以獲得glyA基因的完整拷貝，其表達(dá)可由上游lacⅠ-tac控制元件控制和調(diào)節(jié)，及獲得在3’末端截短的包括天然啟動(dòng)子的glyA基因的失活拷貝。lacⅠ-tac-glyA單元的序列示作SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4示出已知glyA基因產(chǎn)物的氨基酸序列。通過(guò)加入適當(dāng)濃度的乳糖類似物異丙基硫代半乳糖苷(Furste等，基因48:119-131(1986)),glyA基因的表達(dá)可被控制，或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞含量可被弱化或調(diào)節(jié)。
其它關(guān)于整合誘變的闡述例如見(jiàn)于Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)學(xué)9,84-87(1991)),Peters-Wendish等(微生物學(xué)144,915-927(1998))或Fitzpatrick等(應(yīng)用微生物學(xué)生物工程42,575-580,(1994))。
具有弱化的glyA基因的棒狀細(xì)菌的生產(chǎn)氨基酸的菌株例如是生產(chǎn)蘇氨酸的黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’。
另外，除弱化glyA基因之外，擴(kuò)增特定生物合成途徑，糖酵解，回補(bǔ)代謝，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶，對(duì)氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。
這樣，例如為制備L-蘇氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學(xué)2,63-72(1988))或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等,基因107,53-59(1991)),和/或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns等，細(xì)菌學(xué)雜志174:6076-6086(1992))，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144:915-927(1998))，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學(xué)雜志254,395-403(1988))，或·編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因(DE 19941478.5；DSM 12840)可以同時(shí)過(guò)表達(dá)。
為生產(chǎn)氨基酸，除glyA基因之外，同時(shí)弱化
·編碼烯醇丙酮酸磷酶羧激酶的pck基因(DE 19950409.1,DSM13047)和/或·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE 19951975.7；DSM 13114)也可以是有益的。
最后，除弱化glyA基因之外，排除非所需二級(jí)反應(yīng)對(duì)氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama:“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過(guò)量產(chǎn)生，Krumphahzl,Sikyta,Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國(guó)，1982)。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見(jiàn)于美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)”(華盛頓特區(qū)，美國(guó)，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿?，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。所述起始物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣如空氣，可充入培養(yǎng)基中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃-45℃，優(yōu)選25℃-40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至氨基酸形成最大量。此目的通常在10-160小時(shí)范圍達(dá)到。
本領(lǐng)域目前已知確定L-氨基酸的方法?？扇鏢packman等所述(分析化學(xué)30(1958),1190)通過(guò)陰離子交換層析，隨后茚三酮衍生化作用進(jìn)行分析，或通過(guò)例如由Lindroth等(分析化學(xué)(1979)51:1167-1174)所述的反相HPLC進(jìn)行分析。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國(guó))·大腸桿菌DH5αmcr/pK18mobgly A’，保藏號(hào)DSM 13170。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳細(xì)闡述。
通過(guò)Sambrook等所述方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)Cold SpringHarbour Laboratory Press)，進(jìn)行從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA，及所有限制消化，Klenow及蝦堿性磷酶處理。除非另外闡述，通過(guò)Chung等方法進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1989)86:2172-2175)。
實(shí)施例1谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的glyA基因的克隆與測(cè)序?qū)lyA基因克隆入大腸桿菌克隆載體pUC18(Norrander等，基因(1983)26:101-106,Roche Diagnostics，德國(guó)曼海姆)中。以兩步進(jìn)行克隆。首先用衍生自日本特許公開(kāi)JP-A-08107788的以下寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增谷氨酸棒桿菌ATCC13032的該基因。
glyA1-正向5’-GCT TGC AGC GTT TTG CTC TGC C-3’glyA-反向5’-ACC CGT AAC CTC TTC CAC ATA GG-3’在存在200μM三磷酸脫氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)情況下，將PCR進(jìn)行30循環(huán)，在Themo循環(huán)儀(PTC-100,MJ Research公司，Watertown,美國(guó))中，以如下條件94℃30秒，64℃1分鐘，68℃3分鐘進(jìn)行循環(huán)。每種情況下反應(yīng)物為1μM相應(yīng)寡核苷酸，100ng谷氨酸棒桿菌ATCC13032染色體DNA，1/10體積的10倍反應(yīng)緩沖液和2.6單位熱穩(wěn)定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand HighFidelity PCR System from Roche Diagnostics，德國(guó)曼海姆)。
然后將大約1.7kb大小的擴(kuò)增的片段，借助于SureClone連接試劑盒(Amersham Phamacia Biotech,Uppsala,Sweden)根據(jù)廠商指導(dǎo)連于載體pUC18的SmaⅠ切割位點(diǎn)。用全部連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αmcr(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1990)87:4645-4649)。根據(jù)其在含50μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板上對(duì)羧芐青霉素抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從7個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析檢測(cè)作為插入體的1.7kb的PCR片段的存在與否。以此方式形成的重組質(zhì)粒在以下被稱為pUC18glyA。
質(zhì)粒pUC18glyA中的1.7kb的PCR片段的核苷酸序列通過(guò)Sanger等的二脫氧鏈終止法(美國(guó)科學(xué)院院(1977)74:5463-5467)進(jìn)行測(cè)定。為此，借助于以下引物對(duì)pUC18glyA的完整插入片段測(cè)序。
通用引物5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’反向引物5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3’所得核苷酸序列用Lasergene程序包(Biocomputing Software forWindows,DNASTAR,Madison,USA)進(jìn)行分析。分析結(jié)果鑒定出一長(zhǎng)度為1302bp的開(kāi)放讀框。相應(yīng)基因被稱為glyA基因。相關(guān)基因產(chǎn)物含有434個(gè)氨基酸，并以SEQ ID NO:4所示。
實(shí)施例2構(gòu)建降低glyA表達(dá)的載體用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和TfiⅠ，從實(shí)施例1中所述的質(zhì)粒pUC18glyA中酶切下大小為1418bp的DNA片段，該片段含有無(wú)自身啟動(dòng)子區(qū)域的glyA基因。用Klenow酶處理該片段的5’和3’末端。將所得DNA片段連于預(yù)先用BamHⅠ線性化的載體pVWEx2中。用Klenow酶處理并去磷酸化。(Wendish,谷氨酸棒桿菌的野生型菌株和重組菌株中，中心代謝途徑體內(nèi)活性的生理學(xué)及NMR光譜學(xué)分析，Julich研究中心報(bào)告，Jul-3397,ISSN09442952,Julich,德國(guó)，1997)，這樣glyA基因以相同方向直接位于載體tac啟動(dòng)子之后，該啟動(dòng)子可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。大腸桿菌DH5αmcr(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1990)87:4645-4649)用全部連接混合物轉(zhuǎn)化。通過(guò)在含有15μg/ml四環(huán)素的LB瓊脂平板上其對(duì)四環(huán)素抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從12個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析檢測(cè)相對(duì)于tac啟動(dòng)子以正確方向插入的1418bp的片段的存在與否。以此方式形成的重組質(zhì)粒在以下被稱為pVWEx2glyA。
然后利用以下寡核苷酸引物，通過(guò)PCR從質(zhì)粒pVWEx2glyA中擴(kuò)增一DNA片段，該片段含有tac啟動(dòng)子阻抑物基因lacⅠ,tac啟動(dòng)子和克隆的谷氨酸棒桿菌glyA基因頭438bp。
glyA2-正向(劃線處為附加的EcoRⅠ識(shí)別序列)5’-CCG GAA TTC TCA CTG CCC GCT TTC CAG TC-3’glyA2-反向(劃線處為附加的BamHⅠ識(shí)別序列)5’-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTC AAC-3’在存在200μM三磷酸脫氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)下將PCR進(jìn)行30循環(huán)，每次反應(yīng)物為1μM相應(yīng)寡核苷酸，100ngpVWEx2glyA的質(zhì)粒DNA,1/10體積的10倍反應(yīng)緩沖液及2.6單位的熱穩(wěn)定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand High Fidelity PCRSystem from Roche Diagnostics,德國(guó)曼海姆)，在Thermo循環(huán)儀(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,美國(guó))中以以下條件進(jìn)行94℃30秒，58℃30秒，72℃2分鐘。
隨后將大小大約為2.0kb的擴(kuò)增的片段用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，并用Macherey-Nagel公司(Duren,德國(guó))的NucleoSpin提取2合1試劑盒，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離，然后連于已用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并去磷酸化的載體pK18mob中(Schafer等，基因(1994)145:69-73)。大腸桿菌DH5αmcr(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(1990)87:4645-4649)用全部連接混合物轉(zhuǎn)化。通過(guò)在含50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上其對(duì)卡那霉素的抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從12個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析檢測(cè)作為插入體的2.0kb的PCR片段的存在與否。以此方式形成的重組質(zhì)粒在以下被稱為pK18mobglyA’(見(jiàn)
圖1)。
實(shí)施例3構(gòu)建具有降低的，可調(diào)節(jié)的glyA表達(dá)的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032::pK18mobglyA’通過(guò)電穿孔(Haynes等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)61:329-334)，將空白對(duì)照載體pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64:549-554)及實(shí)施例2所述質(zhì)粒pK18mobglyA’導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌野生型菌株ATCC13032(Abe等，普通及應(yīng)用微生物學(xué)(1967)13:279-301)。
在用pZ1轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)在含15μg/ml卡那霉素的LBHIS瓊脂平板(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)65:299-304)上其對(duì)卡那霉素的抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從3個(gè)轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析檢測(cè)pZ1空白對(duì)照載體的存在是否。以此方式形成對(duì)照菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pZ1。
在用pK18mobglyA’轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)glyA克隆的5’末端的同源重組，將質(zhì)粒整合入谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體中。將所得的卡那霉素抗性克隆在含15μg/ml卡那霉素和1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LBHIS瓊脂上鑒別(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)(1989)65:299-304)。利用以下寡核苷酸引物，通過(guò)PCR在2個(gè)所得整合突變體中檢測(cè)染色體中pK18mobglyA’的正確整合。
反向引物(RSP):5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3’glyA2-反向:5’-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTCAAC-3’在Thermo循環(huán)儀中(PTC-100，MJ研究公司，Watertown，美國(guó))，以下列條件94℃30秒，48℃30秒，72℃2分鐘，將PCR在存在200μM三磷酸脫氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)情況下進(jìn)行30循環(huán)，每次反應(yīng)物為1μM相應(yīng)寡核苷酸，100ng谷氨酸棒桿菌ATCC13032::pK18mobglyA’的染色體DNA,1/10體積的10倍反應(yīng)緩沖液及2.6單位熱穩(wěn)定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(ExpandHigh Fidelity PCR System from Roche Diagnostics,德國(guó)曼海姆)。以此方式形成谷氨酸棒桿菌ATCC13032::pK18mobglyA’,其中g(shù)lyA基因是在tac啟動(dòng)子控制下，該啟動(dòng)子可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。
實(shí)施例4檢測(cè)谷氨酸棒桿菌ATCC13032::pK18mobglyA’中由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性為獲得待檢測(cè)的由glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的粗制提取物，將實(shí)施例3中所述的谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pZ1和谷氨酸棒桿菌ATCC13032::pK18mobglyA’,在具有25μg/ml卡那霉素和100μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的100ml腦心浸液培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,USA)中，在30℃預(yù)培養(yǎng)14小時(shí)。然后用0.9％(w/v)氯化鈉溶液將細(xì)胞沖洗一次，并用此懸液接種100mlCgⅫ培養(yǎng)基，以使OD600(測(cè)量波長(zhǎng)為600nm的光密度)為0.5。此培養(yǎng)基與Keilhauer等所述培養(yǎng)基(細(xì)菌學(xué)雜志(1993)175:5593-5603)相同，但額外含有25μg/ml卡那霉素和0,10或100μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。Keilhauer等所述培養(yǎng)基組分見(jiàn)表1。
表1 CGⅫ培養(yǎng)基組分
在30℃培養(yǎng)這兩個(gè)菌株。10小時(shí)之后，用4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH緩沖液(PH7.0)將細(xì)胞沖洗一次，離心(用Heraeus,Osterode,德國(guó)的Minifuge RF,以每分鐘5000轉(zhuǎn)離心10分鐘)，并重懸浮于200mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH緩沖液(PH7.0)中，這樣終體積為5ml。向此細(xì)胞懸浮液加入50ul 2mM吡哆醛-5-磷酸溶液和50μl 100mM二硫蘇糖醇溶液，并將細(xì)胞破碎。通過(guò)超聲破碎器在0℃將細(xì)胞破碎(Branson Sonifier W-250,BransonSonic Power Co.,Danbury，美國(guó)；超聲時(shí)間6分鐘，脈沖長(zhǎng)100％，超聲強(qiáng)度2.5)。在超聲處理之后，離心分離出細(xì)胞碎片(在Sigma-Aldrich,Deisenhofen，德國(guó)的可冷卻Sigma 202MK離心機(jī)中，在4℃以13000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘)。上清液直接用作測(cè)定酶活性的無(wú)細(xì)胞粗提物。
無(wú)細(xì)胞粗提物中蛋白質(zhì)的測(cè)定通過(guò)Bensadoun和Weinstein的方法(分析生物化學(xué)(1976)70:241-250)經(jīng)分光光度法進(jìn)行。在此蛋白質(zhì)含量的測(cè)定通過(guò)用胎牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)描繪的校正曲線進(jìn)行。
為測(cè)定無(wú)細(xì)胞粗提物中絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性，使用非連續(xù)酶測(cè)試，其中從蘇氨酸底物形成的甘氮酸被定量。將以下組分的反應(yīng)物在37℃保溫15分鐘(根據(jù)Scrimgeour和Huennekens酶學(xué)方法(1962)，第5卷，838-843，學(xué)術(shù)出版社，加以修改)20mM蘇氨酸，200μM吡哆醛-5-磷酸，900μM四氫葉酸，100mM4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH緩沖液(PH7.0)和1.0-1.5mg蛋白質(zhì)(取自粗提物)，終體積為1ml。通過(guò)加入0.25體積25％(w/v)三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將混合物在0℃保溫15分鐘，并將變性蛋白質(zhì)離心除去(在Sigma-Aldrich,Deisenhofen，德國(guó)的冷凍Sigma 202MK離心機(jī)中，以13000轉(zhuǎn)/分在4℃離心15分鐘)。在酶測(cè)試中從底物生成的甘氨酸的定量測(cè)定通過(guò)反相HPLC(Lindroth等，分析化學(xué)(1979)51:1167-1174)進(jìn)行。使用與熒光檢測(cè)儀(G1321A)相連的HP1100系列的HPLC裝置(Hewlett-Packard，Waldbronn，德國(guó))，用HP-Chem-Station(Hewlett-Packard)控制系統(tǒng)并評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。將1μl被分析的氨基酸溶液與20μL正鄰苯二醛/2-巰基乙醇現(xiàn)成試劑(Pierce EuropeBV,Oud-Beijerland，荷蘭)在一自動(dòng)前置柱中混合而衍生化。將形成的熒光硫代異吲哚(Jones等，層析學(xué)雜志(1983)266:471-482)用升高的非極性相(甲醇)梯度程序從組合的前置柱(40×4mm Hyper silODS5)和主柱(Hypersil ODS 5，兩柱均得自CS-CheomatographieService GmbH,Langerwehe，德國(guó))中分離。極性洗脫液為乙酸鈉(0.1摩爾，PH7.2)；流速為每分鐘0.8ml。衍生的氨基酸的熒光檢測(cè)在激發(fā)波長(zhǎng)為230nm且發(fā)射波長(zhǎng)450nm時(shí)進(jìn)行。通過(guò)與外部標(biāo)準(zhǔn)及作為附加的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的天冬酰胺相對(duì)比，計(jì)算甘氨酸濃度。
用蘇氨酸作底物的酶測(cè)試結(jié)果列于表2。
表2
實(shí)施例5 構(gòu)建具有降低的可調(diào)節(jié)的glyA表達(dá)的黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’通過(guò)電穿孔(Haynes等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)61:329-334)，將實(shí)施例2所述的對(duì)照載體pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64:549-554)及質(zhì)粒pK18mobglyA’導(dǎo)入產(chǎn)生蘇氨酸的黃色短桿菌菌株DM368-2中。菌株DM368-2是在EP-B-0 385 940中闡述的，并以保藏號(hào)DSM5399保藏。
在用pZ1轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS瓊脂平板上(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)65:299-304)對(duì)卡那霉素的抗性鑒別轉(zhuǎn)化體。從3個(gè)轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并通過(guò)限制性分析檢測(cè)pZ1空白對(duì)照載體的存在與否。以此方式形成對(duì)照菌株黃色短桿菌DM368/pZ1。
在用pK18mobglyA’轉(zhuǎn)化之后，通過(guò)克隆的glyA的5’末端的同源重組，將質(zhì)粒整合入黃色短桿菌DM368-2的染色體中。將所得卡那霉素抗性克隆在含有15μg/ml卡那霉素和1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LBHIS-瓊脂平板上(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信(1989)65:299-304)加以鑒別。通過(guò)如實(shí)施例3中已述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用100ng黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’的染色體DNA作模板，檢測(cè)4個(gè)所得整合突變體中染色體中pK18mobglyA’的正確整合。以此方式形成菌株黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’,其中g(shù)lyA基因在tac啟動(dòng)子的控制下，此tac啟動(dòng)子可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)誘導(dǎo)。
實(shí)施例6測(cè)定菌株黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’中，由glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性如實(shí)施例4所述，獲得粗提物，以測(cè)定實(shí)施例5所述菌株黃色短桿菌DM368-2/pZ1和黃色短桿菌DM368-2::pK18mobglyA’中，由glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。如實(shí)施例4所述類似地進(jìn)行所得無(wú)細(xì)菌粗提物中蛋白質(zhì)測(cè)定及非連續(xù)酶測(cè)試，其中生成自蘇氨酸底物的甘氨酸被定量。
用蘇氨酸作底物的酶測(cè)試結(jié)果列于表3。
表3
實(shí)施例7用黃色短桿菌生產(chǎn)L-蘇氨酸為評(píng)價(jià)其蘇氨酸生成力，將實(shí)施例5中所述菌株黃色短桿菌DM368-2/pZ1和DM368-2::pK18mobglyA’在30℃，在100ml具有25μg卡那霉素/ml和100μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)的腦心浸液培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,美國(guó))中，預(yù)培養(yǎng)14小時(shí)。然后將細(xì)胞用0.9％(w/v)氯化鈉溶液沖洗一次，并用此懸液接種60ml CgⅫ培養(yǎng)基，以使OD600(在600nm的光密度)為0.5。此培養(yǎng)基與Keilhauer等所述培養(yǎng)基(細(xì)菌學(xué)雜志(1993)175:5593-5603)相同，但額外含有25μg卡那霉素/ml和0,10或100μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)。
在30℃，將此兩個(gè)菌株培養(yǎng)72小時(shí)。在48和72小時(shí)之后，取樣并短時(shí)離心除去細(xì)胞(用Heracus,Osterode，德國(guó)的Biofuge Pico離心機(jī)，以13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘)。
通過(guò)反相HPLC(Lindroth等，分析化學(xué)(1979)51:1167-1174)如實(shí)施例4所述，進(jìn)行培養(yǎng)基上清液中胞外氨基酸濃度的定量測(cè)定。通過(guò)與外部標(biāo)準(zhǔn)及作為額外內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的天冬酰胺相對(duì)比，計(jì)算蘇氨酸濃度。
結(jié)果列于表4。
表4
本發(fā)明有如下附圖
圖1質(zhì)粒pK18mobglyA’圖，長(zhǎng)度數(shù)據(jù)應(yīng)知為近似值所用縮寫和符號(hào)意義如下BamHⅠ解淀粉芽孢桿菌的限制性內(nèi)切酶BglⅡ枯草芽孢桿菌的限制性內(nèi)切酶BstEⅡ嗜熱脂肪芽孢桿菌的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ大腸桿菌的限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ大腸桿菌的限制性內(nèi)切酶HindⅢ流感嗜血桿菌的限制性內(nèi)切酶SacⅠ不產(chǎn)色鏈霉菌的限制性內(nèi)切酶kan卡那霉素抗性基因lacⅠq:tac啟動(dòng)子Ptac的阻抑物基因Ptactac啟動(dòng)子glyA’絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的5’部分glyA2-反向檢測(cè)整合的引物RSP檢測(cè)整合的反向標(biāo)準(zhǔn)引物序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>990200 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>438<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌 ATCC13032<220><221>N_區(qū)<222>(1)..(438)<223>5’glyA<400>1atgaccgatg cccaccaagc ggacgatgtc cgttaccagc cactgaacga gcttgatcct 60gaggtggctg ctgccatcgc tggggaactt gcccgtcaac gcgatacatt agagatgatc 120gcgtctgaga acttcgttcc ccgttctgtt ttgcaggcgc agggttctgt tcttaccaat 180aagtatgccg agggttaccc tggccgccgt tactacggtg gttgcgaaca agttgacatc 240attgaggatc ttgcacgtga tcgtgcgaag gctctcttcg gtgcagagtt cgccaatgtt 300cagcctcact ctggcgcaca ggctaatgct gctgtgctga tgactttggc tgagccaggc 360gacaagatca tgggtctgtc tttggctcat ggtggtcact tgacccacgg aatgaagttg 420aacttctccg gaaagctg 438<210>2<211>2000<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述lacⅠ-tac-5’glyA<220><221>基因<222>互補(bǔ)((6)..(1097))<223>lacⅠ<220><221>啟動(dòng)子<222>(1391)..(1434)<223>tac<220><221>N_區(qū)<222>(1562)..(1999)<223>5’glyA<400>2aattctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 60gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 120agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 180cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg 240atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 300cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 360agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 420atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 480ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 540gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 600tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 660acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 720atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 780ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 840atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 900agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 960gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 1020acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 1080ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 1140aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgcatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg 1200aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc 1260agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc 1320tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 1380aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 1440agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaaaagat atgaccatga ttacgccaag 1500cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcattcgtct tgtgaaaggt tagctgacct 1560gatgaccgat gcccaccaag cggacgatgt ccgttaccag ccactgaacg agcttgatcc 1620tgaggtggct gctgccatcg ctggggaact tgcccgtcaa cgcgatacat tagagatgat 1680cgcgtctgag aacttcgttc cccgttctgt tttgcaggcg cagggttctg ttcttaccaa 1740taagtatgcc gagggttacc ctggccgccg ttactacggt ggttgcgaac aagttgacat 1800cattgaggat cttgcacgtg atcgtgcgaa ggctctcttc ggtgcagagt tcgccaatgt 1860tcagcctcac tctggcgcac aggctaatgc tgctgtgctg atgactttgg ctgagccagg 1920cgacaagatc atgggtctgt ctttggctca tggtggtcac ttgacccacg gaatgaagtt 1980gaacttctcc ggaaagctgg 2000<210>3<211>2866<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述lacⅠ-tac-glyA<220><221>基因<222>互補(bǔ)((6)..(1097))<223>lacⅠ<220><221>啟動(dòng)子<222>(1391)..(1434)<223>tac<220><221>CDS<222>(1562)..(2863)<223>glyA<400>3aattctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 60gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 120agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 180cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg 240atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 300cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 360agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 420atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 480ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 540gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 600tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 660acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 720atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 780ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 840atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 900agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 960gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc 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權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，特征在于進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵所需生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌，該細(xì)菌中至少glyA基因是弱化的，b)濃縮培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中所需產(chǎn)物，和c)分離L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，特征在于使用的細(xì)菌中所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因是額外擴(kuò)增的。
3.權(quán)利要求1的方法，特征在于使用的細(xì)菌中降低所需L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分關(guān)閉。
4.權(quán)利要求1的方法，特征在于編碼glyA基因的多核苷酸的表達(dá)被降低。
5.權(quán)利要求1的方法，特征在于多核苷酸glyA編碼的多肽(酶蛋白)的催化性質(zhì)被降低。
6.權(quán)利要求1的方法，特征在于用通過(guò)載體pK18mobglyA’的整合誘變的方法實(shí)現(xiàn)弱化，此載體示于
圖1并保藏在大腸桿菌中，保藏號(hào)DSM13170。
7.權(quán)利要求1的方法，特征在于為生產(chǎn)L-蘇氨酸，發(fā)酵如下細(xì)菌，該細(xì)菌中選自以下一組的一或多個(gè)基因是同時(shí)過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增的7.1編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因，7.2編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，7.3編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，7.4編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，7.5編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因。
8.權(quán)利要求1的方法，特征在于為生產(chǎn)L-蘇氨酸，發(fā)酵如下細(xì)菌，該細(xì)菌中選自以下一組的一或多個(gè)基因是同時(shí)弱化的8.1編碼烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，8.2編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因。
9.前述一或多個(gè)權(quán)利要求的方法，特征在于使用谷氨酸棒桿菌的微生物。
10.其中g(shù)lyA基因是弱化的棒狀細(xì)菌。
11.載體pK19mobglyA’，示于
圖1并保藏在大腸桿菌中，保藏號(hào)DSM13170。
12.分離的多核苷酸，包括(ⅰ)示于SEQ ID NO.2的lacⅠ-tac-5’glyA單元的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，及任選地(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有義突變體。
13.分離的多核苷酸，包括(ⅰ)示于SEQ ID NO.3的lacⅠ-tac-glyA單元的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡(jiǎn)并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，及任選地(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有義突變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L－氨基酸的方法,其中進(jìn)行以下步驟:a)發(fā)酵所需生產(chǎn)L－氨基酸的棒狀細(xì)菌,該細(xì)菌中至少glyA基因是弱化的,特別是通過(guò)除去天然啟動(dòng)子而弱化的,b)濃縮培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中所需產(chǎn)物,和c)分離L－氨基酸,任選地所用細(xì)菌中所需L－氨基酸的生物合成途徑的其它基因是額外擴(kuò)增的,或所用細(xì)菌中降低所需L－氨基酸生成的代謝途徑至少被部分關(guān)閉。本發(fā)明還涉及l(fā)acI－tac－5’glyA或lacI－tac－glyA單元的核苷酸序列。
文檔編號(hào)C12N9/99GK1305009SQ0013403
公開(kāi)日2001年7月25日 申請(qǐng)日期2000年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月9日
發(fā)明者彼得拉·齊格勒, 洛塔爾·埃格林, 赫爾曼·扎姆, 格奧爾格·蒂爾巴赫, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司, 于利希研究中心有限公司