專利名稱：絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因?yàn)榘袠?biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及其用途，具體地說(shuō)涉及絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因?yàn)榘袠?biāo)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。
腫瘤分子生物學(xué)研究表明，腫瘤是由于基因異常引起的疾病。致病機(jī)理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及細(xì)胞周期的異常。腫瘤發(fā)病分子機(jī)理的進(jìn)一步闡明為腫瘤的基因治療提供了可靠的理論依據(jù)。近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)是腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。反義技術(shù)是近十幾年興起的生物高技術(shù)，用反義技術(shù)封閉和抑制特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互補(bǔ)寡聚核苷酸特異性抑制Rous肉瘤病毒的復(fù)制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表達(dá)的概念。ASODN是根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)原理能夠與mRNA的堿基對(duì)互補(bǔ)阻止其翻譯成蛋白質(zhì)的DNA。反義寡核苷酸具有定向合理設(shè)計(jì)，體內(nèi)外作用高效和能人工大規(guī)模合成等藥用特性，因而近年來(lái)成為治療病毒感染，腫瘤，及其它由于基因表達(dá)異常引起的疾病的一類潛在型藥物，其中腫瘤相關(guān)基因可作為反義藥物作用的靶標(biāo)。
本發(fā)明的目的是根據(jù)一種腫瘤相關(guān)基因絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因設(shè)計(jì)11條寡核苷酸序列(見表1)，采用PE公司產(chǎn)391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經(jīng)MicroPure II反向柱(Solid Phase Science)純化后，以此產(chǎn)物作為腫瘤的治療藥物。
表1 反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號(hào) 靶位(nt) 長(zhǎng)度(nt)特性 序列(5’-3’)11878-189619AGCAGCTATTAGGAGGCCTT21964-198320AACACTGCAGACATGGCACCG32062-208019ATAGAACCCACACCCGAACA418-3720ACTCCGCACCGCTCCGCTCCT538-5720AGACCTCGATCCGAGCAGAGC654-7320ACCGAAGCTGCGCTGCAGACC772-9120AACTGCAGCACTCATGCTCCC877-9620ACAGTCACTGCAGCACTCATG941-6020AGCAGACCTCGATCCGAGCAG10 45-6420ACGCTGCAGACCTCGATCCGA11 49-6820AGCTGCGCTGCAGACCTCGAT本發(fā)明的主要內(nèi)容是選取了Plk1基因作為靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評(píng)價(jià)。Plk1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，表達(dá)僅限于著絲粒和有絲分裂中期的細(xì)胞，主要參與紡錘體的形成和染色體的分配。Plk1mRNA的表達(dá)與細(xì)胞的有絲分裂能力和肺癌病人的預(yù)后有關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌中Plk1mRNA中等量表達(dá)的病人比那些高表達(dá)的病人5年生存率顯著升高。Plk1蛋白水平在肺癌，乳腺癌和幾種腫瘤細(xì)胞核中過(guò)高表達(dá)，與其它增殖和癌標(biāo)志相比Plk1對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤病人的預(yù)后和早期癌癥診斷更有意義，它的抑制物可抑制腫瘤生長(zhǎng)導(dǎo)致凋亡。
在針對(duì)Plk1基因的11條反義寡核苷酸中，9#的體外抑制細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)且具有持續(xù)性，在用藥后的4天內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率持續(xù)上升，第四天抑制率達(dá)到93％的峰值，至第5天開始緩慢下降，第六天降至78.35％。9#序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)由莖(4個(gè)堿基)-膨脹環(huán)(2個(gè)堿基)-莖(4個(gè)堿基)-發(fā)夾(4個(gè)堿基)-莖(4個(gè)堿基)-內(nèi)環(huán)-莖(2個(gè)堿基)組成(A＝5，T＝2，C＝7，G＝6)。
9#藥物對(duì)荷HepG2人肝細(xì)胞癌(接種的細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)/只)裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，成瘤率83.3％，抑瘤率是68.42％；這種藥物對(duì)裸鼠的體重及生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯影響，無(wú)肉眼可見的毒性。瘤組織的病理切片表明，用藥組瘤組織大片壞死，組織間有纖維化，瘤周多為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組以彌漫性點(diǎn)狀，片狀壞死為主，瘤周炎細(xì)胞浸潤(rùn)以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。
根據(jù)發(fā)明，發(fā)明中所涉及的寡核苷酸或其修飾物可用于治療肝癌。
根據(jù)發(fā)明，發(fā)明中針對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因治療腫瘤的優(yōu)選序列為7#序列。下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作詳細(xì)說(shuō)明


圖1為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上的增殖抑制率；圖2為反義寡核苷酸序列的優(yōu)化；圖3為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上作用時(shí)間的持續(xù)性；圖4為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤體積的抑制情況；圖5為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠體重的抑制情況；圖6為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤重量的影響。
實(shí)施例一體外抗腫瘤活性ASODN篩選和評(píng)價(jià)1材料和方法1.1反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成本研究選取了Plk1基因作為靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評(píng)價(jià)?；蛐蛄杏蒅enbank獲得，通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)引入RNAStructure 3.2分析軟件，選擇RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中膨脹環(huán)，內(nèi)環(huán)，發(fā)夾，多分支連接部等結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的區(qū)域作為反義藥物作用的靶點(diǎn)，針對(duì)Plk1mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了3條針對(duì)3’非編碼區(qū)的序列和5條針對(duì)5’非編碼區(qū)的序列1-8(具體序列見表1)。反義硫代寡聚核苷酸為無(wú)色粉末狀，合成后濃氨水55℃脫保護(hù)15小時(shí)，然后用反相柱(購(gòu)自solid phase sciense公司)層析純化。體外實(shí)驗(yàn)用無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基配制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用生理鹽水配制，保存于-20℃。1.2細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定人肝癌(HepG2)細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。將其用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃ ，5％CO2孵箱培養(yǎng)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×103細(xì)胞/0.2ml。待50-60％細(xì)胞融合后，在無(wú)血清狀態(tài)下，采用lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說(shuō)明書操作進(jìn)行硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染。每條硫代反義寡核苷酸設(shè)置3個(gè)濃度，分別為0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L.每個(gè)濃度3孔，每孔總體積為100μl，并設(shè)置細(xì)胞和脂質(zhì)體對(duì)照。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時(shí)，于培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加20μl MTS(Promega)，并繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘，于492nm測(cè)定光吸收，計(jì)算抑制率。1.3 9#作用持續(xù)時(shí)間測(cè)定HepG2細(xì)胞接種于96孔板(3000/孔)，待50-60％細(xì)胞融合后，轉(zhuǎn)染9#一次，終濃度為0.2μmol/L。分別于轉(zhuǎn)染后第1-6天，各取3孔細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況，觀察其作用持續(xù)時(shí)間。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1反義寡核苷酸作用靶位的選擇針對(duì)Plk1mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了3條針對(duì)3’非編碼區(qū)的序列和5條針對(duì)5’非編碼區(qū)的序列1-8(見表1)。
圖1所示，針對(duì)5’編碼區(qū)的5#序列在0.2μM時(shí)抑制率是59.1％，0.4μM時(shí)抑制率是75.5％，0.8μM時(shí)抑制率是90.7％。它的細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)。2.2反義寡核苷酸序列的優(yōu)化在反義寡核苷酸設(shè)計(jì)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有效的序列后，往往對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。觀察堿基的移動(dòng)對(duì)其作用的影響。因此我們以5#序列為中心進(jìn)行優(yōu)化，向其5’端，3’端移動(dòng)幾個(gè)堿基設(shè)計(jì)了3條反義寡核苷酸，在96孔板上評(píng)價(jià)體外對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，目的是篩選出更加有效的藥物。9#序列的抑制率高于其它3條序列。因此選擇9#序列為體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥物，從11條序列中篩選出了一條序列。9#的IC50是0.081μM。9#序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)由莖(4個(gè)堿基)-膨脹環(huán)(2個(gè)堿基)-莖(4個(gè)堿基)-發(fā)夾(4個(gè)堿基)-莖(4個(gè)堿基)-內(nèi)環(huán)-莖(2個(gè)堿基)組成(A＝5，T＝2，C＝7，G＝6)。2.3反義寡核苷酸作用的持續(xù)時(shí)間作用的持續(xù)時(shí)間不僅是評(píng)價(jià)反義核酸藥物的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)對(duì)于給藥方案具有重要的參考價(jià)值。圖3可以看出在肝癌細(xì)胞(HepG2)中，終濃度0.2μmol/L的9#脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染給藥1次后，1-4天抑制活性逐漸增加，第4天達(dá)到93％的峰值，然后緩慢下降，到第6天抑制率為78.3％。實(shí)施例二動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性ASODN的評(píng)價(jià)1材料和方法1.1裸鼠的飼養(yǎng)，移植瘤的接種和藥物處理Balb/c(nu/nu)裸鼠18-22克，雌性由北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。將Balb/c(nu/nu)裸鼠飼養(yǎng)于二級(jí)動(dòng)物房的層流柜中，自由攝取食物和水，大量擴(kuò)增HepG2腫瘤細(xì)胞，用0.2％胰酶溶液消化和收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.5×107個(gè)細(xì)胞/毫升，于每個(gè)裸鼠左后肢腋窩皮下接種0.2毫升。接種細(xì)胞后第5日，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并可觸及后，給裸鼠分為兩組，給藥組每日腹腔注射藥物一次0.1毫升的9#，(25mg/kg)，對(duì)照組給予相應(yīng)量的生理鹽水，每周測(cè)量?jī)纱文[瘤的重量觀察記錄腫瘤的大小(用游標(biāo)卡尺)，按下列公式計(jì)算腫瘤的相對(duì)體積V＝L×W2×1/2，式中V為腫瘤體積(mm3)；L、W分別為瘤體最長(zhǎng)和最短的兩個(gè)徑(mm)。待裸鼠行動(dòng)困難時(shí)，處死。用藥共28天，稱量瘤重量制備病理切片。1.2光鏡病理檢查標(biāo)本的制備標(biāo)本在10％福爾馬林溶液固定72小時(shí)，經(jīng)石蠟包埋切片，H-E染色，在光鏡下閱片。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制情況荷瘤裸鼠在接種腫瘤的第三天即可見其生長(zhǎng)，第五天可觸及腫瘤并開始用藥，在用藥的四天內(nèi)用藥組與對(duì)照組相比，腫瘤體積無(wú)差異，第八天時(shí)出現(xiàn)差別，第15天后兩者差別顯著，從圖4中可見對(duì)照組體積增長(zhǎng)迅速而用藥組體積增長(zhǎng)緩慢。9#藥物使瘤體積倍增9.02倍，而對(duì)照組瘤體積倍增了81.55倍。從用藥期間裸鼠體重的變化曲線看，所有裸鼠體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，作方差分析表明9#組與對(duì)照組相比有顯著性差異，9#組抑制率達(dá)68.42％。腫瘤的病理切片顯示兩組腫瘤均有變性和壞死，程度以用藥組嚴(yán)重，9#組腫瘤中心部有囊腔形成，炎細(xì)胞浸潤(rùn)用藥組以淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞為主，對(duì)照組以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，兩組均有部分裸鼠呈現(xiàn)纖維組織增生。
權(quán)利要求
1.與絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因5’和3’非編碼區(qū)及翻譯起始區(qū)互補(bǔ)、長(zhǎng)度為10-30個(gè)堿基并包含下列序列的寡核苷酸(序列為5’到3’)1〕GCAGCTATTAGGAGGCCTT；2〕ACACTGCAGACATGGCACCG；3〕TAGAACCCACACCCGAACA；4〕CTCCGCACCGCTCCGCTCCT；5〕GACCTCGATCCGAGCAGAGC；6〕CCGAAGCTGCGCTGCAGACC；7〕ACTGCAGCACTCATGCTCCC；8〕CAGTCACTGCAGCACTCATG；9〕GCAGACCTCGATCCGAGCAG；10〕CGCTGCAGACCTCGATCCGA或11〕GCTGCGCTGCAGACCTCGAT。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，其特征在于含下列序列5〕GACCTCGATCCGAGCAGAGC；6〕CCGAAGCTGCGCTGCAGACC；8〕CAGTCACTGCAGCACTCATG或9〕GCAGACCTCGATCCGAGCAG。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，經(jīng)化學(xué)修飾后在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及用途,具體地說(shuō)是根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸激酶Plk1基因設(shè)計(jì)并制備的反義寡核苷酸。采用人肝癌(HepG2)細(xì)胞株及Balb/c(nu/nu)裸鼠接種肝癌細(xì)胞為模型,對(duì)所設(shè)計(jì)、制備的11條反義寡核苷酸進(jìn)行篩選及評(píng)價(jià)。體外實(shí)驗(yàn)可有效地抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng),且呈劑量依賴性關(guān)系;在荷瘤裸鼠模型中亦有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。故本發(fā)明是針對(duì)腫瘤的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其作為治療腫瘤、減少腫瘤及其相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1358731SQ0013453
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月11日
發(fā)明者王升啟, 林莉, 管偉, 王小紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所