專利名稱：編碼glk基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼glk基因的核苷酸序列，和用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中g(shù)lk基因是增強(qiáng)的。
L-氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，但特別用于動物營養(yǎng)。
已知L-氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)。由于氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)一半胱氨酸有抗性，或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如L-賴氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒狀菌生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良。其通過擴(kuò)增L-氨基酸生物合成基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。這方面的綜述文章見Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，Benjamin Cummings，英國倫敦，1985,115-142),Hilliger(生物技術(shù)2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Soloman(生物技術(shù)的關(guān)鍵回顧15,73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)協(xié)會年報(bào)782,25-39(1996))。
本發(fā)明人目的在于為改良L-氨基酸特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)而提供新措施。
L-氨基酸特別是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。因此提供生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。
當(dāng)下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時(shí)，不僅指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了衍生自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列。
a)與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸，d)含有a)、b)或c)的多核酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了在棒狀細(xì)菌中能復(fù)制的優(yōu)選重組DNA。
本發(fā)明還提供了是RNA的多核苷酸。
本發(fā)明另外還提供了如權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸優(yōu)選是能復(fù)制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了含有權(quán)利要求1的多肽的載體及含有所述載體作為宿主細(xì)胞的棒狀細(xì)菌。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其基本上包括一種多核苷酸序列，其可通過用含有相應(yīng)于SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探針雜交相應(yīng)的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述文庫含有具有相應(yīng)于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼葡糖激酶的全長cDNA，以及分離與葡糖激酶基因具有高度相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼葡糖激酶的基因的DNA的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少30個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)，特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)堿基，具有至少40個(gè)或50個(gè)核苷酸的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽，特別是具有葡糖激酶生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO:2的多肽至少80％，特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，在該棒狀細(xì)菌中編碼glk基因的核苷酸序列是增強(qiáng)的，尤其是過表達(dá)的。
文中術(shù)語“增強(qiáng)”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的-或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，用強(qiáng)啟動子或用編碼高活性相應(yīng)的酶的基因，及如果需要組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸尤其是L-賴氨酸。此微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨酸棒桿菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecolaATCC17965黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體和/或菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715本發(fā)明已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼葡糖激酶(EC2.7.1.2.)的新glk基因。
為了分離谷氨酸棒桿菌的glk基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chemie,Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細(xì)胞50,495-508(1987))在入載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252:255-265,1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美國科學(xué)院院報(bào)84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。Borrnann等(分子微生物學(xué)6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19:259-268)。合適的宿主尤其限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學(xué)院院報(bào)7(1990)4645-4649)所述。借助于粘?？寺〉拈LDNA片段隨后可亞克隆并用適于測序的通用載體測序，如Sanger等(美國科學(xué)院院報(bào)74:5463-5467,1977)所述。
以此方式可獲得編碼glk基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本發(fā)明的一部分。用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得glk基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
通過遺傳密碼簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分，另外，保守氨基酸置換如用丙氨酸置換蛋白質(zhì)中甘氨酸，或用谷氨酸置換蛋白質(zhì)中天冬氨酸，本領(lǐng)域已知是有義突變，其不引起蛋白質(zhì)任何功能的改變，即是中性的。另外已知蛋白質(zhì)N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169:751-757(1987)),O’Regan等(基因77:237-251(1989)),Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技術(shù)6:1321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ ID NO:2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分，這種寡核苷酸典型地具有至少15個(gè)核苷酸的長度。
通過雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國際雜志(1991)41:255-260)。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)參見Gait的手冊寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischen Verlag,Heiclelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在glk基因過表達(dá)后，棒狀細(xì)菌以改良方式生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸。
為獲得過表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式工作。通過可誘導(dǎo)啟動子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。通過目的在于延長mRNA壽命的措施，也可改良表達(dá)。通過防止酶蛋白質(zhì)的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增，或者，通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9,84-87(1991)),Reinscheid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60,126-132(1994)),LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175,1001-1007(1993)),專利申請WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物學(xué)綜述60:512-538(1996))及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，本發(fā)明的glk基因通過質(zhì)粒被過表達(dá)。
適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體是在棒狀細(xì)菌中能復(fù)制的質(zhì)粒。一些已知質(zhì)粒載體例如pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64:549-554),pEKEx1(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519,pBL1或pGA1的。其它質(zhì)粒載體例如基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的質(zhì)粒載體可以相同方式使用。
也可使用利用其通過整合入染色體擴(kuò)增基因的那些質(zhì)粒載體，例如已由Reinscheid等所述(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60,126-132(1994))用于復(fù)制和/或擴(kuò)增hom-thrB-操縱子的質(zhì)粒載體。在此方法中，全長基因在能在宿主(典型地為大腸桿菌)而不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體中克隆，可提及的適當(dāng)載體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI，美國)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學(xué)雜志269:32678-84；美國專利5,487,993),pCRBlunt(Firma有限公司，Groningen，愛爾蘭；Bemard等，分子生物學(xué)雜志234:534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志173:4510-4516)。然后將包括待擴(kuò)增基因的質(zhì)粒載體通過接合或轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移入所需谷氨酸棒桿菌菌株中。接合方法例如由Schafer等所述(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60,756-759(1994))。轉(zhuǎn)化方法例如由Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)及生物技術(shù)29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7,1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物學(xué)通信123,343-347(1994))所述。在通過交換同源重組之后，所得菌株包括至少2個(gè)拷貝的相關(guān)基因。
本發(fā)明因此還提供了L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其中使用用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼葡糖激酶的核苷酸序列。
另外，除增強(qiáng)glk基因之外，增強(qiáng)所需L-氨基酸生物合成途徑的其它基因，從而相關(guān)生物合成途徑，糖酵解，添補(bǔ)反應(yīng)，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶是過表達(dá)的，這對L-氨基酸的生產(chǎn)是有益的。
因此，為生產(chǎn)L-賴氨酸，例如以下基因可被同時(shí)過表達(dá)·編碼二氫-2,6-吡啶二羧酶合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學(xué)224:317-324)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174:6076-6086)，或·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174:6076-6086)，或·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikamanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174:6076-6086)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174:6076-6086)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學(xué)雜志254,395-403(1998))，或·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。
另外，除glk基因之外，同時(shí)弱化以下基因?qū)-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸羧化酶的pck基因〔DE19950409.1；DSM13047〕和/或·編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US09/396,478；DSM12969)。
除過表達(dá)glk基因之外，排除非所需二級反應(yīng)對L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或在分批方法(分批培養(yǎng))，或在補(bǔ)料分批或重復(fù)補(bǔ)料分批法中分批培養(yǎng)以生產(chǎn)L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸。已知培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechink l.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik)(Gustav Fischer VerlagStuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und pepriphereEinrichtungen(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D.C.USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿幔姿岫溻浕蛄姿釟涠?，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶减タ捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃-45℃，優(yōu)選25℃-40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至賴氨酸形成最大量。此目的通常在10-160小時(shí)范圍達(dá)到。
本發(fā)明還提供了發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、尤其是L-賴氨酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌，其中至少編碼葡糖激酶的基因是增強(qiáng)的，尤其是過表達(dá)的。
b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L-氨基酸，及c)分離L-氨基酸。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)如Speckman等〔分析化學(xué)，30(1958),1190〕所述茚三酮衍生化作用進(jìn)行。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵制備L-賴氨酸。
本發(fā)明借助于以下實(shí)施例得以更詳細(xì)闡述。
實(shí)施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸?。
如Tauch等(1995，質(zhì)粒33:168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AⅠ，編碼號27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(LaJolla,USA，產(chǎn)品描述Super Cos1粘粒載體試劑盒，編碼號251301)的粘粒載體SuperCos1(Wahl等(1987)美國科學(xué)院院報(bào)84:2160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaⅠ，編碼27-0948-02)酶切，并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA片段混合，并用T4 DNA連接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用GigapackⅡ XL包裝提取物(Stratagene,La Jolla,USA，產(chǎn)品描述GigapackⅡ XL包裝提取物，編碼200217)包裝進(jìn)噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，將細(xì)胞置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等，(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫的感染和滴定。細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1:190)上鋪板，在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實(shí)施例2glk基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106,Qiagen,Hilden，德國)，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離各個(gè)菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AⅠ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021,Qiagen,Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物學(xué)通信，123:343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant,1990,美國科學(xué)院院報(bào)87:4645-4649)，并在含有50μg/ml zeocin的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1:190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot9600(產(chǎn)品號900200,Qiagen,Hilden，德國)進(jìn)行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美國科學(xué)院院報(bào)74:5463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號403044,Witerstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒?！痹趲в匈徸訮E應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(29:1)(產(chǎn)品號A124.1,Roth,Karlsrwhe，德國)中進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
原始數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0處理，pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)制備計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析，同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)，對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，對該核苷酸序列的分析顯示一969堿基對的開放讀框，其被稱為glk基因，glk基因編碼323個(gè)氨基酸的多肽。
實(shí)施例3增強(qiáng)谷氨酸棒桿菌的glk基因的穿梭載體pEC-K18mob2glkexp的構(gòu)建3.1克隆glk基因根據(jù)Eikmanns等的方法(微生物學(xué)140:1817-1828(1994))分離菌株ATCC13032的染色體DNA?；趯?shí)施例2中已知的谷氨酸棒桿菌的glk基因的序列，選擇以下寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)glk-ex1:5’ACT GAC GTG AGC CAG AAC3’glk-ex2:5’GAT CTA TCT AGA CAC CTA GTT GGC TTCCAC3’通過ARK生物系統(tǒng)科學(xué)有限公司(Darmstadt，德國)合成所列引物，并根據(jù)Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方法及應(yīng)用指導(dǎo)，1990，科學(xué)出版社)，用Roche Diagnostics GmbH(曼海姆，德國)的Pwo聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，引物使攜帶glk基因的1.45kb大小的DNA片段擴(kuò)增，此片段攜帶具有潛在啟動子區(qū)的glk基因。擴(kuò)增的DNA片段的DNA序列通過測序檢驗(yàn)。
3.2大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2的構(gòu)建根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體。此載體包括含有復(fù)制效應(yīng)子per的質(zhì)粒pGA1的復(fù)制起點(diǎn)rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，細(xì)菌學(xué)雜志179,1525-1532(1997))，賦予卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5的aph(3’)-Ⅱa基因(Beck等，基因19,327-336(1982))，質(zhì)粒pMB1的復(fù)制區(qū)oriⅤ(Sutcliffe，定量生物學(xué)冷泉港研討會43,77-90(1979))，含有l(wèi)ac啟動子和多克隆位點(diǎn)(mcs)的LacZα基因片段(Norrander,J.M.等，基因26,101-106(1983))以及質(zhì)粒RP4的mob區(qū)(Simon等，生物/技術(shù)1:784-791(1983))。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α中(Hanahan,DNA克隆實(shí)用方法，第1卷，IRL出版社，牛津，華盛頓DC，美國)。通過將轉(zhuǎn)化體分批鋪板于已補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，2ndEd，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，N.Y.)上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。用Qiagen的QIA prepSpin微量制備試劑盒，從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切，隨后瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)進(jìn)行檢驗(yàn)。此質(zhì)粒被稱為pEC-K18mob2，并如


圖1所示。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)·谷氨酸棒桿菌DSM5715/pEC-K18mob2，保藏號DSM13245。
3.3大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2中g(shù)lk的克隆實(shí)施例3.2中所述的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2用作載體。此質(zhì)粒的DNA用限制性內(nèi)切酶Ecl136Ⅱ完全酶切，然后用蝦堿磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德國，產(chǎn)品描述SAP，產(chǎn)品號No.1758250)去磷酸化。
如實(shí)施例3.1所述獲得的glk片段與制備的載體pEC-K18mob2混合，并用T4-DNA-連接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼No.27-0870-04)處理。連接物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株，DH5αmcr(Grant,1990，美國科學(xué)院院報(bào)，87:4645-4649)中。通過將轉(zhuǎn)化體鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學(xué)，1:190)上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。重組的各個(gè)細(xì)胞在37℃保溫過夜后選擇。用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106,Qiagen,Hilden，德國)根據(jù)廠商指導(dǎo)從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，以通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒，所得質(zhì)粒被稱為pEC-K18mob2glkexp，并示于圖2。
實(shí)施例4用質(zhì)粒pEC-K18mob2glkexp轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌菌株RES167通過由Liebl等所述電穿孔法(FEMS微生物學(xué)通信，53:299-303(1989))，用質(zhì)粒pEC-K18mob2glkexp轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌RES167(Schafer,A等，細(xì)菌學(xué)雜志176:7309-731(1994))。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-瓊脂，且已補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。在33℃培養(yǎng)二天。
通過通用方法(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)，144:915-927(1998)從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，并經(jīng)隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒。所得菌株被稱為谷氨酸棱桿菌RES167/pEC-K18mob2glkexp。
實(shí)施例5賴氨酸的生產(chǎn)實(shí)施例4中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株RES167/pEC-K18mob2glkexp在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
為此，首先在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂平板(具有25mg/l卡那霉素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。用此瓊脂平板培養(yǎng)物接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)，完全培養(yǎng)基CgⅢ用作預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基CgⅢ NaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖 2％(w/v)(單獨(dú)高壓滅菌)
pH調(diào)節(jié)為7.4向此培養(yǎng)基中加入卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33C以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物24小時(shí)。用此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始光密度OD(測量波長660nm)是0.05。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)基。培養(yǎng)基MMCSL 5g/lMOPS20g/l(嗎啉代丙磺酸)葡萄糖 50g/l(單獨(dú)高壓滅菌)(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素 0.3mg/l(過濾滅菌)硫胺素·HCl 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL,MOPS和鹽溶液調(diào)節(jié)至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入卡那霉素(25mg/l)。在33C和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)測定在660nm測量波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測栓后衍生化而確定形成的賴氨酸量。
所得結(jié)果示于表1。
表1
本發(fā)明具有如下附圖
圖1質(zhì)粒pEC-K18mob2圖譜圖2質(zhì)粒pEC-K18mob2glkexp圖譜圖中縮寫和符號含義如下perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因oriVpMB1的ColE1復(fù)制起點(diǎn)rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒復(fù)制區(qū)RP4mob:RP4移動位點(diǎn)Kan卡那霉素抗性基因glk谷氨酸棒桿菌的glk基因EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)HindⅢ限制酶HindⅢ的酶切位點(diǎn)Ecl186Ⅱ限制酶Ecl186Ⅱ的酶切位點(diǎn)序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司<120>編碼gl k基因的新核苷酸序列<130>990177ET<140><141><160>2<170>PatentIr Ver.2.1<210>1<211>1540<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(461).(1429)<400>1aaattccttg ggcgccttga atatcaagat atgatcaaca cgcttgccgc cgcagatatt 60ttcgcgatgc cagcgcgcac ccgcggtggc ggacttgatg ttgaaggctt gggcattgtc 120tatctcgagg caaaagcctg cggagtgccg gtgatagccg gcacctctgg cggcgcgcca 180gagacggtga ctccggcaac tggcctggtt gtggaggggt cggacgtcga taagctgtct 240gagcttttaa ttgagcttct cgacgatccg atccgccgcg ccgcgatggg cgctgcaggt 300agggcgcatg tggaggccga atggtcgtgg gaaatcatgg gggagcggtt gaccaatatt 360ttgcagagtg aaccacgatg atggttggac agctgttgat agctatactt tgaaagatta 420aattcaccta aatcctgtgt agaacgcgag gggcactctt atg cca caa aaa ccg 475Met Pro Gln Lys Pro1 5gcc agt ttc gcg gtg ggc ttt gac atc ggc ggc acc aac atg cga gcc 523Ala Ser Phe Ala Val Gly Phe Asp Ile Gly Gly Thr Asn Met Arg Ala10 15 20ggg ctt gtc gac gaa tcc ggg cgc atc gtg acc agt ttg tcg gcg ccg 571Gly Leu Val Asp Glu Ser Gly Arg Ile Val Thr Ser Leu Ser Ala Pro25 30 35tcg ccg cgc acg acg cag gca atg gaa cag ggg att ttt gat cta gtc 619Ser Pro Arg Thr Thr Gln Ala Met Glu Gln Gly Ile Phe Asp Leu Val40 45 50gaa cag ctc aag gcc gaa tac ccg gtt ggt gct gtg gga ctt gcc gtc 667Glu Gln Leu lys Ala Glu Tyr Pro Val Gly Ala Val Gly Leu Ala Val55 60 65gcg gga ttt ttg gat cct gag tgc gag gtt gtt cga ttt gcc ccg cac715Ala Gly Phe Leu Asp Pro Glu Cys Glu Val Val Arg Phe Ala Pro His70 75 80 85ctt cct tgg cgc gat gag cca gtg cgt gaa aag ttg gaa aac ctt ttg763Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Val Arg Glu Lys Leu Glu Asn Leu Leu90 95 100ggc ctg cct gtt cgt ttg gaa cat gat gcc aac tca gca gcg tgg ggt811Gly Leu Pro Val Arg Leu Glu His Asp Ala Asn Ser Ala Ala Trp Gly105 110 115gag cat cgt ttt ggt gca gct 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Phe Ala Val Gly Phe Asp Ile Gly Gly1 5 10 15Thr Asn Met Arg Ala Gly Leu Val Asp Glu Ser Gly Arg Ile Val Thr20 25 30Ser Leu Ser Ala Pro Ser Pro Arg Thr Thr Gln Ala Met Glu Gln Gly35 40 45Ile Phe Asp Leu Val Glu Gln Leu Lys Ala Glu Tyr Pro Val Gly Ala50 55 60Val Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Asp Pro Glu Cys Glu Val Val65 70 75 80Arg Phe Ala Pro His Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Val Arg Glu Lys85 90 95Leu Glu Asn Leu Leu Gly Leu Pro Val Arg Leu Glu His Asp Ala Asn100 105 1l0Ser Ala Ala Trp Gly Glu His Arg Phe Gly Ala Ala Gln Gly Ala Asp115 120 125Asn Trp Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Gly Ile Gly Ala Ala Leu Ile130 135 140Glu Lys Gly Glu Ile Tyr Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Phe145 150 155 160Gly His Leu Arg Val Val Arg Gly Gly Arg Ala Cys Ala Cys Gly Lys165 170 175Glu Gly Cys Leu Glu Arg Tyr Cys Ser Gly Thr Ala Leu Val Tyr Thr180 185 190Ala Arg Glu Leu Ala Ser His Gly Ser Phe Arg Asn Ser Gly Leu Phe195 200 205Asp Lys Ile Lys Ala Asp Pro Asn Ser Ile Asn Gly Lys Thr Ile Thr210 215 220Ala Ala Ala Arg Gln Glu Asp Pro Leu Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp225 230 235 240Phe Ser Glu Trp Leu Gly Glu Thr Leu Ala Ile Ile Ala Asp Val Leu245 250 255Asp Pro Gly Met Ile Ile Iie Gly Gly Gly Leu Ser Asn Ala Ala Asp260 265 270Leu Tyr Leu Asp Arg Ser Val Asn His Tyr Ser Thr Arg Iie Val Gly275 280 285Ala Gly Tyr Arg Pro Leu Ala Arg Val Ala Thr Ala Gln Leu Gly Ala290 295 300Asp Ala Gly Met Iie Gly Val Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ser Val Val305 310 315 320Glu Ala Asn
權(quán)利要求
1.來自谷氨酸棒桿菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸；b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選重組的DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.如權(quán)利要求2所述的能復(fù)制的DNA，含有(ⅰ)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
5.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸序列，其編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
6.含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列的載體。
7.含有如權(quán)利要求6所述的載體的棒狀細(xì)菌。
8.經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀細(xì)菌，其中至少編碼葡糖激酶的基因是增強(qiáng)的，尤其是過表達(dá)的；b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中L-氨基酸；及c)分離L-氨基酸。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用的細(xì)菌中所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因被額外增強(qiáng)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用的細(xì)菌中，降低L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分關(guān)閉。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使用用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所述載體攜帶編碼葡糖激酶的基因的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求8-11的任一項(xiàng)方法，其中使用產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因是同時(shí)過表達(dá)的。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因是同時(shí)過表達(dá)的。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因是同時(shí)過表達(dá)的。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因是同時(shí)過表達(dá)的。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因是同時(shí)過表達(dá)的。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因是同時(shí)過表達(dá)的。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因是同時(shí)過表達(dá)的。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因是同時(shí)過表達(dá)的。
21.如權(quán)利要求10所述的方法，其中編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因是同時(shí)弱化的。
22.如權(quán)利要求10所述的方法，其中編碼烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因是同時(shí)弱化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其包括選自如下一組的多核苷酸序列:a)與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明還涉及通過增強(qiáng)編碼葡糖激酶的glk基因發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法。
文檔編號C12N9/02GK1305000SQ00134610
公開日2001年7月25日 申請日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月2日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請人:德古薩－于爾斯股份公司